Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Bu yöntem, arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının ex vivo izlenmesi yoluyla canlı murin, kalp dokusu ve vasküler ağaç bileşenlerinde koroner mikrosirkülasyonu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, kalp içindeki perisitlerin ve reaktiflerin mikrosirkülasyonunun işlevini incelemek için yararlı bir platform sağlar, böylece vasküler çapı ve arteriol luminal basıncını ölçme eğilimindeyiz. Deney için bir kanül hazırlamak için, tek bir temiz borosilikat cam tüpten uzun ince uçlu iki kanül üretmek için bir mikropipet çektirme kullanın.

Her kanülün ucunu 100 ila 150 mikrometre arasında bir son uç çapına kesmek için ince bir makas ve diseksiyon mikroskobu kullanın ve keskin kenarları hafifçe yuvarlamak için uçları ateşle parlatın. Kanülü şaft boyunca yaklaşık 45 derecelik bir açıyla bükmek için şaftın yan tarafına, uçtan yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirilmiş bir platin tel kullanın ve kanülün açık ucunu kanül tutucusuna yerleştirin. Ardından, bağlantı parçasını sıkın ve kanülü ve hortumu Tyrode solüsyonuyla yıkamak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın.

Kanül tutucuyu bir basınçlı miyograf odasının mikro manipülasyonu üzerine monte edin. Deney için bir fare kalbi toplamak için, önce içine bir çift girin, anestezi uygulanmış sekiz ila 16 haftalık bir C 57 siyah altı fareye 500 mikrolitre heparin enjekte edin. 10 dakika sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtılmış bir yatağa yerleştirin ve pençeleri etiketleme bandı ile sabitleyin.

Karın derisinde, diyaframın üzerinde bir kesi yapmak için forseps ve cerrahi makas kullanın ve kalbin göğüs boşluğundan diseksiyonuna izin vermek için diyaframı ve sternumu kesin. Kalbi buz gibi Tyrode'un 30 milimolar BDM içeren solüsyonuna yerleştirin ve gerektiğinde kalpteki tüm bağ dokularını çıkarın. Daha sonra kalbi, 30 milimolar BDM ile desteklenmiş taze Tyrode solüsyonu ile doldurulmuş, önceden soğutulmuş bir diseksiyon odasına yerleştirin.

Septal arteri kanülasyona hazırlamak için servo pompayı açın ve servo kontrolör basıncını akış moduna ayarlayın. Kalpte PDMS üzerine, dokunun orta bölgesine zarar vermemeye dikkat edin ve dokuyu diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Kulakçıklardan birini veya her ikisini de çıkarın ve sağ ventrikülü kesin.

Sağ ventrikül serbest duvarını çıkarın ve septal arteri açığa çıkarın. Septal arterin etrafına gevşek bir düğüm atmak için 30 mikrometre çapında bir naylon iplik kullanın. Sol ventrikül serbest duvarını çıkarmak için ince makas kullanın ve papiller kas preparatını deney odasına aktarın.

Septal artere bir kanül yerleştirmek için bir mikro manipülatör kullanın ve kanülü dikişle sabitleyin. Daha sonra, kanülün ucu arteriyel duvara paralel olacak şekilde papiller kası oda tabanına sabitlemek için pimler kullanın, böylece damar sisteminin net bir görünümü elde edilebilir ve solüsyonu kanülden kademeli olarak akıtmak için şırıngayı kullanın. Doku preparatını stabilize etmek için, peristaltik bir pompayı açın ve preparatı dakikada üç ila dört mililitre akış hızında önceden gazlanmış fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile sürekli olarak süper kaynaştırın, süperfüzyon çözeltisi için sıcaklık kontrol cihazını açın ve banyo süper füzyonunun sıcaklığını 35 ila 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Kanülü servo pompaya bağlayın ve basıncı yaklaşık 10 milimetre cıvaya ayarlamak için akışı ayarlayın. Süperfüzyonun yaklaşık 10 dakika çalışmasına izin verin, ardından arter basıncını yaklaşık 60 milimetre cıvaya ayarlamak için luminal çözeltinin akışını artırın ve numunenin izleme ile 30 ila 60 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Numuneyi buğday tohumu aglütinini ile doldurmak için, preparatı 100 mikrogram Alexa Fluor-488 Konjuge Buğday Tohumu Aglütinini ile takviye edilmiş beş mililitre Tyrode çözeltisi ile perfüze edin.

30 dakika sonra, perfüs yardımını normal Tyrode solüsyonuna geri değiştirin ve konfokal mikroskop sistemini açın. İletilen ışık modunda septal arteri bulmak için mikroskobu daha düşük bir büyütme gücünde kullanın ve bu dönen disk konfokal ile görüntülemeye başlayın. 40X objektif büyütme ve 488 nanometre uyarma lazeri seçin ve lazer yoğunluğunu ve örnekleme hızını ayarlayın.

Görüntüleme aralığını tanımlamak için, mikroskop için üst ve alt görüntüleme konumlarını ayarlayın ve adım boyutunu ve Z-yığını görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Ardından, görüntüyü saklamak için bir klasör seçin ve görüntüleri kaydetmeye başlamak için çalıştır'a tıklayın. Vasküler lümene bir floresan vasküler markör perfüze edildiğinde, yüksek hızlı konfokal mikroskopi kullanarak tüm vasküler ağaçları görselleştirmek mümkündür.

Daha fazla büyütme, kılcal damarın ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar. Lümenden pinacidil ve ATP'ye duyarlı potasyum kanal agonisti servis edildiğinde arterlerin çapı artar. Vazokonstriktör endotelin lümenden bir tane uygulandığında.

Arterin çapı azalır. Akış seti sabit olduğunda, lümen basıncı artar. NG iki DS kırmızısını eksprese eden transgenik bir fareden alınan papiller dokunun bu görüntülerinde, hem kılcal damarlar hem de perisitler, canlı hayvanların fizyolojisini daha iyi taklit eden koşullar altında papiller kas dokusu içinde görselleştirilebilir.

Prosedür sırasında herhangi bir noktada boru içinde kabarcık bulunmaması önemlidir. Bu yöntemi optik görüntüleme teknikleriyle birleştiren preparat, floresan teknolojisi transgenik fareler kullanılarak kalpteki mikrosirkülasyonu ve farklı hücre tipleri arasındaki hücreler arası iletişimi incelemek için kullanılabilir.