Name: Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin fare B hücre gelişiminin akış sitometrik karakterizasyonunu periton, dalak ve kemik iliği dokularında. Bu yöntem genetik olarak modifiye edilmiş farelerin fenotiplenmesi için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matthew Sleeman'a makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Regeneron'daki Vivarium Operations and Flow Cytometry Core bölümlerine de bu araştırmayı desteklediğimiz için teşekkür ederiz.

Tüm fare çalışmaları Regeneron'un Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından denetlendi ve onaylandı. Deney, Jackson Laboratuvarları'ndan üç C57BL/6J dişi fareden (17 haftalık) dokular üzerinde yapıldı. İdeal konsantrasyonu belirlemek için deneye başlamadan önce tüm antikorları titratın. Tek renk telafisi için kompanzasyon boncukları kullanırken, numunelerinizden daha parlak veya parlak lekeler aldıklarından emin olun. Tüm tamponları, antikorları ve hücreleri buzda veya 4 °C'de tutun. Canlılık boyasının eklenmesinden sonra, tüm adımları ve inkübasyonları 4°C'de düşük ışıkta veya karanlıkta gerçekleştirin.
1. Periton hücre hasadı ve tek hücre izolasyonu
<ol><li>Fareyi CO2 kullanarak veya onaylanmış protokole göre ötenazi.
</li>
	<li>Fareyi sırtına yatırın,% 70 etanol ile püskürtün ve peritonları kesmemeye dikkat derek dış karın derisini makasla kesin.</li>
	<li>25 kalibrelik iğne ile donatılmış 3 mL şırınga ile periton boşluğuna 3 mL buz gibi yıkama tamponu (DPBS'de %0,5 sığır serum albümini (BSA) enjekte edin.</li>
	<li>Peritona parmak uçlarıyla hafifçe masaj yapın.</li>
	<li>1.3 ve 1.4.</li>
	<li>Organları ve yağları önlemek için dikkatli olarak peritondan 18 G iğne ile donatılmış 3 mL şırınga yerleştirin.</li>
	<li>Şimdi periton hücreleri içeren yıkama tamponu çıkarın ve buz üzerinde 15 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>1.3 ve 1.4.</li>
	<li>Cımbızla tutarken peritonda küçük bir delik açın.</li>
	<li>Deliğe tek kullanımlık bir transfer pipet yerleştirin ve kalan yıkama tamponu toplayın, bir kez daha yağ ve organlardan kaçının.</li>
	<li>Toplanan periton hücrelerini buz üzerindeki 15 mL konik tüpe aktarın. NOT: Kan kirlenmesi belirginse numuneyi atın.</li>
	<li>Dalak ve kemik ekstraksiyonu tamamlanana kadar hücreleri buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini 1 mL yıkama tamponunda yeniden dirildi.</li>
	<li>Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.</li>
</ol>2. Dalak hasadı ve tek hücre izolasyonu
<ol><li>Fareyi karnına yatırın ve temiz makas kullanarak sol arka taraftaki peritonları kesin. Dalağını kesin, yağ ve bağ dokusunu çıkarın.</li>
	<li>Dalağını buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kemik çıkarma işlemi tamamlanana kadar dalağını buzda kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Dalağını 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu ile otomatik ayrışma tüpüne taşıyın. Tüpü doku ayrıştırıcı cihazına yerleştirin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 60 sn ayrışın. NOT: Yıkama tamponunda buzlu cam slaytlar arasında parçalama gibi tek hücreli dalak süspansiyonları elde etmek için diğer rutin yöntemlerin kullanılmasına da izin verilir. Başka bir ayrışma yöntemi kullanılırsa, 2.5 adımına devam etmeden önce santrifüjleme, aspirasyon ve ardından 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda resüspensiyon ile ayrışma izleyin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.</li>
	<li>Temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini 5 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.</li>
	<li>Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.</li>
</ol>3. BM hasadı ve tek hücre izolasyonu
<ol><li>Cildi fare gövdesinin alt yarısından çıkarın. Bacaktan fazla kası kesin. Uyluk kemiğini kesmemeye dikkat derek tüm bacağı makasla çıkarın. Kalan kas, yağ ve ayakları çıkararak uyluk kemiğini ve kaval kemiğini temizleyin.</li>
	<li>Kemikleri buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün tabanını delin ve bacak kemiklerinin çıkıntı yapmaması için yeterince küçük bir delik bırakın. 0,5 mL'lik tüpü temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Femur ve kaval kemiği proksimal ucunu dizine kesin ve kesik uçları 0,5 mL'lik tüpe bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 2 dakika boyunca 6.780 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Hücre peletini 1 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda yeniden dirildi ve ek 3 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini 3 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.</li>
	<li>Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz 15 mL konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.</li>
</ol>4. Hücreleri lekele ve telafi hazırla
<ol><li>Her hayvandan 96 kuyu U alt plakasına kadar her hücre türünden Aliquot 106 hücresi.<ol>
<li>Tam leke, floresan eksi bir (FMO), el değmemiş ve son olarak kullanılan her florofor için isteğe bağlı tek renk telafisi de dahil olmak üzere tüm numuneler ve kontroller için yeterli kuyuları ekleyin.</li>
		<li>BM olgunlaşma paneli ve dalak olgunlaşma paneli için, her tam leke örneği için kuyu başına 106 hücre olmak üzere 2 kuyuya aliquot hücreleri. Tek renk telafisi canlılık kontrolleri için, tek tek kuyulara her hücre türünden 2 x 106 hücre ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin. Bu adım, amin reaktif canlılık boyası ile lekelemeden önce proteini çıkarmak için önemlidir.</li>
	<li>4.2 ve 4.3.</li>
	<li>4.2. adımı yineleyin.</li>
	<li>DPBS'de 1:1.000 seyreltilmiş 100 μL canlılık boyasında hücreleri yeniden biriktirin. NOT: Hücreleri tek renk telafisi için kullanıyorsanız, bu kuyulara canlılık boyası eklemeyin.<ol>
<li>Her leke seti için, tamamen yersiz bir örnek ve ihtiyacınız olabilecek diğer kontroller için birkaç lekesiz kuyu bırakın.</li>
		<li>Her leke seti için, uygulanabilirlik FDO kontrolü için ek bir bozulmamış kuyu bırakın.</li>
		<li>Tek renkli canlılık telafisi kontrolleri için: 4.1 adımda aliquoted 2 x 106 hücrelerini 200 μL seyreltilmiş canlılık boyasında yeniden biriktirin. 100 μL hücreyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne, ısı hücrelerini 65 °C'de 5 dakika ısıtın ve 100 μL ısıdan ölen hücreleri kalan 100 μL canlı hücrelerle orijinal kuyuya geri aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de kuluçkaya yatır, ışıktan korunarak 30 dakika boyunca.</li>
	<li>Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin.</li>
	<li>4.8 ve 4.9.</li>
	<li>4.8. adımı yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri 50 μL Fc bloğunda 1:50 (son konsantrasyon=10 μg/mL) leke tamponunda (DPBS'de %0,5 BSA [vol/vol]) yeniden kullanın.<ol>
<li>Periton hücreleri için - ayrıca spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için 5 μL monosit bloker ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de, ışıktan korunarak 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>106 hücre başına 100 μl'lik son hacim için leke tamponunda tam leke ana karışımları ve IPO'lar hazırlayın. Antikor listeleri için Tablo 1-Tablo 4'e bakın. NOT: IPO'lar, biri hariç tüm antikorlar bir leke setine dahil sunularak yapılır. Bir leke kümesindeki her antikor için bir FDO hazırlayın. Bir leke seti birden fazla parlak boya içerdiğinde, numune başına leke tamponu için 50 μL parlak leke tamponu değiştirin</li>
	<li>Fc bloğunu çıkarmadan, seçilen kuyulara 100 μL tam leke karışımları ve IPO'lar ekleyin.</li>
	<li>Bir leke kümesindeki her antikor için tek renk kompanzasyon kontrolleri hazırlayın.<ol>
<li>Kompanzasyon boncukları kullanılıyorsa, üretim kullanım talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Hücreleri kullanıyorsanız, daha önce 4.6.1 adımında canlılık boyası olmadan ayrılmış 106 hücreye 100 μL leke tamponunda titratlı antikor ekleyin. Numunedeki tüm hücreler belirli bir işaretleyici için pozitifse, akış sitometresinde kompanzasyon verileri elde edilirken kullanılacak lekesiz hücreleri bir kenara bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.</li>
	<li>Hücreleri ve boncukları 200 μL leke tamponunda yeniden biriktirin.</li>
	<li>4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>4.18.</li>
	<li>Analiz için numuneleri 48 saat içinde sabitlemek için, DPBS'de %2 paraformaldehitin 200 μL'sinde hücreleri ve boncukları yeniden biriktirin. DİkKAT: Parafomaldehit ciddi bir sağlık tehlikesidir ve yanıcıdır. Kullanmadan önce Safty Veri Sayfası'na bakın.</li>
	<li>Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>Temiz bir 96 kuyu U-alt plaka üzerine bir filtre plakası yerleştirin. Çoklu pipet kullanarak, her numuneyi filtre plakasının bir kuyusuna aktarın.</li>
	<li>Filtre plakasını santrifüjleyin-96 kuyu U-alt plaka kurulumu 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca. Filtre plakasını çıkarın ve kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.</li>
	<li>BM ve dalak olgunlaşma panelleri için tamamen lekeli hücreleri 100 μL leke tamponunda yeniden biriktirin. Her hayvan için 2 kuyuyu 1 kuyuda birleştirin. Kalan panelleri, IPO'ları ve kontrolleri 200 μL leke tamponunda yeniden dirileyin.</li>
	<li>Sabit hücreleri ve boncukları 4 °C'de kuluçkaya yatırın, ışıktan bir gecede korunmaktadır.</li>
</ol>5. Akış sitometrik veri toplama
<ol><li>Üretici talimatlarına göre akış sitometresini başlatın ve QC' ye edin.</li>
	<li>Her panele özgü şablonu yükleyin.</li>
	<li>Verileri kaydetmeden önce, her örnek için tüm olayların ölçek üzerinde olduğundan ve nokta çizimlerinde görünür olduğundan emin olun.</li>
	<li>Adım 4.16'da hazırlanan tek leke kompanzasyonlarını kullanarak her leke paneli için telafi kontrollerini kaydedin. Her örnek için pozitif ve negatif kapılar ayarlayın. Yazılımın ücret matrisini hesaplamasını salayın.</li>
	<li>İlk örneği almaya başlayın ve kapıların uygun şekilde ayarlandığından emin olun.</li>
	<li>Makineyi periton B hücre paneli ve dalak Igφ ve Igφ paneli için en az 50.000 B hücre olayını kaydedecek şekilde ayarlayın; BM olgunlaşma paneli için 150.000 B hücre olayı; ve dalak olgunlaşma paneli için 300.000 B hücre olayı.</li>
	<li>Her leke paneli için, her hayvan için tamamen lekeli örnekleri, lekelenmemiş bir örneği ve IPO'ları çalıştırın ve kaydedin.</li>
</ol>6. Verileri analiz edin
<ol><li>Akış sitometri analiz yazılımını kullanarak veri analizine devam edin. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3,Şekil 4'te özetlenen gating stratejilerini izleyin. 
</li>
</ol>

<ol><li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li>
<li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+in+situ+genetic+humanization+of+6+Mb+of+mouse+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).</li>
<li>Murphy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+megabase+humanization+of+their+immunoglobulin+genes+generate+antibodies+as+efficiently+as+normal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).</li>
<li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kappa-on-Heavy+%28KoH%29+bodies+are+a+distinct+class+of+fully-human+antibody-like+therapeutic+agents+with+antigen-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).</li>
<li>Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+biology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-cell biology and development.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).</li>
<li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).</li>
<li>Lund, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-producing+B+lymphocytes-key+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).</li>
<li>Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor.</a> Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).</li>
<li>von Boehmer, H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Goodnow, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li>
<li>Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+antigen+tunes+the+responsiveness+of+naive+B+cells+but+not+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells.</a> Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).</li>
<li>Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+that+control+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Checkpoints that control B cell development.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).</li>
<li>Henderson, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Rac-dependent+checkpoint+in+B+cell+development+controls+entry+into+the+splenic+white+pulp+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).</li>
<li>Pillai, S., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+follicular+versus+marginal+zone+B+lymphocyte+cell+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).</li>
<li>Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Development+in+the+Bone+Marrow+Is+Regulated+by+Homeostatic+Feedback+Exerted+by+Mature+B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 7, 77(2016).</li>
<li>Nemazee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+central+tolerance+for+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of central tolerance for B cells.</a> Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).</li>
<li>Petkau, G., Turner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+circuits+that+direct+early+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Signalling circuits that direct early B-cell development.</a> Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).</li>
<li>Betters, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Flow+Cytometry+in+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Advanced+Practioner+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Use of Flow Cytometry in Clinical Practice.</a> Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Van Epps, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+order+to+early+B+cell+chaos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bringing order to early B cell chaos.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389(2006).</li>
<li>Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+characterization+of+pro-B+and+pre-pro-B+cell+stages+in+normal+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).</li>
<li>Allman, D., Pillai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+B+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral B cell subsets.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).</li>
<li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+B+cell-deficient+mouse+by+targeted+disruption+of+the+membrane+exon+of+the+immunoglobulin+mu+chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene.</a> Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).</li>
<li>Keenan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Censoring+of+autoreactive+B+cell+development+by+the+pre-B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor.</a> Science. 321 (5889), 696-699 (2008).</li>
<li>Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+B+lymphocyte+populations+in+Lyn-deficient+mice+and+the+role+of+Lyn+in+signal+initiation+and+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation.</a> Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).</li>
<li>Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+CD45+expression+unmask+functions+for+CD45+in+B-cell+development%2C+tolerance%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).</li>
<li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proliferation+of+B+cells+and+auto-immunity+in+mice+lacking+protein+kinase+Cdelta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta.</a> Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).</li>
<li>Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+B-cell+survival+by+BAFF-dependent+PKCdelta-mediated+nuclear+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling.</a> Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-engaged+B+cells+undergo+chemotaxis+toward+the+T+zone+and+form+motile+conjugates+with+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells.</a> PLoS Biology. 3 (6), 150(2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry.</a> Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584(2017).</li>
<li>Bigos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+index%3A+an+easy-to-use+metric+for+evaluation+of+different+configurations+on+the+same+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21(2007).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Regeneron Pharmaceuticals, Inc.'in çalışanları ve hissedarlarıdır.

Lenfoid ve lenfoid olmayan dokuların akış sitometrik analizi, 1980'lerden beri farelerde ve insanlarda B hücre alt popülasyonlarının eşzamanlı tanımlanmasını ve numaralandırmasını sağlamıştır. Mizahi bağışıklığın bir ölçüsü olarak kullanılmıştır ve B hücre işlevselliğini değerlendirmek için daha fazla uygulanabilir. Bu yöntem, nadir popülasyonlarda bile B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlayan birden fazla parametrenin eşzamanlı analizi yoluyla farelerde ve insanlarda B hücre olgunlaşmasının farklı aşamaları...

Monoklonal antikorlar, ana akım tıbbın bir parçası haline geldikçe birçok insan hastalığı için giderek daha fazla tercih tedavisi haline gelmiştir1,2. Daha önce, fare IgH sabitleri3,4 ile tamamen insan değişken bölgelerini barındıran antikorları verimli bir şekilde üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık. Son zamanlarda, farklı antijen bağlayıcısı olan antikor benzeri moleküller üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık5. Antikorlar B hücreleri tarafından salgılanır ve uyarlanabilir humoral bağışıklığın temelini oluşturur. B-1 ve B-2 olmak üzere iki farklı tip B hücresi vardır. Memelilerde B-1 hücreleri fetal karaciğerden kaynaklanır ve doğumdan sonra mukozal dokular ile plevral ve periton boşluklarında zenginleştirilirken, B-2 hücreleri doğumdan önce fetal karaciğerden ve daha sonra kemik iliğinde (BM) kaynaklanır. B-2 hücreleri dalak ve kan dahil sekonder lenfoid organlarda zenginleştirilir6,7,8. BM'de, B-2 hematopoetik progenitörler, Ig mu ağır zincir yeniden düzenlemesinin başlatılması üzerine B yanlısı hücrelere farklılaşmaya başlar9,10. Ig ağır zincirinin ve montajının B öncesi hücre reseptörüne (BCR öncesi) başarılı bir şekilde yeniden düzenlenmesi, sinyalizasyon ve proliferatif genişleme ile birlikte B öncesi hücrelere farklılaşmaya yol açar. B öncesi hücreler Ig kappalarını (Igφ) yeniden düzenledikten sonra veya verimsizse, Ig lambda (Igφ) ışık zincirleri, ağır μ zincirle eşleşerek yüzey IgM BCR ekspresyozunu elde ederler. IgM yüzey ekspresyonunun otoreaktivite koşullarında azaldığının bilindiğini, böylece fonksiyonel olarak yanıt vermeyen veya anjik B hücrelerinde kendine toleransa katkıda bulunduğunu belirtmek önemlidir11,12. Olgunlaşmamış B hücreleri daha sonra IgD'yi birlikte ifade etmeye ve BM'den dalağa göç etmeye başladıkları bir geçiş aşamasına girerler. Dalakta, IgD ekspresyasyonu daha da artar ve hücreler geçiş B hücrelerinin ikinci aşamasına olgunlaşır, ardından olgunlaşma durumlarının ve gelişimlerinin marjinal bölge (MZ) veya foliküler (Fol) hücrelere tamamlanması13,14,15. Yetişkin farelerde, hastalıklı olmayan bir ortamda, BM'de günlük 10-20 milyon olgunlaşmamış B hücresi üretilmesine rağmen olgun B hücrelerinin sayısı sabit kalır. Bunlardan sadece yüzde üçü olgun B hücrelerinin havuzuna girer. Periferik B hücre bölmesinin büyüklüğü, kısmen kendi kendine reaktivite ve eksik olgunlaşma dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle hücre ölümü ile kısıtlanır16,17,18. Akış sitometrik analizi, insanlarda ve farelerde birçok bağışıklık hücresi alt bölmesini karakterize etmek ve numaralandırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. İnsan ve murine B hücre bölmeleri arasında bazı benzerlikler olsa da, bu protokol sadece murine B hücrelerinin analizi için geçerlidir. Bu protokol, genetik manipülasyonun B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir. Akış sitometrisi, hücre aktivasyonu, fonksiyon, çoğalma, döngü analizi, DNA içerik analizi, apoptoz ve hücre sıralama 19,20'yi ölçmek de dahil olmak üzere birçok ek uygulamada çok popüler olmuştur.
Akış sitometrisi, dalak, BM ve kan gibi karmaşık organlar da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda çeşitli lenfosit bölmelerini karakterize etmek için tercih edilen araçtır. Akış sitometrisi için yaygın olarak bulunan fareye özgü antikor reaktifleri nedeniyle, bu teknik sadece hücre yüzey proteinlerini değil, aynı zamanda hücre içi fosfoproteinleri ve sitokinleri ve fonksiyonel okumaları araştırmak için de kullanılabilir21. Burada, akış sitometri reaktiflerinin ikincil lenfoid organlarda olgunlaştıkça ve farklılaştıkça B hücreleri alt kümelerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Boyama koşullarının optimizasyonu, numune işleme, doğru cihaz kurulumu ve veri toplama ve son olarak veri analizinden sonra, farelerdeki B hücre bölmesinin kapsamlı akış sitometrik analizi için bir protokol kullanılabilir. Bu tür kapsamlı analizler, Gelişmekte olan BM B-2 hücrelerinin B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ve IgD22 ifadelerine bağlı olarak farklı fraksiyonlara (Fraksiyon) ayrılabileceği Hardy ve meslektaşları tarafından tasarlanan onlarca yıllık bir isimlendirmeye dayanmaktadır. Hardy ve ark., B220+ CD43 BM B hücrelerinin BP-1 ve CD24 (30F1) ekspresyerine dayanarak dört alt kümeye (Fraksiyon A-C') bölünebileceğini, B220+ CD43-(sönük ila neg) BM B hücrelerinin igd ve yüzey IgM23'ün farklı ifadesine dayanarak üç alt kümeye (Fraksiyon D-F) çözülebileceğini göstermiştir. Kesir A (B öncesi hücreler) BP-1- CD24 (30F1)-, Kesir B (erken B öncesi hücreler) BP-1- CD24 (30F1)+, Fraksiyon C (geç pro-B hücreleri) BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraksiyon C' (erken B öncesi hücreler) ise BP-1+ ve CD24high olarak tanımlanır. Ayrıca, Kesir D (B öncesi hücreler) B220+ CD43- IgM- B hücreleri, Kesir E (yeni oluşturulan B hücreleri, olgunlaşmamış ve geçiş kombinasyonu) B220+ CD43- IgM+ B hücreleri ve Fraksiyon F (olgun, yaslanan B hücreleri) B220high CD43- IgM+ B hücreleri olarak tanımlanır. Buna karşılık dalakta bulunan naif B hücrelerinin çoğunluğu CD93, CD23 ve IgM ekspresyonuna bağlı olarak olgun (B220+ CD93-) B hücrelerine ve geçiş (T1, T2, T3) hücrelere ayrılabilir. Olgun B hücreleri, IgM ve CD21/CD35 ekspresyonuna göre marjinal bölge ve foliküler alt kümelere çözülebilir ve foliküler alt kümeler, IgM ve IgD yüzey ekspresyonlarının seviyesine bağlı olarak olgun foliküler tip I ve foliküler tip II B hücre alt kümelerine ayrılabilir24. Bu dalak B hücre popülasyonları ağırlıklı olarak Igφ ışık zincirini ifade eder. Son olarak, fetal karaciğerden kaynaklanan ve esas olarak yetişkin farelerin periton ve plevral boşluklarında bulunan B-1 B hücre popülasyonları literatürde tanımlanmıştır. Bu periton B hücreleri, CD23 ekspresyonu eksikliği ile daha önce tanımlanmış B-2 B hücrelerinden ayırt edilebilir. Daha sonra B-1a veya B-1b popülasyonlarına ayrılırlar, birincisi CD5'in varlığı ve ikincisi yokluğu25 ile tanımlanır. B-1 hücreli atalar fetal karaciğerde bol miktarda bulunur, ancak yetişkin BM'de bulunmaz. B-1a ve B-1b hücreleri farklı progenitörlerden kaynaklanırken, her ikisi de periton ve plevral boşlukları tohumlar24. B-2 hücrelerinin aksine, B-1 hücreleri benzersiz bir şekilde kendini yenileyebilir ve doğal IgM antikorlarının üretiminden sorumludur.
B hücre gelişimindeki kusurlar, BCR26,27 bileşenlerindeki eksiklikler, BCR sinyal gücünü etkileyen sinyal moleküllerinin pertürbasyonları14,28,29 veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulması dahil olmak üzere birçok durumda ortaya çıkabilir30,31 . Lenfoid bölmelerin akış sitometri analizi, bu farelerde ve diğer birçok kişide B hücre gelişim bloklarının karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. Lenfoid bölmelerin akış sitometrik analizinin bir avantajı, canlı ayrışmış dokudan elde edilen tek tek hücreler üzerinde ölçüm yapma yeteneği sunmasıdır. Reaktiflerin sürekli genişleyen bir florofor aralığında bulunması, birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, B hücrelerinin akış sitometrik analizi ile numaralandırılması, lenfoid organlarda hücre lokalizasyonunu görselleştiren immünhistokimya yöntemleri, dolaşımdaki antikor seviyelerinin humoral bağışıklık ölçüsü olarak tespiti ve B hücre yanıtlarını gerçek uzay ve zamanda ölçmek için iki foton mikroskopisi gibi diğer immünolojik tahlilleri tamamlar32.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL güvenli kilitli Eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22363611</td><td>0.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpleri ve nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22364111</td><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352097</td><td>15 mL konik boru</td></tr><tr><td>18 gauge iğne</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305124</tr><tr><td>3 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>70 mM MACS SmartStrainer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biyotec& nbsp;</td><td>130-110-916&nbsp;</td><td>70 mM hücre süzgeci</td></tr><tr><td>96 kuyulu U alt plaka&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>A1049201</td><td>kırmızı kan hücresi lizis tamponu</td></tr><tr><td>Acroprep Advance 96 Kuyulu Filtre Plakası</td><td>Pall Corporation</td><td>8027</td><td>filtre plakası</td></tr><tr><td>B220</td><td>eBiosciences</td><td>17-0452-82</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Fare Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552843</td><td>tazminat boncukları</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Sıçan Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552844</td><td>kompanzasyon boncukları</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A8577</td><td>BSA</td></tr><tr><td>BP-1</td><td>BD</td><td>740882</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Leke Tamponu</td><td>BD</td><td>566349</td><td>parlak leke tamponu</td></tr><tr><td>C-Kit</td><td>BD</td><td>564011</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35</td><td>BD</td><td></td><td></td>562756</tr><tr><td>CD23&nbsp;</td><td>BD</td><td>740216 CD24</td><td></td></tr><tr><td>(HSA)</td><td>BioLegend</td><td>138504</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>561388</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100214</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BD</td><td>553270</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>BD</td><td>563194</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BD</td><td>740750</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BioLegend</td><td>136504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>eBioscience Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 506</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td>canlılık boyası</td></tr><tr><td>Genişletilmiş İnce Uçlu Transfer Pipeti</td><td>Samco</td><td>233</td><td>tek kullanımlık transfer pipeti</td></tr><tr><td>FACSymphony A3 akış sitometresi</td><td>BD</td><td>özel sipariş</td><td>akış sitometresi</td></tr><tr><td>Fc Bloğu, CD16 / CD32 (2.4G2)</td> <td>BD</td><td>553142</td><td>Fc bloğu</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>akış sitometresi analiz yazılımı</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tüpleri&nbsp;</td><td>Miltenyi Biyotec& nbsp;</td><td>130-096-334</td><td>Otomatik ayrışma tüpü & nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS Isıtıcılı Octo Dissociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biyotec& nbsp;</td><td>130-095-937</td><td>doku ayrıştırıcı cihaz</td></tr><tr><td>GR1 (Ly6C / 6G)</td> <td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>IgD</td><td>BioLegend</td><td>405710</td><td></td></tr><tr><td>IgM</td><td>eBiosciences</td><td>25-5790-82</td><td></td></tr><tr><td>Kappa</td><td>BD</td><td>550003</td><td></td></tr><tr><td>Lambda</td><td>BioLegend</td><td>407308</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit, %32 Çözelti</td><td>Elektronu Mikroskopi Bilimleri</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Leke Monosit Bloker</td><td>BioLegend</td><td>426103</td><td>monosit bloker</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575038</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Vi-CELL XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>hücre sayacı cihazı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

murine b hücre gelişiminin akış sitometrik karakterizasyonu

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Kapsamlı çalışmalar, ikincil lenfoid organlarda murine B hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını karakterize ederek karakterizedir. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar izole edilmiş ve köklü terapötikler haline geliştirilmiştir. Murine B hücre gelişiminin, otoimmün eğilimli fareler bağlamında veya değiştirilmiş bağışıklık sistemine sahip farelerde doğrulanması, farelerde terapötik ajanlar geliştirmenin veya test etmenin önemli bir bileşenidir ve akış sitometrisinin uygun bir kullanımıdır. İyi kurulmuş B hücre akışı sitometrik parametreleri, murine periton, kemik iliği ve dalaktaki B hücre gelişimini değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bir dizi en iyi uygulamaya uyulmalıdır. Ek olarak, B hücre bölmelerinin akış sitometrik analizi de B hücre gelişiminin ek okumalarını tamamlamalıdır. Bu teknik kullanılarak üretilen veriler, vahşi tip, otoimmün eğilimli fare modelleri ve terapötik olarak antikor veya antikor benzeri moleküller üretmek için kullanılabilecek insanlaştırılmış fareler anlayışımızı daha da ileriye getirebilir.

Burada fare periton, BM ve dalak B hücre gelişimini karakterize etmek için gating stratejisini sunuyoruz. Analizin temeli canlı boya ile boyama kavramı etrafında oluşur, daha sonra İleri-Dağılım Alanı (FSC-A) ve İleri-Dağılım Yüksekliğine (FSC-H) dayalı çiftleri dışarı çıkarmak ve son olarak hücreleri FSC-A ve Yan Dağılım Alanı (SSC-A) özelliklerine göre seçerek kalıntıların gating' i, burada göreli hücre boyutunu ve hücre ayrıntı düzeyini yansıtan boyut kapısı olarak adlandırılır, ilgi ...

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Bu teknik kullanılarak oluşturulan veriler, genel antikor veya antikor yaşam terapötikleri için kullanılabilecek otoimmün eğilimli fare modellerinin yanı sıra insanlaştırılmış farelerin anlaşılmasını daha da ileriye götürür. Sürekli genişleyen bir florofor yelpazesine sahip reaktiflerin mevcudiyeti, tek tek hücreler üzerinde birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol, genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir.genetik manipülasyonu B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için. Merhaba, ben Faith Harris. Prosedürü bugün göstereceğim.Her hayvandan her hücre türünden bir milyonu 96 kuyulu bir U-bottom plakasına ayırarak başlayın. Tam leke, floresan eksi bir numune ve her florofor için lekesiz numuneler de dahil olmak üzere tüm numuneler ve kontroller için yeterli Kuyuların mevcut olduğundan emin olun. Kemik iliği olgunlaşma paneli ve dalak olgunlaşma paneli için, aliquot hücreleri iki kuyuya, her tam leke örneği için kuyu başına 1 milyon hücreye.Tek renk telafisi canlılık denetimleri için, her hücre türünün iki milyon hücresini tek tek kuyulara ekleyin. Plakayı 845 x g'da dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Kuyuları çapraz kirletmemeye özen ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.Hücreleri 200 mikrolitre DPBS'de iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatantı santrifüj ve dekantize edin. Hücreleri DPBS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre canlılık boyasında bir ila 1000 oranında yeniden biriktirin ve tek renk telafisi için kullanılan hücrelerden kaçının.Her leke seti için, tamamen ellenmemiş bir numune ve ihtiyacınız olabilecek diğer kontroller için birkaç yersiz kuyu ve canlılık FDO kontrolü için ek bir yersiz kuyu bırakın. Bu kuyulara PBS ekleyin. Tek renk telafisi canlılık kontrollerinin hücrelerini 200 mikrolitre seyreltilmiş canlılık boyasında yeniden biriktirin.Bu hücrelerin 100 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 65 santigrat derecede beş dakika ısıtın, ardından ısıtılan hücreleri kalan canlı hücrelerle orijinal kuyuya geri aktarın. Hücreleri ışıktan korunarak 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri santrifüj edin ve diğer kuyuları çapraz kirletmeden plakayı titreterek veya ters çevirerek süpernatantı deşarj edin.Hücreleri 200 mikrolitre DPBS'de yeniden yağlayarak yıkayın, ardından süpernatantı daha önce olduğu gibi santrifüj ve dekante edin. DPBS yıkamayı tekrarlayın. Mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyon elde etmek için bir ila 50 oranında leke tamponu ile seyreltilmiş FC bloğu mikrolitreleri ekleyin.Periton hücreleri için, spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için beş mikrolitre monosit bloker ekleyin. Daha sonra, hücreleri ışıktan korunarak 15 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Metin el yazmasındaki antikor tablolarını kullanarak milyon hücre başına 100 mikrolitrelik son hacim için leke tamponunda tam leke ana karışımları ve IPO'lar hazırlayın.FC bloğunu çıkarmadan, seçilen kuyulara 100 mikrolitre tam leke mikseri ve IPO ekleyin. Her antikor ve bir leke seti için tek renk telafi kontrolleri hazırlayın. Kompanzasyon boncukları kullanıyorsanız üreticinin talimatlarını izleyin.Hücreleri ve boncukları ışıktan korunarak 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, plakayı ters çevirerek ve titreterek süpernatantı santrifüj edin ve dekante edin. Hücreleri ve boncukları 200 mikrolitre leke tamponunda üç kez yıkayın, her seferinde süpernatantı santrifüjleme ve dekante edin.Numuneleri analiz için sabitlemek için DPBS'de %2 paraformaldehitin 200 mikrolitresinde hücreleri ve boncukları yeniden biriktirin. Hücreyi ve boncukları 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ışıktan kornun, sonra plakayı ters çevirerek veya titreterek süpernatantı santrifüjleyin ve dekante edin. Hücreleri ve boncukları 200 mikrolitre leke tamponunda yeniden biriktirin.Temiz bir 96 kuyulu U-bottom plakasının üzerine bir filtre plakası yerleştirin ve her numuneyi çoklu pipet kullanarak filtre plakasının bir kuyusuna aktarın. Filtre plakasını santrifüjleyin ve süpernatantı dekante edin. Kemik iliği ve dalak olgunlaşma panelleri için, tamamen lekeli hücreleri 100 mikrolitre leke tamponunda yeniden biriktirin.Her hayvan için iki kuyuyu bir kuyuda birleştirin. Kalan panelleri, IPO'ları ve kontrolleri 200 mikrolitre leke tamponunda yeniden sunun. Sabit hücreleri ve boncukları bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ışıktan korkun.Hazırlanan tek leke kompanzasyonlarını kullanarak her leke paneli için kompanzasyon kontrollerini kaydedin ve her numune için pozitif ve negatif kapılar ayarlayın. Yazılımı kullanarak ücret matrisini hesaplayın. Kapıların uygun şekilde ayarlandığından emin olarak ilk örneği almaya başlayın.Makineyi, metin el yazmasında belirtildiği gibi her örnek için çeşitli hücre olaylarını çalıştıracak ve kaydedecek şekilde ayarlayın. Metin yazısındaki gating stratejilerini izleyerek akış sitometri analiz yazılımını kullanarak veri analizine devam edin. Peritondaki periton B hücrelerinin karakterizasyonu için akış sitometrik analizi, farelerdeki B-1a ve B-1b hücrelerinin yanı sıra canlı periton hücrelerinin, toplam B hücrelerinin, B-1 ve B-2 alt kümelerinin frekanslarını gösterir.Kemik iliği B hücreleri analiz edildiğinde, farelerde canlı hücrelerin frekansları, total B hücreleri, Fraksiyon A, B öncesi hücreler, Fraksiyon B, Fraksiyon C, Fraksiyon C'Fraksiyon D, olgunlaşmamış Fraksiyon E, geçiş fraksiyonu E ve fraksiyon F B hücrelerinin frekansları belirlendi. Dalak B hücrelerinin analizi, canlı dalak hücrelerinin, toplam B hücrelerinin, geçiş B hücrelerinin, T1, T2, T3 hücrelerinin, olgun B hücrelerinin, foliküler I hücrelerinin, foliküler II hücrelerinin, öncül ve olgun marjinal bölge hücrelerinin ve farelerdeki B-1 hücrelerinin frekanslarını göstermektedir. Farelerde immünoglobulin kappa ve immünoglobulin lambda B hücrelerinin frekansları dalak akış sitometrik analizi ile belirlendi.Bu protokolü gerçekleştirirken, bir dedektör kanamasından diğerine gelen sinyali telafi kontrollerini kullanarak çözmeniz gerekir. Bu kontroller tekil olarak hücre lekeli veya ticari olarak kullanılabilir kompanzasyon boncukları ile olabilir. Lenfoid organlar içindeki hücre lokalizasyonunu görselleştirmek için immünhistokimya gibi akış sitometrisi ile birlikte ek tahliller ve B hücre yanıtlarını gerçek mekan ve zamanda analiz etmek için iki foton mikroskopisi kullanılabilir.B hücre bölmelerinin akış sitometrisi analizi, BCR ve ilgili eksikliklerle ilişkili fenotiplerin karakterizasyonuna, BCR sinyal moleküllerinin pertürbasyonlarına veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulmasına izin verir.

flow-cytometric-characterization-of-murine-b-cell-development

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Antijen maruz kalma ardından, aktive B hücreleri alt popülasyonlar farklı efektör fonksiyonları ile antikor isotypes üretmek için sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir süreç geçmesi. Bu raporda açıklanan protokol KSS uyarılan ve nasıl analiz edilebilir...

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Öğrenin fare B hücre gelişiminin akış sitometrik karakterizasyonunu periton, dalak ve kemik iliği dokularında. Bu yöntem genetik olarak modifiye edilmiş farelerin fenotiplenmesi için uygulanır.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet