Name: Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Keşfedin fare kalbinde kılcal damarlar, arterioller ve perisitlerin dinamik ölçümü ve görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler fizyoloji ve mikrosirkülasyon araştırmalarında değerli bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Biyomedikal Mühendisliği ve Teknolojisi Merkezi (BioMET) tarafından desteklendi; NIH (1U01HL116321) ve (1R01HL142290) ve Amerikan Kalp Derneği 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Tüm hayvan bakımı Maryland Baltimore Üniversitesi'nin yönergelerine ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokollere uygundu.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT: Çözümleri önceden hazırlayın. Deneylerde iki tür temel çözüm kullanılmaktadır: (1) banyo superfusate için fizyolojik tuzlu su çözeltileri (PSS) ve (2) Lümen perfüzyonu için Tirot çözeltileri. PSS'nin pH'ını korumak için CO2 ile sürekli kabarcıklanma gereklidir. HEPES tamponlu Tyrode'un çözeltisi, kabarcıkların damarlara girmesini önlemek için PSS yerine lümende kullanılır, çünkü kabarcıklar endotelhücrelerine 7 zarar verir ve akışı tıkar.
<ol><li>PSS çözümü: Tablo 1'de PSS çözümünün formülüne ve bileşimine bakın. 10 L Ca2+içermeyen ve glikozsuz PSS stok çözeltisi yapın ve oda sıcaklığında saklayın. Herhangi bir işlemden önce 1 saat, çözeltinin pH'ını ~7.4'te tutmak için% 5 CO2 (% 74N 2 ve%21 O 2)ile stok çözeltisinden 1 L ve kabarcık alın. 1.8 g glikoz ve 1.8 mL CaCl2 (1 M stok)8ekleyin. NOT: Ca2+'yı yalnızca pH ~7.4 olduğunda köpürdükten sonra ekleyin, aksi takdirde Ca2+ çöker.</li>
	<li>Tyrode'un çözümü: Tablo 1'deTyrode'un çözümünün formülünü ve bileşimini görün. Çözeltiyi filtreleyin (0,22 μm) ve ileride kullanım için 4 °C'de saklanır9.</li>
	<li>Tyrode'un BDM ile çözümü (2,3-Butanedione monoksim): Miyositlerin kasılmasını önlemek için ters çevrilebilir bir miyofilament inhibitörü olarak BDM ekleyin10. 600 mg BDM ağırlığında ve 200 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. Çözeltiyi tamamen çözünene kadar BDM ile karıştırın. Daha fazla filtrasyona gerek yoktur.</li>
	<li>Tyrode'un BDM içeren çözümünü ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Oda hazırlığı
<ol><li>Üretici tarafından sağlanan talimatları izleyerek hem diseksiyon odasını hem de deneysel odayı polidimetilsiloksisan (PDMS) ile önceden kaplayın.</li>
	<li>Diseksiyon odasını Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>İşlemden önce soğutucuyu 1 saat açın. Sıcaklığı 4 °C olarak ayarlayın.</li>
</ol>3.Ül hazırlığı
<ol><li>Mikropipette puller'ı açın. Üreticinin yönergelerine göre ayarları seçin.</li>
	<li>Temiz bir borosilikat cam tüp alın (kullanılan cam tüplerin dış ve iç çapı sırasıyla 1,2 mm ve 0,69 mm idi).</li>
	<li>U şeklinde platin ısıtma filamentli bir Sutter pipet çekme makinesinin yivli kelepçelerine bir cam tüp yerleştirin.</li>
	<li>Her biri uzun ince uçlu iki kanonül üretmek için çekmeciyi etkinleştirin.</li>
	<li>Ucun son çapını 100 ila 150 μm civarında yapmak için her bir canülün ucunu bir kesme mikroskobu altında ince bir makas kullanarak kesin.</li>
	<li>Ateş, keskin kenarları hafifçe yuvarlamak için kesilmiş canülun ucunu parlatır.</li>
	<li>Kanülleri, şaftın kenarına uçtan yaklaşık 2 mm uzaklıkta yerleştirilmiş platin bir tel (ince kontrolle ısıtılmış) kullanarak şaft boyunca bükün. Bükümdeki virajın açısı 45 ° civarında olmalıdır.</li>
	<li>Kanolün açık ucını basınçlı miyograf odasının tutucusuna yerleştirin ve bağlantı elemanını sıkın. Tyrode'un çözeltisi ile dolu 5 mL'lik bir şırınnayı bağlantı parçasının diğer tarafına bağlayın. Canülleri odaya monte edilmiş bir mikromanipülatöre bağlayın (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2).</li>
	<li>Şırınd (5 mL), yıkama, boru ve hava kabarcıklarının konektörünü kullanarak kanolü Tyrode'un çözeltisiyle doldurun.</li>
	<li>Kanülasyon işleminden önce, kanül içindeki perfüzyon basıncını belirli bir akış aralığında ölçün (50 ila 300 μL/dk, Şekil 3). Bunu yalnızca yeni bir cannula kullanıldığında yapın. NOT: Kanül içindeki perfüzyon basıncı akışla orantılıdır ve doğrusal olarak monte edilmiştir (Şekil 3).</li>
</ol>4. Fare kalbinin çıkarılması
<ol><li>Izofluran ve oksijen tanklarına bağlı anestezi kutusuna bir C57BL/6 fare (seks, 8-16 haftalık) koyun.</li>
	<li>Oksijen tankını açın ve izofluran akışını başlatın. Fare tamamen uyuşturulup uyuşturuluna kadar ~5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Anestezi kurulduktan sonra, fareyi anestezi kutusundan alın ve vaskültürde kan pıhtısı oluşumunu önlemek için heparin IP'yi (periton boşluğuna, 360 ünite, 0,5 mL / fare) enjekte edin. Sonra fareyi anestezi kutusuna geri koyun.</li>
	<li>Heparin enjekte edildikten 10 dakika sonra, fareyi supine pozisyonunda ısıtılmış yatağa hareket ettirin ve etiketleme bandı kullanarak pençelerini stabilize edin. Fareyi burun konisi kullanarak izofluran ile tam anestezi altında tutun.</li>
	<li>Farenin karın derisini önps ile diyaframın üzerine kaldırın ve diyaframı kesmek ve açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Diyaframı ve göğüs kemiğini kesin. Göğsünü aç.</li>
	<li>Kalbi torasik boşluktan parçalara ayrıştırarak sırt torasik duvarına mümkün olduğunca yakın keser.</li>
	<li>Kalbi buz gibi Tyrode'un 30 mM BDM içeren çözeltisine yerleştirin.</li>
	<li>Akciğer gibi bağ dokularını çıkarmak için kalbi temizleyin.</li>
	<li>Kalbi, 30 mM BDM içeren Tyrode çözeltisi ile dolu önceden soğutulmuş diseksiyon odasına aktarın.</li>
</ol>5. Septal arterin hazırlanması ve kanülasyonu
<ol><li>Servo pompayı aç. Servo pompayı "akış" moduna ayarlayın. Boru, vasküler lümeni boğmak için kullanılacak Tyrode çözeltisi ile doldurulana kadar yüksek hızda çalışmasına izin verin. Tüpte kabarcık olmadığından emin olun. O zaman hızı düşür.</li>
	<li>Kalbi PDMS'ye sabitleyerek kalbin orta bölgesinde herhangi bir hasar olmasını önler.</li>
	<li>Hem sağ hem de sol atriayı çıkarın. Sağ ventrikülü kesin ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sağ ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.</li>
	<li>Septal arteri açığa çıkar ve tanımla. Septal arterin altına bir naylon iplik (30 μm çapında) yerleştirin ve ileride kullanmak için gevşek bir düğüm bağlayın. NOT: Septal arter, diseksiyon mikroskobu kullanılarak kolayca tanımlanabilir. Septal arter, çoğu durumda sağ koroner arterden kaynaklanan septum üzerindeki ana arterdir.</li>
	<li>İnce makas kullanarak sol ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.</li>
	<li>Papiller kas preparatını, canüllerin yer aldığı deneysel odaya aktarın. Oda, Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doludur. Bu odanın tabanı ince (~2 mm) pdms tabakası ile kaplanmıştır.</li>
	<li>Septal arterin kanülasyonunu etkinleştirmek için kanüllerin konumunu (mikromanipülatör kullanarak) ayarlayın. Düğümü sıkın.</li>
	<li>Papiller kası oda zeminine küçük pimler kullanarak sabitleyin, böylece mikroskop hedefi vaskülatın net bir görünümüne sahiptir. Kanül açısına ve konumuna dikkat edin ve kanül ucunun arteriyel duvara paralel olduğundan emin olun.</li>
	<li>Çözeltiyi şırındiden kanülden kademeli olarak dışarı atarak kanülasyonu test edin. Tüm elementler düzgün çalışırsa, papiller kastaki artık kan bu sürecin başında dokudan çıkar ve daha sonra sadece Tirode'un çözeltisi görülür.</li>
</ol>6. Hazırlığın stabilizasyonu
<ol><li>Süperfüzyon çözeltisini sağlayacak peristaltik pompayı açın. Daha sonra banyodaki preparatı 3-4 mL / dk oranında önceden gazlanmış PSS ile sürekli olarak superfuse edin.</li>
	<li>Süperfüzyon çözeltisi için sıcaklık kontrol cihazını açın. Banyonun sıcaklığını ~35-37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Cannula'yı servo pompaya bağlayın. Basınç servo denetleyicisinde görüntülenen basıncı okuyun.</li>
	<li>Akışı ve basıncı izleyin. Akış (μL/dk) ve arteriyel perfüzyon basıncı (mm Hg) sayısallaştırıcı kullanılarak dijitalleştirilir ve ilişkili bir yazılım kullanılarak kaydedilir (Şekil 2).</li>
	<li>Basıncı ~10 mmHg ayarlamak için akışı ayarlayın ve ~10 dakika boyunca çalışmasına izin verin.</li>
	<li>Arter basıncını ~60 mmHg yapmak için ışık çözeltisinin akışını artırın. Kanül basınç damlasını çıkararak arteriyolün kendisinin son perfüzyon basıncını elde edin (Şekil 3). NOT: Basınç servo denetleyicisindeki "basınç" modu seçilirse, bu deneyler için ışık basıncı ~60 mmHg olarak ayarlanır. Ardından akışın değişimini izleyin.</li>
	<li>Akış ve/veya basınç seviyelerini izleyerek numunenin ~30-60 dakika stabilize olsun. Normalde kanülasyondan sonra perfüzyonun başlangıcında arteriyel basıncın kademeli bir artışı gözlenir. Yeni bir istikrarlı durum yaklaşık 30 dakika içinde kendiliğinden kurulacaktır (Şekil 4).</li>
	<li>Perfüzyon basıncı stabilize edildikten sonra (sabit akışta) bir deney başlatın.</li>
</ol>7. Hazırlığı floresan etiketli buğday-germ agglutinin (WGA) ile yüklemek
<ol><li>5 mL Tyrode çözümüne 100 μg eşleştirilmiş WGA ekleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA içeren Tyrode'un çözümünü hazırlayın.</li>
	<li>Perfüzyonu normal Tyrode'un çözeltisinden floresan etiketli WGA içeren bir çözeltiye dikkatlice değiştirin. Perfüzyonu dikkatlice değiştirmek önemlidir, böylece kabarcıklar kullanılmaz.</li>
	<li>~30 dakikalık WGA perfüzyondan sonra veya WGA çözeltisi bitmek üzereyken perfüzyonu normal Tyrode'un çözümüne değiştirin.</li>
</ol>8. Arteriyüllerin ve kılcal damarların konfokal görüntülemesi
<ol><li>Nipkow disk konfokal mikroskop sistemini açın.</li>
	<li>İletilen ışık modunda düşük güç hedefi (4x) kullanarak septal arteri bulmak için mikroskobu kullanın. NOT: Septal arter kanül pozisyonunu takip ederek yerlenebilir.</li>
	<li>Dönen disk konfokal ile konfokal görüntülemeye başlayın ve 488 nm ekscitasyon lazeri, 40x objektif büyütme seçin ve lazer yoğunluğunu ve örnekleme oranını (görüntü başına 10 - 500 ms) ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme aralığını tanımlamak ve z yığını görüntüleme parametrelerini girmek için konfokal mikroskop için üst ve alt görüntüleme konumlarını ayarlayın.</li>
	<li>Kullanılan sistem için önerilen adım boyutunu ayarlayın veya adım boyutunu istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
	<li>z yığını ayarını ve/veya zaman serisi ayarlarını seçin.</li>
	<li>Yeni görüntüyü depolamak için yeni bir klasör seçin veya ayarlayın.</li>
	<li>İleride analiz için görüntüleme kaydetmeye başlamak için "Çalıştır" ı tıklatın (Şekil 5).</li>
</ol>9. Örnek vazodilatör deneyi: pinacidil kaynaklı vazodilasyon (Video 1).
<ol><li>Pinacidil stok çözeltisi (DMSO'da 100 mM) hazırlayın ve 4 °C'de saklanın.</li>
	<li>10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son pinacidil konsantrasyonunu 100 μM yapmak için 10 μL pinacidil stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Septal arteri ve dal arterlerini içerecek şekilde papiller kası düşük büyütmede (4x amaç) görüntüleyin.</li>
	<li>Işıltılı çözeltiyi pinacidil içeren çözeltiye geçirin.</li>
</ol>10. Örnek kan akışı kontrol deneyleri: vazokonstriktör kaynaklı arteriyel perfüzyon basıncı sabit akışta artar (Şekil 6)
<ol><li>Endotelin-1 (ET-1) stok çözeltisi (10 μM) hazırlayın ve -20 °C'de saklanın.</li>
	<li>10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son ET-1 10 nM konsantrasyonunu yapmak için 10 μL ET-1 stok çözeltisi (10 μM) ekleyin.</li>
	<li>Işık basıncını sürekli akışla kaydedin ve papiller kası görüntüleyin.</li>
	<li>Işıklı çözeltiyi ET-1 içeren çözeltiye geçirin.</li>
</ol>11. Perisitli kılcal damarların örnek görüntüleri (Şekil 7)
<ol><li>Bu protokolün bölüm 4'lerinde açıklandığı gibi bir NG2DsRedBAC transgenik fare feda edin.</li>
	<li>Kalbi çıkarın, septal arteri kanüle edin ve örneği 5-7 protokollerini izleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA ile yükleyin.</li>
	<li>Papiller kası 488 nm ve 560 nm ekscitasyonda ve konfokal kullanarak 510-525 nm, 575-625 nm emisyonda görüntüleyin. Arteriole basıncı 40 mmHg civarında olacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Mevcut çalışmada, fizyolojik koşullar altında kalpteki koroner mikroskrkülasyonu incelemek için son derece basit ama son derece pratik bir ex vivo yöntemi sunduk. Bu yöntem, sıçanlar kullanılarak mekanik araştırmalardan değiştirilmiştir2. Zorlu ek, yüksek hızlı ve yüksek optik çözünürlüğe sahip görüntüleme teknolojisiydi. Bu nedenle, şu anda piyasada bulunan gelişmiş optik görüntüleme sistemlerinden yararlanabildik. Çalışan papiller kas preparatının uygun bir pozisyonda dikkatli bir şekilde diseks...

Uygun koroner basınç akışı düzenlemesi, kalbin metabolik taleplerini karşılamak için yeterli kan akışını sağlar1. Bununla birlikte, son on yıldır in vivo ve in vitro olarak yapılan kapsamlı çalışmalara rağmen, koroner basınç akışının kalpte nasıl dinamik olarak düzenlendiği daha yeni ortaya çıktı. Bunun nedenlerinden biri, kalbin sürekli atması nedeniyle bu tür çalışmalar için fizyolojik bir çalışma modeli oluşturmanın zorluğudur. Ne olursa olsun, koroner mikro damarların canlı dokularda veya hayvanlarda gözlemlenmesi için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur, ancak bu yöntemlerin hiçbiri sabit / kararlı odak ve basınç, akış ve mikrovasküler çap ölçümlerini aynı anda elde edemedi2,3. Atan kalpte koroner arteriyel mikro damarların doğrudan görselleştirilmesi on yıllar önce tanıtıldı4,3, ancak küçük damarlardaki çap ölçümleri zorluydu ve mikrosirkülasyonla ilişkili birçok özel hücre tipinin spesifik işlevleri eşit derecede can sıkıcıydı. Stroboscopic yöntem ve yüzen nesnel sistem bile yukarıdaki bilgileri aynı anda sağlayamadı5. Bununla birlikte, koroner kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olan yukarıda belirtilen teknolojiler kullanılarak önemli miktarda değerli bilgi elde edilmiştir6. Bu makalede anlattığımız yöntem, koroner arterlerin, arterioles ve mikrovasküler arter bileşenlerinin stimülasyonlara ve metabolik taleplere nasıl farklı yanıt verdiğini ayrıntılı olarak araştırmamıza ve anlamamıza yardımcı olacaktır.
Bu çalışmaları sürdürmek için kurduğumuz çalışma modeli Westerhof ve ark.2'ninönceki çalışmaları üzerine inşa edildi. Fare kalbinin septal arterinin kanülasyonunu takiben, kalp dokusunun miyositlerini ve diğer bileşenlerini besleyen arteri boğmak için fizyolojik salin çözeltisi kullanıldı. Arteriyel perfüzyon basıncı, akış ve damar çapı diğer fizyolojik fonksiyonlar arasında uygun floresan göstergeler kullanılarak izlendi. Bu yöntem, canlı dokuda fizyolojik basınç altında koroner mikrovasküler yatağı görselleştirmemizi ve mikro sirkülasyon regülasyonunun altında yatan hücresel mekanizmaları ilk kez incelememizi sağlar.

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl2 çözeltisi</td><td>MilliporeSigma, ABD</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 çözeltisi</td><td>MilliporeSigma, ABD</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar, San Jose, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutucu/su inkübatörü</td><td>FisherScientific, ABD</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal</td><td>Nikon Cihazları, ABD</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Özel cam boru</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Moleküler Cihazlar, San Jose, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus, Japonya</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endotelin-1</td><td>MilliporeSigma, ABD</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Salt</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Satır içi çözelti Isıtıcı</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, ABD</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>VETone, Idaho, ABD</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, ABD</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet / kanül tutucu</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, ABD</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>NG2DsRedBAC transgenik fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Kan damarlarını bağlamak için naylon iplik</td><td>Canlı Sistemler Enstrümantasyonu, Burlington, Vt, ABD</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetilsiloksan)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, ABD</td><td>184 SIL ELAST KİTİ</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Gilson, Middleton, WI, ABD</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Basınç Servo Denetleyici</td><td>Yaşam Sistemleri Enstrümantasyonu, Burlington, Vt, ABD</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>İnce Bilimsel Araçlar, Foster City, CA, ABD</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Servo Pompa</td><td>Yaşam Sistemleri Enstrümantasyonu, Burlington, Vt, ABD</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, ABD</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Buğday Rujubu Aglütinin, Alexa Fluor 488 Eşlenik</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ABD</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

fare kalbinde kılcal damarlar, arterioles ve perisitlerin dinamik Ölçümü ve görüntülenmesi

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Kılcal damarların açılması veya kapanması ile birlikte koroner arteriyel ton, sabit perfüzyon basıncında kardiyomiyositlere kan akışını büyük ölçüde belirler. Bununla birlikte, koroner arteriyüllerin ve tüm kalpteki kılcal damarların dinamik değişikliklerini, öncelikle hareketi ve durmadan atması nedeniyle izlemek zordur. Burada, fare sağ ventrikül papiller kaslarındaki arteriyel perfüzyon oranının, basıncının ve arteriyüllerin ve kılcal damarların çap değişikliklerinin izlenmesini sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Fare septal arteri, dinamik olarak ölçülen diğer ile sabit bir akışta veya basınçta kanüle edilir ve perfüzyona edilir. Floresan etiketli bir lektin (örneğin, Alexa Fluor-488 veya -633 wheat-germ Agglutinin, WGA) etiketli perfüzyondan sonra, sağ ventrikül papiller kas ve septumdaki arteriüller ve kılcal damarlar (ve diğer damarlar) kolayca görüntülenebilir. Damar çapı değişiklikleri daha sonra kalp kasılmalarının varlığında veya yokluğunda ölçülebilir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ifade edildiğinde, belirli özellikler izlenebilirdi. Örneğin, perisitler NG2-DsRed'i ifade eden fare kalplerinde görselleştirildi. Bu yöntem, kalpteki kılcal perisitlerin fizyolojik işlevlerini incelemek için yararlı bir platform sağlamıştır. Damar/kılcal çapı ve arteriyel ışık basıncını aynı anda ölçerek reaktiflerin kalpteki kan akışı üzerindeki etkisini incelemek için de uygundur. Bu preparat, son teknoloji optik görüntüleme sistemi ile birlikte, kişinin kan akışını ve kontrolünü fizyolojik koşullar altında kalpteki hücresel ve moleküler düzeyde incelemesini sağlar.

Bir floresan vasküler belirteç vasküler lümende perfüzyona girdiğinde (burada WGA, Alexa Fluor-488 ile eşleştirilmiş), yüksek hızlı konfokal mikroskop kullanarak Şekil 5'te (Sol panel) gösterildiği gibi tüm vasküler ağaçları görselleştirmek mümkündür. Daha fazla büyütme, kılcal damarların ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar (Şekil 5, Sağ Panel). Basınçlı sistem ışık basıncının sürekli izlenmesini desteklediğinden, bu preparat arteriyel çaptaki değişiklikler...

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Bu yöntem, arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının ex vivo izlenmesi yoluyla canlı murin, kalp dokusu ve vasküler ağaç bileşenlerinde koroner mikrosirkülasyonu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, kalp içindeki perisitlerin ve reaktiflerin mikrosirkülasyonunun işlevini incelemek için yararlı bir platform sağlar, böylece vasküler çapı ve arteriol luminal basıncını ölçme eğilimindeyiz. Deney için bir kanül hazırlamak için, tek bir temiz borosilikat cam tüpten uzun ince uçlu iki kanül üretmek için bir mikropipet çektirme kullanın.Her kanülün ucunu 100 ila 150 mikrometre arasında bir son uç çapına kesmek için ince bir makas ve diseksiyon mikroskobu kullanın ve keskin kenarları hafifçe yuvarlamak için uçları ateşle parlatın. Kanülü şaft boyunca yaklaşık 45 derecelik bir açıyla bükmek için şaftın yan tarafına, uçtan yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirilmiş bir platin tel kullanın ve kanülün açık ucunu kanül tutucusuna yerleştirin. Ardından, bağlantı parçasını sıkın ve kanülü ve hortumu Tyrode solüsyonuyla yıkamak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın.Kanül tutucuyu bir basınçlı miyograf odasının mikro manipülasyonu üzerine monte edin. Deney için bir fare kalbi toplamak için, önce içine bir çift girin, anestezi uygulanmış sekiz ila 16 haftalık bir C 57 siyah altı fareye 500 mikrolitre heparin enjekte edin. 10 dakika sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtılmış bir yatağa yerleştirin ve pençeleri etiketleme bandı ile sabitleyin.Karın derisinde, diyaframın üzerinde bir kesi yapmak için forseps ve cerrahi makas kullanın ve kalbin göğüs boşluğundan diseksiyonuna izin vermek için diyaframı ve sternumu kesin. Kalbi buz gibi Tyrode'un 30 milimolar BDM içeren solüsyonuna yerleştirin ve gerektiğinde kalpteki tüm bağ dokularını çıkarın. Daha sonra kalbi, 30 milimolar BDM ile desteklenmiş taze Tyrode solüsyonu ile doldurulmuş, önceden soğutulmuş bir diseksiyon odasına yerleştirin.Septal arteri kanülasyona hazırlamak için servo pompayı açın ve servo kontrolör basıncını akış moduna ayarlayın. Kalpte PDMS üzerine, dokunun orta bölgesine zarar vermemeye dikkat edin ve dokuyu diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Kulakçıklardan birini veya her ikisini de çıkarın ve sağ ventrikülü kesin.Sağ ventrikül serbest duvarını çıkarın ve septal arteri açığa çıkarın. Septal arterin etrafına gevşek bir düğüm atmak için 30 mikrometre çapında bir naylon iplik kullanın. Sol ventrikül serbest duvarını çıkarmak için ince makas kullanın ve papiller kas preparatını deney odasına aktarın.Septal artere bir kanül yerleştirmek için bir mikro manipülatör kullanın ve kanülü dikişle sabitleyin. Daha sonra, kanülün ucu arteriyel duvara paralel olacak şekilde papiller kası oda tabanına sabitlemek için pimler kullanın, böylece damar sisteminin net bir görünümü elde edilebilir ve solüsyonu kanülden kademeli olarak akıtmak için şırıngayı kullanın. Doku preparatını stabilize etmek için, peristaltik bir pompayı açın ve preparatı dakikada üç ila dört mililitre akış hızında önceden gazlanmış fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile sürekli olarak süper kaynaştırın, süperfüzyon çözeltisi için sıcaklık kontrol cihazını açın ve banyo süper füzyonunun sıcaklığını 35 ila 37 santigrat dereceye ayarlayın.Kanülü servo pompaya bağlayın ve basıncı yaklaşık 10 milimetre cıvaya ayarlamak için akışı ayarlayın. Süperfüzyonun yaklaşık 10 dakika çalışmasına izin verin, ardından arter basıncını yaklaşık 60 milimetre cıvaya ayarlamak için luminal çözeltinin akışını artırın ve numunenin izleme ile 30 ila 60 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Numuneyi buğday tohumu aglütinini ile doldurmak için, preparatı 100 mikrogram Alexa Fluor-488 Konjuge Buğday Tohumu Aglütinini ile takviye edilmiş beş mililitre Tyrode çözeltisi ile perfüze edin.30 dakika sonra, perfüs yardımını normal Tyrode solüsyonuna geri değiştirin ve konfokal mikroskop sistemini açın. İletilen ışık modunda septal arteri bulmak için mikroskobu daha düşük bir büyütme gücünde kullanın ve bu dönen disk konfokal ile görüntülemeye başlayın. 40X objektif büyütme ve 488 nanometre uyarma lazeri seçin ve lazer yoğunluğunu ve örnekleme hızını ayarlayın.Görüntüleme aralığını tanımlamak için, mikroskop için üst ve alt görüntüleme konumlarını ayarlayın ve adım boyutunu ve Z-yığını görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Ardından, görüntüyü saklamak için bir klasör seçin ve görüntüleri kaydetmeye başlamak için çalıştır'a tıklayın. Vasküler lümene bir floresan vasküler markör perfüze edildiğinde, yüksek hızlı konfokal mikroskopi kullanarak tüm vasküler ağaçları görselleştirmek mümkündür.Daha fazla büyütme, kılcal damarın ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar. Lümenden pinacidil ve ATP'ye duyarlı potasyum kanal agonisti servis edildiğinde arterlerin çapı artar. Vazokonstriktör endotelin lümenden bir tane uygulandığında.Arterin çapı azalır. Akış seti sabit olduğunda, lümen basıncı artar. NG iki DS kırmızısını eksprese eden transgenik bir fareden alınan papiller dokunun bu görüntülerinde, hem kılcal damarlar hem de perisitler, canlı hayvanların fizyolojisini daha iyi taklit eden koşullar altında papiller kas dokusu içinde görselleştirilebilir.Prosedür sırasında herhangi bir noktada boru içinde kabarcık bulunmaması önemlidir. Bu yöntemi optik görüntüleme teknikleriyle birleştiren preparat, floresan teknolojisi transgenik fareler kullanılarak kalpteki mikrosirkülasyonu ve farklı hücre tipleri arasındaki hücreler arası iletişimi incelemek için kullanılabilir.

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.

Kardiyak Morfoloji Ekokardiyografik ve histolojik muayene fare

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Bu çalışmada, fare kalbinin sol ventrikül fonksiyonel parametrelerini ölçmek için kapsamlı bir kardiyovasküler manyetik rezonans görüntüleme (CMR) protokolü açıklanmaktadır. Protokol, CMR görüntülerinin alımını, işlenmesini ve analizini ve farklı kardiyak fonksiyonel parametrelerin değerlendirilmesini açıklar.

Kardiyovasküler Manyetik Rezonans Görüntüleme ile Fare Kalbi Sol Ventrikül fonksiyonu, Miyokard Zorlanması ve Hemodinamik Kuvvetlerin Nicelemesi

Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin fare kalbinde kılcal damarlar, arterioller ve perisitlerin dinamik ölçümü ve görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler fizyoloji ve mikrosirkülasyon araştırmalarında değerli bir platform sunar.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet