Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Yöntem protein onayı ve protein etkileşimlerinin ölçülmesini kolaylaştırır. Tampon bileşimi, örnek saflık ve protein konsantrasyonu gereksinimleri, yöntemin zorlu yapısal sorunları ele almasına olanak tanıyan esnektir. Bu teknik, çok çeşitli farklı arabellek sistemlerinde numunelerin sıkıştırılamasına olanak sağlar.

Dozimetri yöntemimizi kullanarak, araştırmacılar etiketleme reaksiyonlarının gerçek zamanlı olarak ne kadar iyi çalıştığını izleyebilirler. Araştırmacıların çok farklı ilaç formülasyonlarını ve bunların protein yapısını nasıl etkilediğini test etmelerine olanak sağladığı için bu teknolojinin bir uygulaması ilaç geliştirme aşamasındadır. FPOP optik tezgah hazırlamak için.

Önce lazeri açın ve lazeri harici tetikleyiciye, sabit enerjiye ve gaz değişimine ayarlayın. Lazer ısındığında, darbe başına lazer enerjisini darbe başına 80 ila 120 miligrama ayarlayın ve ara dosimetrenin lazer maruziyetinden sonra 265 nanometrede emici sinyali okuyacağı noktada kılcal damarın poliimid kodlamasını hafifçe yakmak için bütan meşalekullanın. Kılcal damardaki enkazı nazikçe silmek ve temizlenmiş kılcal damarı lazerin ışın yolundan ve sıra lı dosimetreye yerleştirmek için tüy bırakmayan bir mendil ve metanol kullanın.

Menteşeyi açmak ve manyetik tutucuları çıkarmak için satır lı dosimetrenin üstündeki kolu basın. Kapilleri, kapilleri yerinde tutmak için manyetik tutucuları kullanarak sıralı dosimetrenin makine oluğuna kılcal damarı yerleştirin ve kol kilitlenene kadar menteşeyi bastırarak doktora menteşesini kapiller üzerine kapatın. Dozimer lazeri ateşlemeye başlamak için dozimetri yazılımındaki başlangıç flash düğmesini tıklayın ve lazer ateşleme ile dozimetri yazılımında 10 ila 20 Hertz arasında önceden ayarlanmış tekrarlama oranını ayarlayın motorlu sahneyi hareket menzili boyunca hareket ettirin, kirişin diyafram üzerinde ortalanmış kalmasını ve kılcal damarın siluetinin boyunca gözlemlenebilmesini sağlar.

Sonra en az bir dakika boyunca dakikada 20 mikrolitre su ile kılcal floş ve veri toplama başlamadan önce suya dosimetre sıfır dosimetre yazılımı nda veri artı otomatik sıfır başlat'ı tıklatın. Bir FPOP deneyi gerçekleştirmek için 18 mikrolitre FPOP çözeltisine iki mikrolitre hidrojen peroksit ekleyin ve çözeltiyi yavaşça karıştırarak çözeltiyi hızla karıştırarak solüsyonu merkezleme ile tüpün dibinde toplayın ve çözümü şırınga pompasına yüklemek için hemen gaz geçirmez bir şırınga kullanın. Uygun akış hızında şırınga pompası üzerinde akış başlatmak ve 265 nanometre emici sinyal bir atık konteyner içinde numune toplama stabilize kadar gerçek zamanlı adenin okuma izlemek için satır içi dosimetre kullanmak için dosimetre yazılımı başlat ve veri başlatmak tıklayın.

Önceden ayarlanmış tekrarlama hızı sonunda lazer ateş başlatmak için dosimeter yazılımında başlat flash düğmesine tıklayın ve gerçek zamanlı adenin okuma izlemek için satır içi dosimetre kullanın. Lazer kapalı ve lazer kapalı 265 nanometre de emicilik farkı 265 nanometre okuma delta emiciler olacaktır. Karşılaştırılabilir hidroksil radikallerinin farklı numuneler arasında proteinlerle reaksiyona açık olmasını sağlamak için.

Delta emicileri 265 nanometre okumada elde edilen satır salametre ile önceki deneylerden veya kontrollerden elde edilen 265 nanometre okumadaki delta emicileri arzu ile karşılaştırın. Okuma istenilen düzeyde ise söndürme tampon lazer veya radyasyon hemen sonra örnek toplamak. Emicilik okumaları eşitlemek için etkili radikal dozu dengelemek için hidrojen peroksit konsantrasyonu değiştirmek, darbe başına lazer enerjisini değiştirmek veya lazer fluence artırmak için odaklama lens odak düzlemi değiştirmek.

Delta emiciler okuma 10'dan büyük bir milli emme birimi değişiklik yapmak için daha fazla veya daha az hidrojen peroksit ile örnek yeniden ve gösterildiği gibi örnek yeniden. Gerçek zamanlı olarak emici okumaküçük bir değişiklik yapmak için, olay ışınının odak düzlemini ayarlamak için odaklama lens konumunu ayarlamak için 50 milimetre motorlu sahne kullanın. Lazer radyasyonu sonrası numunede bulunan hidroksil radikalin etkin miktarını ölçmek için adenin delta emicileri gerçek zamanlı olarak 265 nanometrede, motorlu sahneyi kullanarak motorlu uv kılcal dedektörü ile delta emiciler 265 nanometre okumadaki delta emicilere kadar ayarlamak istenilen okumaya eşittir.

Adilumumab biyobenzerinin fosfat tamponundaki ağır zincir peptid ayak izinin bir saat boyunca 55 santigrat derecede ısıtılmasının karşılaştırılması, protein agrega oluşturmak için ısıtıldığında belirtilen peptit bölgelerinin çözücülere karşı önemli bir koruma gösterdiğini ortaya koymaktadır. Lazer veya radyasyon öncesi ve sonrası adenin emiciler arasındaki farkı izlemek için gerçek zamanlı olarak bir inline dosimetre kullanılması, fosfat tamponu ile karşılaştırıldığında MES tamponunda karşılaştırılabilir bir değişim gözlendiğini gösterir. Peptidlerin ortalama oksidasyonu FOsfat tamponuna göre MES tamponu varlığında daha düşük iken.

Ancak, lazer fluence eşit adenin dozimetri yanıtı için artırılır gibi ortalama peptit oksidasyon değerleri FPOP ve MES tampon ve fosfat tampon sonra hemen hemen aynıdır. Dozimetri okuma lazer fluence peroksit konsantrasyonu yanı sıra radikal çöpçü etkilenir gibi. Örnek anket arasındaki dozimetri yanıtının birbirine yakın olduğuna dikkat edin.

Site yönelimli mutagenez genellikle FPOP korunan siteleri araştırmak için kullanılır. Bu, araştırmacıların değişikliklerin Alistair'den kaynaklanmaktadır olup olmadığını belirlemelerine olanak tanır. Bu teknik, farklı tamponlarda veya formülasyonlarda proteinlerin karşılaştırılmasını kolaylaştırır ve araştırmacıların farklı katkı maddelerinin protein onayına etkisini belirlemelerine olanak sağlar.