Name: Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Keşfedin sıçan Peyer yamalarında lenfosit dinamiğinin in vivo mikroskobik gözlemi. Bu yöntem, inflamatuar koşullarda bağışıklık hücrelerinin davranışlarını uzun süreli izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Savunma Tıp Koleji'nden ve Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'nın inatçı hastalıklarla ilgili araştırmalar için sağlık ve çalışma bilimleri araştırma hibesi ile desteklendi.

Deneysel protokol, Ulusal Savunma Tıp Koleji Hayvan Araştırma Komitesi (no. 16058) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar standart laboratuvar yemeklerinde (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japonya) muhafaza edildi. Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak tedavi edildi.
1. Lenfositlerin toplanması ve ayrılması
NOT: Lenfositler taze olması ve depolanamaması gerektiğinden, her deney için sıçanlardan toplanmalıdır. Ek olarak, bağırsak-tropik lenfositler doğrudan dolaştıkları torasik kanaldan toplanmalıdır. Tüm prosedürlerin 6 saat içinde tamamlanması beklenir ve tüm aletler, eldivenler ve yüzeyler temizdir. Hayvanları fizyolojik olarak stabil bir durumda tutmak için, deneyde kullanılan tüm tuzlu su ve diğer sıvılar sıcak tutulmalıdır.
<ol><li>Sıcak suya (yaklaşık 80-90 °C) batırdıktan sonra heparin eğrisi (yaklaşık 5 mm yarıçapı) gibi bir kavis tüpü (1 mm çapında) oluşturur ve birkaç saat önceden yapışkan bant kullanarak plastik bir tahtaya sabitleyin.</li>
	<li>Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ve Betulphar (2.5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile erkek bir Wistar sıçanını (8-12 hafta) uyuşturun ve bir saç kesme makinesi kullanarak karnın vücut kıllarını kesin. Tıraş olduktan sonra saçları sıkıca çıkarın, böylece saç karın boşluğuna girmez.</li>
	<li>İşlem için gerekli olan sabit anestezi derinliğinin parmak sıkışması ile elde edildiğini doğruladıktan sonra orta çizgiden sol altkozal bölgeye yatay olarak cerrahi makasla bir kesi yapın. Işık altındaki damarları izleyerek parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Mideyi ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için mideyi hafifçe vücudun dışına doğru hareket ettirin. Cerrahi makas kullanarak omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına bir çentik yerleştirin ve parmaklarla açıkça ayırın.</li>
	<li>Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Fazla bağ dokusu yaşla birlikte artar. Torasik kanalın 20 mm uzunluğu görünene kadar diyaframın sol haçlarının hemen altından kaudally olarak ortaya çıkın. Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki yapışıklıkları hafifçe ayırın.<ol>
<li>Bu işlemi dikkatlice gerçekleştirin, çünkü bazı sıçanlar, lenf pleksusunun (örümcek ağları gibi yayılan küçük torasik kanallar) daha yüksek bir konumu nedeniyle torasik kanal veya kısa bir torasik kanal üzerinden geçen karın arterinden dallanma arteriküllerine sahiptir. Ödemi önlemek için torasik kanala gereksiz temastan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diyaframın sol haçlarının hemen altındaki torasik kanala bir dize (3-0 ipek) ile bir bağ uygulayın. Kaudal torasik kanal distended olur.</li>
	<li>Cerrahi makasın kesme kenarını bıçaklayarak karın duvarında bir delik (5 mm çapında) yapın, saç tokası kavisli kavis tüpünü geçirin ve tüpü bir noktada iliopsoas kasında lige edin. Kanülasyon tüpünü 10 U/mL heparin içeren normal salin ile doldurun.</li>
	<li>Distended torasik kanalın altına bir ip (3-0 ipek) yerleştirdikten sonra, torasik kanalı bir kanülasyon tüpünün keskin bir şekilde kesilmiş kenarıyla bıçaklayın, kuyruğa doğru yaklaşık 5 mm'lik bir şekilde kanülasyona doğru kanülat ve sabitleme için torasik kanalı kanülasyon tüpü ile kesin.</li>
	<li>Dehidrasyonu önlemek için salin sağlamak için, hassas cımbız kullanarak mide karıncalanmasının ön duvarında bir delik (3 mm çapında) oluşturun ve silikon tüpü (2 mm çapında) pirorik halkadan duodenuma geçirin. Bir yarayı diktikten ve Bollman'ın kafeslerindeki hayvanların bakımını yaptıktan sonra, silikon tüpten her sıçanın duodenumuna 3 mL / s akış hızında şeker yüklü salin aşılamaya başlayın. Tüm kafesi sıcak tutmak için bir kağıt havlu ile örtün.</li>
	<li>Kanülasyon tüpünü, 6 U/mL heparin, %10 fetal sığır serumu ve RPMI 1640 ortamı (pH 7.4; malzeme tablosuna bakın) içeren buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpün kapağının ortasındaki deliğe sabitlayın ve buz üzerinde torasik kanal lenfositleri (TDL' ler) toplayın. Tüpün içindeki fibrin pıhtı oluşumuna bağlı olarak kanüle edilmiş tüp tıkanıklığını önlemek için tüpün ucunu konik tüpün duvarına temas etmemeye dikkat edin. Yaklaşık 1.0 x 10 8 ~109lenfosit içeren lenf sıvısı (yaklaşık20 mL) 6 saat içinde elde edilebilir. Lenfositleri tam anestezi altında elde etmek için anestezi düzlemi izlenir ve lenf akışı uygun şekilde gözlenir. Aynı anestezikler, sıçanlar Ballman'ın kafesine konduktan yaklaşık 3 saat sonra 6 saat boyunca sürekli derin anestezi elde etmek için aynı dozda eklenir.</li>
</ol>2. Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDSE) ile lenfosit etiketleme
<ol><li>CFDSE'yi(Malzeme Masası)dimetil sülfit (DMSO) ile 15,6 mM (60 μL DMSO'da çözünmüş 500 μg CFDSE) ile çözün.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 30 dakika boyunca50 μLCFDSE çözeltisi ile 50 mL RPMI 1640'ta inkübte lenfositler (1 x 108~10 9).</li>
</ol>3. Mikrovasküler çalışmalar için deneysel kurulum
<ol><li>Alıcı sıçanları (8-12 hafta) Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) ve Betulphar (2,5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezinin derinliğini parmak sıkışması ile onaylayın. Saç kirlenmesini en aza indirmek için kürkü tımar etmeden önce karnı ıslatın. Daha sonra alıcı Wister sıçanının karnını orta çizgi kesiğiyle açın.</li>
	<li>Merkezin etrafında cam bir slaytla (24 x 50 mm) kaplı dikdörtgen deliği olan taşınabilir paslanmaz çelik bir plakaya (yaklaşık 120 x 300 mm) bir sıçan koyun. Gözlem için PP'ler de dahil olmak üzere ileal segmentin yaklaşık 10 cm'sini seçin.</li>
	<li>Bağırsağı mümkün olduğunca sıcak tutun ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C'ye ısıtılır. İnce bağırsağı PBS ile örtmek için kullanılan gazlı bezi ıslatın.</li>
	<li>% 2 izofluran ile sürekli anestezi verirken (bkz. malzeme tablosu), slaytı mikroskop sahnesine koyun ve bazı HEV'lerin serosadan geçtiği PP'lerde mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygun alanları seçin. PEN'lerin boyut aralığı; daha büyük olanlar CLSM kullanarak mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygundur. İnce bağırsak yerlerde düz değildir; herhangi bir gerginlik olmadan en az 2 cm uzunluğunda düz bir segment gözlem için uygundur.</li>
	<li>Bitişik bağırsak segmentini ve mezentery'yi PBS ile ıslatılmış emici pamukla örtün. Bağırsak segmentini iki yuvarlanmış pamuk topu arasına yerleştirin ve sıçanın kalp atışı ve solunumu tarafından titreşmesini önlemek için sıçanın vücudundan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.</li>
	<li>1 mL şırıng kullanarak, alıcı sıçanların şahdamarına cfse etiketli TDL'leri (1 x10 8 hücre) yavaşça enjekte edin. Hızlı bir intravenöz enjeksiyon sistemik dolaşımı etkileyebilir.</li>
</ol>4. Lenfositlerin mikrositülasyonu
<ol><li>CLSM kullanarak PP'lerin mikrovaskülatındaki TDL'leri sürekli izleyin ve 30 s aralıklarla hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak bir bilgisayarda 3 saat boyunca kayıt yaptırın. Serosadan PP'lerin HEV'sine kadar olan derinlik yaklaşık 25 μm'dir ve stroma ve kılcal lenf damarlarının 30 μm derinliğe kadar gözlemlenmesine olanak tanır.</li>
	<li>Kan dolaşımını lekelamak için her alıcı sıçanın şahdamarına Texas Red-dektran (25 mg/kg) ve hücre çekirdeğini lekelamak için Hoechest 33342 (5 mg/kg) enjekte edin.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Lenfosit dinamiklerini ölçmek için, HEV'lere bağlı kalan lenfositleri 30 saniyeden fazla "yapışkan lenfositler" ve HEV'lerden stroma'ya göç eden lenfositleri ''lenfositler' olarak tanımlayın. Daha sonra görme alanı başına ortalama göç yüzdesini (göç eden lenfositler / yapışkan lenfositler + göç eden lenfositler) hesaplayın (yaklaşık 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol><li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li>
<li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li>
<li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li>
<li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li>
<li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver%2C+small+intestine%2C+or+thoracic+duct+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li>
<li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer%27s+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li>
<li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer%27s+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%22Kaede%22+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li>
<li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+of+Infected+Peyer%27s+Patches+Arises+From+Global%2C+Interferon-Receptor%2C+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li>
<li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li>
<li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer%27s+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li>
<li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy%3A+Visualizing+Immunity+in+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity%3A+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada naif gut-tropik lenfositlerin toplanması ve sıçan PP'lerinde göçlerinin gözlemlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu prosedürler, lenfositlerin PP'lerin mikrovaskülürinde nasıl hareket ettiğini ortaya getirebilir ve dinamiklerini normal veya ilaçlı bir durum altında görsel olarak karşılaştırmayı mümkün kılabilir. Gözlem süresi sadece birkaç saatle sınırlı olmasına rağmen, bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, bazı ilaçlar tarafından immünolojik modifikasyon için bir ipucu elde etmek için çok değerlidir.
<p...

Peyer'in yamaları (PP'ler) ince bağırsağın lamina propriasında yüzlerce lenfoid folikülden oluşur. PP'ler foliküllere, foliküller bölgeye ve lenfositlerin antijen sunumu ile uyarıldığı foliküllerin alt kısmında bulunan germinal merkezlere ayrılır. Farklı lenfatik damarlar yoktur ve antijenler epitel hücre tabakası yoluyla bağırsak lümeninden lamina propriasını istila eder. Lenfoid folikülleri kapsayan epitel bölgesine, özel serpiştirilmiş M hücrelerinin mukozal antijenleri aldığı folikül ilişkili epitel denir. M hücreleri luminal taraftan antijenleri alır ve antijenler daha sonra dendritik hücreler tarafından yakalanır ve yüksek endotel venules (HEV' ler) endotel yoluyla PP'lere akan naif lenfositlere doğru sunulur1. PP'ler bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynar ve iltihabın erken evresi ile ilgilidir. Birçok moleküler etkileşim, lenfositlerin yapışma molekülleri, kemokinler 2,3ve sphingosine-1-fosfat4dahil olmak üzereikincil lenfoid organlara (SLO' lar) girişini içerir; bu nedenle, beklenen birçok terapötik hedef vardır. Bu nedenle, PP'lerdeki lenfosit dinamiklerini gözlemlemek, iltihabın çok erken aşamasına bir göz atmamızı ve umut verici birkaç ilacın yararlılığını incelememizi sağlar.
Buradaki yöntem, PP'lerde lenfositlerin göçüne odaklanır, bu da çeşitli prosedürleri içerir (torasik kanal5'e öykünme ve lenfositlerin toplanması ve toplanan lenfositlere enjeksiyondan sonra uzun süreli gözlem). Bu prosedürler karmaşık olduğundan ve önceki raporlarda her prosedürün tam olarak nasıl yapıldığını görmek zor olduğundan, başarılı bir gözlem elde etmek için burada bazı ipuçlarından bahsettik. Örneğin, tüplerin torasik kanala girebilmesi çok zordu ve ilk başarı oranı% 50'den azdı. Bununla birlikte, yöntemi geliştirdik ve% 80'i aşan bir başarı oranı elde ettik. Bu yazıda, lenfositlerin transendotelit göçünün çeşitli koşullar altında nicel olarak değerlendirilmesini sağlamak için başarılı gözlem için gerekli olan diğer bazı ipuçlarından bahsetmiştir.
Önceki raporlarda, PPs6'nındamar yapısını leke etmek için Hindistan mürekkebinin intravenöz enjeksiyonu veya mikroskop monofokal7gibi zamandaki üç boyutlu değişiklikleri anlamak zordu. Son yıllarda, Kaede fareleri gibi bazı foto-dönüşümlü floresan protein transgenik hayvanlar kullanılarak gözlemsel bir yöntem, sistematik hücresel hareketleri netleştirdi vivo8. Diğer çalışma, CD69 lenfosit çıkışlarının PPs9'danbağımsız olarak kapatılmasını açıklığa kavuşturdu. Yüksek analitik özelliği nedeniyle konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullandık. Artık yüksek çözünürlüklü görüntüleri kolayca elde edebilir ve lenfosit dinamiklerini analiz etmek için kullanabiliriz.
Bu olguda PP'lerde lenfosit göçünün değerlendirilmesi için bir dizi yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, lenfositleri toplamak için torasik kanal cannülasyonunun rafine yöntemlerini gösterdik. İkinci olarak, gözlemsel yöntemleri mikroskobik gözlem altında mümkün olduğunda objektif organları korumak için çeşitli şekillerde geliştirdik ve 3 saat boyunca yüksek kaliteli görüntüler elde etmemizi sağladık. Üçüncü olarak, bazı ilaçların etkilerini değerlendirmek için lenfosit göçünün hücresel hareketlerini ölçtük. Bu değiştirilmiş protokoller mukozal immünoloji değerlendirmelerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td>A1R +</td> <td>Nikon</td><td></td><td>Komfokal Lazer Tarama Mikroskobu</td></tr><tr><td>Karboksifloresein diasetat süksinimidil ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Teksas Kırmızısı&ndash; dekstran</td><td>Termo Balıkçı Bilimsel</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

sıçan peyer yamalarında lenfosit dinamiği mikroskobik gözlemi

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Naif lenfositler fizyolojik durum altında kandan lenfoid dokulara sirkülasyon yapar ve genellikle bağırsak bağışıklığında önemli bir fenomen olarak kabul edilir. Peyer yamaları (PP'ler) veya mezenterik lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organların stroma'sı, naif lenfositlerin antijenleri algıladığı yerdir. Naif lenfositler, PP'lere giriş portalı olan yüksek endotel venule'lere ulaşmak için kan dolaşımında dolaşır. Bazı immünomodülatörlerin lenfosit göçini etkilediği tahmin edilmektedir, ancak mikrositülasyon dinamiklerinin kesin olarak değerlendirilmesi çok zordur ve lenfosit göçini in vivo olarak gözlemlemek için bir yöntem oluşturmak kesin mekanizmaların netleşmesine katkıda bulunabilir. Lenf kanalından lenfosit toplama ve sıçan PP'lerindeki bağırsak-tropik lenfositlerin ayrıntılı dinamiklerini gözlemleme yöntemini iyileştirdik. Fare PP'lerini in vivo olarak gözlemlemek için konfokal lazer tarama mikroskopisini seçtik ve zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanarak kaydettik. Artık lenfosit dinamiklerinin analizine katkıda bulunabilecek net görüntüler elde edebiliriz.

Lenfositlerin lenfositlerden toplanması Sıçanı torasik kanal cannülasyonuna hazırlamak için, Şekil 1'de gösterildiği gibi gergin torasik kanala bir kesi yapın ve daha sonra sıçanı Şekil 2'degösterildiği gibi bir Bollman'ın kafesinde muhafaza edin.
Lenfositler iyi toplandığında, yaklaşık 107~ 10 8 / mL lenfosit içeren yaklaşık 20 mL /6h lenf sıvısı elde edebiliriz. TDL'lerin% 70'i CD4'ü, aralar...

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

Bu protokol, sıçan Peyer yamalarında lenfosit dinamiklerinin uzun süreler boyunca in vivo gözlemini gerçekleştirmeyi mümkün kılar. Çeşitli izlerin in vivo olarak lenfositler üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir tıp doktoru olan Kazuki Horiuchi olacak.Bir kanülasyon tüpü oluşturarak ve sıcak suya batırarak başlayın, ardından bükün ve yapışkan bantlı plastik bir tahtaya sabitleyin. Bir erkek Wistar sıçanını uyuşturduktan ve karnındaki kılları çıkardıktan sonra, parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat ederek orta hattan sol subkostal bölgeye cerrahi makasla yatay bir kesi yapın. Bağırsağı ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için nazikçe vücudun dışına doğru hareket ettirin.Omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına cerrahi makasla bir çentik yerleştirin, ardından bunları parmaklarınızla köreltin ayırın. Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice sıyırın. Torasik kanalı, diyaframın sol krusunun hemen altından, kanalın 20 milimetresi görünene kadar kaudal olarak açığa çıkarın.Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki y

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı...

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Bu videoda, hasat edilmiş bir fare Peyer'in yamasından lenfositlerin izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilen lenfositler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Bir Fare Peyer Yamasından Lenfositlerin İzolasyonu

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Burada B hücreleri üzerinde çekiş kuvveti mikroskobu deneyleri yapmak için kullanılan bir protokol salıyoruz. Yumuşak poliakrilamid jellerin hazırlanmasını ve işlevselleştirilmesinin yanı sıra mikroskopta veri toplama ve veri analizinin bir özetini anlatıyoruz.

B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu

Keşfedin sıçan Peyer yamalarında lenfosit dinamiğinin in vivo mikroskobik gözlemi. Bu yöntem, inflamatuar koşullarda bağışıklık hücrelerinin davranışlarını uzun süreli izlemeyi sağlar.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Daha fazla video keşfet