ŞekilBağımlı Transkripsiyonları Tek Hücre Düzeyinde Çalışma Yaklaşımı
November 2nd, 2020
Bu makalede, farklı patolojileri temsil eden farklı şekillerde kardiyak miyositlerin yetiştirilmesi ve morfolojilerine göre bu yapışık kardiyak miyositlerin tek hücre düzeyinde sıralanması için yöntemler yer alıyor. Önerilen platform kalp yetmezliği farklı türleri için yüksek iş ve ilaç tarama için yeni bir yaklaşım sağlar.
Hücre şeklinin gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için, tek hücre düzeyinde farklı morfolojilere bağlılıkları büyütme ve sıralama yöntemlerini kullanarak yeni bir platform öneriyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücreleri in vivo'nun farklı şekillerle karşılaştırması teknik olarak zorlayıcı olduğu için hücre şeklinin in vitro olarak yüksek iş artışı çalışmasını kolaylaştırıyor olmasıdır. Desenli bir kardiyomiyosit kültürü kurmak için, sayma için 15 mililitrelik bir tüp ilgi en boy oranı bir kardiyomiyosit süspansiyon transfer ve bir kez 10 için bir kez seyreltilmiş uygun kaplama orta konsantrasyon mililitre başına beş hücre.
Bir fibronectin kaplı mikro desenli çip üzerine hücrelerin iki mililitre ekleyin sıcak kaplama orta iki mililitre içinde batırılmış 35 mililitre Grenier Petri çanak ve 18 saat boyunca 37 derece santigrat derece ve% 5 karbondioksit kuluçka çanak yerleştirin. Ertesi gün, hücrelerin çoğunun bağlı olduğunu doğrulamak için çipi ışık mikroskobuyla kontrol edin. Herhangi bir enkaz ve ya da ölü hücreleri kaldırmak için çanak orta çıkarın ve merkezinden başlayarak ve bir damla akıllıca bir şekilde yanlara doğru hareket, yavaşça hücrelere PBS ekleyin.
Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'yi dört mililitrelik bakım ortamıyla değiştirin ve hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. 72 saat sonra, yonga yüzeyini iki mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile iki kez yıkayın ve yıkanmış çipi hemen yeni bir steril 35 mililitrelik Grenier Petri kabına aktarmak için terlik kullanın. Çipe DPBS'de 1000 kat seyreltilmiş 1,5 mikrolitre canlı dcycle yeşil ekleyin.
Çip üzerinde bir oda sabitve hücre toplayıcı aşamasında çanak tutucu üzerine çanak yerleştirin. Manyetik kapağı takın ve çapraz işareti canlı görünüm penceresinde bulun. Artı işaretine odaklanın ve tarama ve sıralama penceresinde otomatik enjeksiyon için kalibrasyonu seçin ve kalibre edin.
Fibronektin hücreleri gevşetmek ve tarama sekmesini açmak için DPBS çözeltisinde bire bir üçlü E 1,5 mililitre ile çanak supernatant değiştirin. Tüm çipi tarayıp, görüş alanında çipin sol üst köşesine odaklanın ve geçerli mikroskop konumunu alın'ı tıklatın. Daha sonra, çipin sağ alt köşesine odaklanın ve geçerli mikroskop pozisyonunu alın'a tıklayın.
Açılır pencerede, en keskin düzlemi ayarla'yı tıklatın ve sağ üst köşeye gidin ve sol alt köşe düğmelerine gidin'i tıklatın. Ardından, taramaya başlamak için bitiş'i tıklatın. Tarama tamamlandığında, çözümleme sekmesini açın ve çalışma ölçütlerini geçen tek hücreleri seçmek için haritayı göster'i tıklatın.
Cam mikrokapilleri mikroskobun ortasında ki canlı görünümü ortalayın ve pompa sekmesini açın. Bir vakum oluşturmak için, 50 mililitrelik bir numaralı şırınga dört mililitre den piston geri çekin ve sıralama sekmesini açın. Tek bir hücrenin seçilebilmesi için, valfin ikisini 120 milisaniye, valfini ise 200 milisaniyelik bir zaman atlamadan sonra 20 milisaniye boyunca açılacak şekilde ayarlayın.
Seçilen hücrenin lysis tamponunu içeren PCR tüpüne başarıyla teslim edilebilmesi için, vanayı 20 milisaniye, valayı ise 10 milisaniyelik bir zaman atlamadan sonra 10 milisaniye boyunca açılacak şekilde ayarlayın. Valf ayarları ayarlandığında, yolu hesapla'yı tıklatın. Yazılım, seçilen hücreleri çip boyunca toplamak ve enjekte etmek için hücreden hücreye en hızlı yolu hesaplayacaktır.
Daha sonra mikroskobu çip yüzeyindeki bir desenüzerine odaklayın. Mikrokapillerin ucunun en keskin görüntüsünün talaş yüzeyine ve tıklatma setine dokunmadan elde edilebilmeleri için mikrokapilleri dikkatlice aşağı taşımak için joystick'i kullanın. Mikrokapiller kesiti gösteren yeni bir pencere açılacak.
Yazılımın X, Y ve Z koordinatlarında kılcal damarın uç ofsetini kaydetmesi için kılcal damarın tam merkezine tıklayın. Ardından, sıralamayı başlatmak için sıralamaya başlat'ı tıklatın. Seçilmiş tek bir hücreden önceden güçlendirilmiş cDNA'nın bu temsili analizinde, elektropherogramda 1, 852 baz çiftinin tepeye karşılık gelen densitometri çizimi gibi jelde açık bir bant gözlenmiştir.
Parçaların ortalama boyutu 1, 588 baz çifti ve 300 baz çiftinden daha kısa olan az sayıda parça, iyi bir cDNA kitaplığı neslini gösteriyordu. Desenli kardiyomiyositler içindeki sarcomere yapısını değerlendirmek için immünofloresan boyama ve analiz de yapılabilir. Bu platform kalp yetmezliği farklı türde yüksek iş artışı ve ilaç tarama için önünü açıyor.
Genel Bakış
Bu çalışma, tek hücre düzeyinde kardiyak miyositlerin morfolojilerine göre büyütülmesi ve sıralanması için yeni bir platform tanıtmaktadır. Bu yöntem, çeşitli kalp yetmezliği türleri için yüksek verimli ilaç taraması sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak miyositler kültürü
- Hücre morfolojisi analizi
- İlaç taraması metodolojileri
Arka Plan
- Kardiyak miyositler, farklı patolojilerle ilişkili çeşitli şekiller sergiler.
- Hücre şekli etkilerinin gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek in vivo olarak zordur.
- Yüksek verimli teknikler, etkili ilaç taraması için gereklidir.
- Mevcut yöntemler, tek hücrelerin morfoloji temelinde sıralanması ve analizinde verimlilikten yoksundur.
Çalışmanın Amacı
- Hücre şeklinin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir platform geliştirmek.
- Kardiyak miyositlerin morfoloji temelinde sıralanmasını kolaylaştırmak.
- Kalp yetmezliği tedavileri için ilaç taraması süreçlerini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kardiyomiyosit süspansiyonunun hazırlanması ve seyreltilmesi.
- Hücre kültürü için fibronektin kaplı mikro desenli yongaların kullanılması.
- Hücre yapışmasının onaylanması için ışık mikroskobu.
- Tek hücrelerin morfolojilerine göre mikrokapil sistemi kullanılarak otomatik taranması ve sıralanması.
Ana Sonuçlar
- Desenli kardiyomiyositlerin başarılı bir şekilde yapıştırılması ve korunması.
- Sıralanmış tek hücrelerden iyi bir cDNA kütüphanesinin oluşturulması.
- İmmünofloresan boyama, sarkomer yapılarını ortaya çıkardı.
- Platform, yüksek verimli çalışmaları ve ilaç taraması desteklemektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş platform, kardiyak miyositlerin incelenmesi için yeni bir yaklaşım sunar.
- Morfoloji temelinde hücrelerin verimli sıralanmasını ve analizini sağlar.
- Bu yöntem, kalp yetmezliği terapilerinde araştırmayı önemli ölçüde ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
