Name: Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Öğrenin floresan boyalı lipozomların akış sitometrisi ile in vivo hücresel alımını değerlendirme yöntemini. Bu protokol ilaç teslimatı ve hücre biyolojisi araştırmalarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Michael Solga'ya ve Flow Cytometry Core personelinin geri kalanına akış sitometrisi eğitimi ve hizmetleri sağladıkları için teşekkür etmek ister. Yazarlar ayrıca Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye ve Prasad Srikakupu'ya lipozom hazırlama (SSKD, DKB), doku hasadı (MAM, JCG) ve akış sitometri boyama ve numune edinme (AU, PS, CM) konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 ve R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 ve T32 HL007284 hibeleri ile desteklenmiştir.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada (i) floresan lipid boyası ile etiketlenmiş ve bir anti-diyabetik bileşik olan tesaglitazar ile yüklenmiş lipozomlar hazırlamak, (ii) retro-orbital enjeksiyon yoluyla bir fareye lipozomlar uygulamak ve (iii) akış sitometrisi ile hücresel düzeyde lipozom alımını tespit etmek için dokuları toplamak, işlemek ve lekelemek için üç bölümlü bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, yaklaşık 150-μm lipozomların hazırlanmasını ve yağ, kan ve dalaktaki alımın değerlendirilmesini gözden geçirir. Lipozom preparatı ölçeklenebilir, çoğunlukla oda sıcaklığında gerçekleştirilir ve ilaç yüklemesini ve organik çözücülerin uzaklaştırılmasını en üst düzeye çıkarmak için ters faz buharlaştırmasını kullanır. Bu protokolü kullanarak, saflaştırılmış lipozom numunesinde 2 mg / mL'ye kadar tesaglitazar konsantrasyonu elde edilebilir. Hazırlanan lipozomlar HEPES tamponunda 4 °C'de bir yıldan fazla saklanabilir. Deneyimlerimize göre, ortalama parçacık boyutunun minimum varyasyonunu gösterdiler. İlaç içeriği kaybının% 10'undan azı, lipozomların 10 kDa santrifüj filtre ile harici ilaçtan ultrafiltrasyon ile ayrılmasını takiben spektrofotometrik olarak gösterilmiştir.
Lipozom hazırlığı sırasında, dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar ve faktörler vardır. İlk olarak, protokol adımlarının sırası önemlidir ve bunlara uyulmalıdır. İkincisi, tesaglitazar yüklenirken kullanılan çözeltinin pH'ı, çözünürlüğü ve etkili yüklemeyi en üst düzeye çıkarmak için 7.4'te tutulmalıdır. Üçüncüsü, ekipman ve filtrelerin uygun şekilde monte edilmesi, her adımın çıktısının uygun boyutta ve saflıkta olmasını sağlar. Örneğin, 100 ve 200 nm filtreler düzgün bir şekilde monte edilmezse, daha heterojen ve uygun olmayan boyutta bir lipozom grubu ortaya çıkabilir. Dördüncüsü, ilaç yüklemesinden önce Ca-asetatın tamamen çıkarılması, tesaglitazarın lipozomlara transferini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Ca-asetatın tamamen çıkarılmasını test etmek için, lipozomları çıkarmak için yüksek hızlı çökeltme kullanın ve daha sonra lipozomal olmayan çözeltideki Ca-asetat seviyelerini ölçün. Beşinci olarak, her adımda lipozom preparatına eklenen tüm malzemelerin kütlesini tartmak ve kaydetmek önemlidir. Bu, uygun konsantrasyonların hesaplanabilmesini ve gerekli malzeme oranlarının korunmasını sağlar. Son olarak, teknik uygun şekilde uygulanmazsa, istenmeyen bir heterojenlik seviyesi olabilir. Bu parametreyi DLS ve elektron mikroskobu gibi diğer yaklaşımları kullanarak iyice kontrol etmek önemlidir. Homojenliği artırmak için, seçilen filtre boyutunu ayarlamayı veya iki filtreyi istiflemeyi düşünün.
Ek olarak, bu protokolü tam olarak yürütmeden önce kontrollerin ve akış sitometrisi için bir antikor panelinin planlanması ve optimize edilmesi kritik öneme sahiptir (Tablo 1, Tablo 3). Antikorlar, boyama için uygun konsantrasyonların kullanıldığından ve floroforlar arasındaki örtüşmenin minimum düzeyde olduğundan emin olmak için test edilmelidir. Lipozom hazırlama sırasında kullanılan boyanın uyarılması ve emisyonu da panel planlamasına dahil edilmelidir. Sonuçlarımızda, Allophycocyanin (APC) ve AlexaFluor 647 gibi floroforlara benzer bir uyarma ve emisyona sahip olan DiD'yi kullandık. Bu nedenle, antikor panelimizde bu floroforlara konjuge edilmiş antikorları seçmedik. Ayrıca, izotip kontrolleri bu protokole dahil değildir. Bunun nedeni, bu protokol için seçilen antikorların iyi doğrulanmış, ticari olarak temin edilebilen antikorlar olmasıdır. Bununla birlikte, daha önce optimize edilmemiş bir antikor kullanmakla ilgileniyorsanız, lütfen tam deneyi yapmadan önce antikoru ilgili dokular üzerinde izotip kontrolüne karşı test etmeyi düşünün.
Bu protokol, tedavi sonrası fareden kan, dalak, kasık yağ ve epididim yağ dokularının nasıl çıkarılacağını ve işleneceğini gösterirken, bu genel yaklaşım diğer dokulara da uygulanabilir. İlgilenilen dokuya bağlı olarak, işleme ve sindirim protokollerinin aşağıdaki dokular için yayınlandığı gibi değiştirilmesi gerekebilir: akciğer21, karaciğer22, periton boşluğu 3, kemik iliği3,23, beyin 24.
Bu yöntemin dikkate alınması gereken önemli bir sınırlaması, alımın hayvan başına yalnızca bir zaman noktasında değerlendirilebilmesidir. Bu nedenle, bu protokolü diğer non-invaziv görüntüleme teknikleriyle birleştirmek veya değerlendirmeyi yürütmek için yeterli kaynakları sağlamak için buna göre plan yapmak avantajlı olabilir. Hücresel alımın zamanlaması ve hücresel dönüşüm, dikkate alınması gereken önemli faktörlerdir: lipozomlar ilk 24 saat içinde vücutta dolaşır ve lipozomları alan hücrelerin ömrüne veya alıma nasıl tepki verdiklerine bağlı olarak, hücre ölümü veya daha fazla fagositoz oluşabilir. Önceki çalışmamız, DiD + popülasyonlarının popülasyon özelliklerinde farklı zaman noktalarındadeğişiklikler göstermiştir 3. Bu nedenle, daha erken zaman noktalarında veya ilgi mekanizmasının biyolojisi ile en alakalı zaman noktalarında alımı değerlendirmek önemlidir. Ek olarak, tüm dokudaki hücre alımının nicelleştirilmesi bu protokol ile yapılabilirken, akım sitometrisi doku lokalizasyonunu ortaya çıkaramaz. Bu yaklaşımın histolojik yöntemlerle birleştirilmesi bu sınırlamanın giderilmesine yardımcı olabilir.
Genel olarak, bu protokol histoloji ve tüm vücut floresan görüntüleme gibi mevcut metodolojiyi tamamlar. Akış sitometri araç ve yöntemlerindeki sürekli gelişmelerle, giderek daha spesifik hücre popülasyonlarına daha büyük panellerin geliştirilmesi mümkün olacaktır. Bu protokolün yukarıda belirtilen yöntemlere ek olarak kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, hücresel alımın değerlendirilmesini iyileştirecek ve aynı zamanda akış sitometrisi ile gözlemlenen sonuçları doğrulama fırsatı sağlayacaktır. Örneğin, yağ dokusundaki parçacıkların çoğunluğunun makrofajlar tarafından akış sitometrisi ile alındığı tespit edilmelidir. Aynı yağ dokusunun ek bir alikotunun immünofloresansı, hücre tipinin gerçekten lipozomları aldığını doğrulamak için makrofaj belirteçleri için kaydedilebilir, sabitlenebilir, kesitlenebilir ve boyanabilir. Bu yaklaşım, yürütülen nanopartikül biyodağılım analizlerine titizlik katmalıdır: hücreye özgü hedeflemeyi doğrulamak, hücresel alımı ölçmek, hedef dışı alımı tanımlamak ve umarım gözlemlenen terapötik sonuçlar için mekanik hipotezler üretmek için bilgi sağlamak. Bu protokol aynı zamanda farklı lipozomlar kullanarak, diğer dokulardaki alımı araştırarak ve obezite ve dismetabolizma ortamında veya nanopartikül dağıtımının uygulanabilir bir terapötik seçenek olduğu başka herhangi bir hastalık ortamında yeni bileşikleri test ederek gelecekteki çalışmalar için uyarlanabilir.

Nanopartikül ilaç dağıtımını kullanan tedavilerin geliştirilmesine olan ilgi arttıkça, parçacık dağılımını ve alımını hazırlama ve değerlendirme yöntemleri ilerlemeye, genişlemeye ve araştırma topluluğu için erişilebilir olmaya devam etmelidir 1,2. Bu protokol, peroksizom proliferatör-aktive reseptör (PPAR)-α/γ agonisti 3,4 olan tesaglitazar yüklü DiD etiketli lipozomlarla yapılan bir tedaviyi takiben in vivo lipozomları alan kesin hücre tiplerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, lipozomal tesaglitazar tedavisinden hangi hücre tiplerinin doğrudan etkilendiğini, moieties hedeflemenin etkinliğini değerlendirebildik ve gözlemlediğimiz tedavi sonuçlarını açıklamak için hipotezler üretebildik. Ayrıca, çeşitli hücre tiplerinde yerleşik biyolojik fonksiyonlar, makrofajlar, dendritik hücreler ve karaciğere özgü Kupffer hücreleri gibi fagositik hücrelerin lipozomların çoğunu aldığını göstermektedir 5,6,7. Bu protokolü kullanarak, klasik olmayan fagositlerin de lipozomları alabileceğini gösterdik 3,4.
Bu protokol, tesaglitazarın çözünmesi, ters faz buharlaşması ile lipozomların hazırlanması ve uzaktan ilaç yüklemesi için bir çekici olarak kalsiyum asetat kullanılması için optimize edilmiş bir yöntem sunar. Sunulan yöntemler birçok laboratuvar tarafından erişilebilir durumdadır ve elde edilmesi zor malzemelerden ve yüksek sıcaklıklar gerektiren adımlardan yoksundur. Protokol, in vivo8'in artan dolaşımı için en uygun olan boyutlarda lipozomlar üretir. Ayrıca, Su ve ark. tarafından özetlendiği gibi, bugüne kadar, in vivo lipozom dağılımını ve doku alımını değerlendirmek için yöntemler derinlemesine çalışılmış ve test edilmiştir9. Pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve floresan moleküler tomografi (FMT) yöntemleri dokuya özgü biyodağılımı ve alımı ölçmek içinuygulanmaktadır 9,10,11. Bu yöntemler in vivo tespiti en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş olsa da, hala hücresel çözünürlükte in vivo lipozom alımını ölçme yeteneğinden yoksundurlar. Burada sunulan protokol, akış sitometrisi kullanarak bu ihtiyacı karşılamayı amaçlamaktadır. Son olarak, bu protokol için, hücresel alım, yağ dokusu da dahil olmak üzere birkaç dokuya daraltıldı. Obezite, dismetabolizma ve inflamasyon ortamında tedaviler sunmak için nanopartiküllerin kullanım potansiyelini araştıran büyüyen bir literatür grubu vardır 12,13,14,15,16,17. Bu nedenle, bu patolojilerde önemli bir rol oynayan dokulardan biri olan yağ dokusunu işlemek ve analiz etmek için etkili yöntemlerle bir protokolü paylaşmanın önemli olduğunu hissettik.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge iğne, retro-orbital enjeksiyon için steril</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge iğne, retro-orbital enjeksiyon için steril</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Klonu RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-fare CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Klon AFS98</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11b PerCP Cy5.5 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Klon M1/70</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c APC ef780 antikoru</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Klon N418</td></tr><tr><td>Anti-fare CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Klon 1D3</td></tr><tr><td>Anti-fare CD3 FITC antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Klon 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-fare CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Klon 390</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Klon 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-fare F4 / 80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>İkizler Biyo-ürünler</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Tuzdan arındırma spin-kolon</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin sütunu</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dinamik Işık Saçılımı, Nicomp 370</td><td>Parçacık Boyutlandırma Sistemi, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & PERM Hücre Geçirgenlik</td><td>Kiti ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı bez süngerler</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipozom ekstruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Aletleri Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik yağlayıcı</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Steril</td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 w/v aq. soln., metanol içermez</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Kıyma için polietilen şişe</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Döner buharlaştırıcı</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pompa Isı terapisi pompası ve pedi</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Rayla oyulmuş polikarbonat membranlar</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z **</td> <td>Whatman, Nüklepor Polikarbonat hidrofilik membranlar</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS sistemi</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

floresan boya etiketli lipozomların İn vivo dokuya Özgü hücresel alımının hazırlanması, uygulanması ve değerlendirilmesi

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Özellikle hedefli tedavi yaklaşımları için bileşikleri in vivo olarak vermek için lipozomların kullanılmasına artan bir ilgi vardır. Lipozom formülasyonuna bağlı olarak, lipozomlar tercihen vücuttaki farklı hücre tipleri tarafından alınabilir. Bu, terapötik parçacığın etkinliğini etkileyebilir, çünkü farklı hastalıkların ilerlemesi doku ve hücre tipine özgüdür. Bu protokolde, DSPC, kolesterol ve PEG-2000 DSPE ve lipit boya DiD'yi floresan etiket olarak kullanarak lipozomları sentezlemek ve floresan olarak etiketlemek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol aynı zamanda in vivo lipozomlar vermek ve akış sitometrisi kullanarak lipozomların hücreye özgü alımını değerlendirmek için bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yaklaşım, lipozomları alan hücre tiplerini belirlemek ve lipozom alımının hücre tipleri ve dokular arasındaki dağılımını ve oranını ölçmek için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilmemiş olsa da, bir sitometre üzerinde immünofloresan ve tek hücreli floresan görüntüleme gibi ek testler, hücre içi boyamanın değerlendirilmesine izin verdikleri için yapılan bulguları veya sonuçları güçlendirecektir. Protokollerin, ilgilenilen doku (lar) a bağlı olarak da uyarlanması gerekebilir.

Lipozom Üretimi
Burada yayınlanan sonuçlar, daha önce yayınlanmış olan 3,4,20 çalışmamızdakilere benzer. Burada sunulan protokolü kullanarak, yaklaşık 150 \ u2012160 nm boyutunda lipozomlar üretmeyi bekliyoruz. DLS, ortalama lipozom çapının 163.2 nm ve zeta potansiyelinin -19.2 mV olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 1A). Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) görüntülemesi dairesel lipozomları ortaya çıkarır (Şekil 1B) ve DLS diyagramı ortalama çaptan nispeten küçük bir standart sapma ortaya çıkarır (Şekil 1C).
Pozitif lipozom bağlanması, PBS ile tedavi edilen bir kontrol gerektirir
Bu protokolü kullanan grubumuzdan yapılan önceki çalışmalar, in vivo uygulamadan bir hafta sonra lipozomlara bağlı yağ SVF, dalak ve kandaki hangi hücre alt kümelerinin araştırıldığını araştırmıştır 3,4. PBS ile tedavi edilmiş bir fare kullanılarak, periton boşluğu ve dalak hücreleri, lipozomla tedavi edilen farelerden alınan örneklerde kullanılan aynı antikor paneli ile boyandı. Dokular bir haftalık tedavilerden sonra hasat edildi (Şekil 2A). PBS ile muamele edilmiş fareden alınan örnekler, pozitif DiD kapıları oluşturmak için bir DiD FMO görevi gördü (Şekil 2B, C). DiD-pozitif sinyal kullanılarak pozitif bir kapı oluşturulabilir, ancak pozitif kapının herhangi bir DiD-negatif numune içermediğini doğrulamak için DiD sinyali olmayan örnekler de kullanılmalıdır.
Floresan sinyallerini optimize etmek için titrasyonlara ihtiyaç vardır
Tam bir deney yapmadan önce, hücre boyama sırasında kullanılan floresan konjuge antikorların konsantrasyonu ve lipozom hazırlama sırasında kullanılan lipit boyası dahil olmak üzere çeşitli koşullar optimize edilmelidir. Akış sitometreleri, floresan yoğunluğu için bir üst algılama sınırına sahiptir, bu nedenle lipozomlara dahil edilen çok fazla boya, sitometreden geçen numunelerde ölçülemeyen DiD sinyal seviyelerine yol açacaktır. Ayrıca, lipozomlardaki çok fazla DiD, hücresel alım sonuçlarını çarpıtabilecek yüksek düzeyde spesifik olmayan boya transferine yol açabilir. Şekil 3, kullanılan akış sitometresinin algılama aralığında optimal bir sinyal üretecek konsantrasyonu tanımlamak için lipit boya konsantrasyonlarının titre edildiği bir deneyden elde edilen sonuçları bildirmektedir. Bu, son deney için ilgilenilen dokular üzerinde gerçekleştirildi: Kan (Şekil 3A), inguinal yağ SVF (Şekil 3B) ve epididim adipoz SVF (Şekil 3C). Test için seçilen konsantrasyonlar, 1 mL lipozom başına 10 mg DiD (Yüksek, kırmızı), 1 mg DiD (Orta, mavi) veya 0.1 mg DiD (Düşük, gri) idi. Lipozomlarda kullanılan en yüksek konsantrasyon çok yüksekti ve her üç dokuda da sitometrenin ölçülebilir aralığını aştı (Şekil 3A \ u2012C, kırmızı). En düşük DiD konsantrasyonu bir miktar sinyal gösterdi (Şekil 3 A\u2012C, gri), ancak PBS ile tedavi edilen hücrelerin ötesinde net bir popülasyon gözlenmedi (Şekil 3A\u2012C, siyah). Ölçüldüğünde, her doku ve konsantrasyon için DiD MFI'nın aritmetik ortalaması, PBS kontrolleri ile DiD'nin orta konsantrasyonu arasında net bir ayrım olduğunu göstermiştir (Şekil 3D). Bu nedenle, protokolde belirtildiği gibi, lipozom preparatımızda kullanmak üzere orta konsantrasyonu (Şekil 3, mavi) seçtik.
Çoklu antikor panelinin kullanılması, lipozom alımının farklı hücre alt kümeleri tarafından tanımlanmasına izin verir
Tablo 3'te özetlenen panel kullanılarak, hücreler makrofajlar, B hücreleri, T hücreleri, dendritik hücreler, monositler ve endotel hücreleri için belirteçlere karşı antikorlarla boyandı (Şekil 4). Her doku tipi için biraz farklı geçit stratejileri gereklidir, ancak her birinde aynı hücre tiplerinin çoğu tanımlanabilir. Bazı istisnalar, normalde kanda bulunmayan endotel hücrelerini ve kanda tipik olarak diğer dokulardan daha yüksek sıklıkta bulunan monositleri içerir. Popülasyonlar tanımlandıktan sonra, her hücre popülasyonunun toplam büyüklüğü ve DiD + oldukları frekans ölçülebilir. DiD + popülasyonunu karakterize etmek için daha fazla hesaplama yapılabilir: DiD + hücrelerinin yüzde kaçının makrofajlar, endotel hücreleri vb. Lütfen unutmayın, bunlar örnek geçit stratejileridir, ancak örnekleri analiz etmenin tek yolu değildir. Analiz, seçilen panel ve mevcut akış sitometreleri tarafından belirlenecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Şekil 1: Hazırlanan lipozomların örnek özellikleri. (A) Boyut ve zeta potansiyeli yukarıda açıklandığı gibi ölçülmüş ve tablo şeklinde rapor edilmiştir. Her parametre ortalama ± standart sapma olarak sunulur. (B) Hazırlanan lipozomları görüntülemek için Cryo-EM kullanıldı. Beyaz ölçek çubuğunun uzunluğu 50 nm'dir. (C) DLS, bu hazırlıkta lipozomların çapının histogramını oluşturmak için kullanıldı. Bu rakam Osinski ve ark.3'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Şekil 2: PBS veya Lipozom ile tedavi edilen farelerden temsili DiD boyaması. (A) PBS ve lipozom tedavileri için deneysel şema. PBS veya lipozomlar bir hafta boyunca üç kez enjekte edildi. Dokular tedavinin 8. gününde hasat edildi. (B, C) Temsili akış grafikleri, lipozomla tedavi edilen (C) farelerde pozitif DiD boyamasını ortaya çıkarır, ancak PBS ile tedavi edilen (B) farelerde değildir. FSC, ileri saçılma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Şekil 3: Lipozomlarda DiD titrasyonu. Lipozomlar üç farklı DiD konsantrasyonu ile hazırlandı ve farelere enjekte edildi. Gri, 1 mL lipozom başına 0.1 mg DiD'deki düşük konsantrasyonu, mavi 1 mg DiD / mL lipozomlardaki orta konsantrasyonu ve kırmızı 10 mg DiD / mL lipozomlardaki yüksek konsantrasyonu gösterir. PBS ile muamele edilmiş bir fare, negatif kontrol (siyah) olarak kullanılmıştır. Kan (A, daire), inguinal yağ (B, triange) ve epididim adipoz (C, kare) enjeksiyondan 24 saat sonra toplandı ve tek hücreli bir süspansiyonu izole etmek için işlendi. Bu örnekler, tespit edilebilir DiD seviyesine kadar bir akış sitometresi üzerinde çalıştırıldı. Her tedavi grubunun bindirmeleri ile dokuya özgü histogramlar, konsantrasyon başına floresan yoğunluğunu göstermek için sunulmuştur (A\u2012C). DiD'nin aritmetik ortalaması da her doku ve konsantrasyon için ölçüldü ve çizildi (D). SSC = yan saçılma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Şekil 4: Yağ SVF, kan ve dalaktaki hücre alt kümelerinin temsili akış sitometrisi analizi. (A\u2012C) Yağ SVF (A), dalak (B) ve kandaki (C) hücre alt kümelerini ve DiD + hücrelerini tanımlamak için geçit stratejisinin şematik temsilcisi. Kısaltmalar: FSC = ileri saçılma; LD = canlı/ölü; L-DC'ler = lenfoid dendritik hücreler; M-DC'ler = miyeloid dendritik hücreler; SSC = yan saçılma. Bu rakam Osinski ve ark.3'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kontrol</td>
			<td>Amaç</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBS veya salin ile tedavi edilmiş fare</td>
			<td>Aşağıdaki akış sitometri kontrolleri için bu faredeki hücreleri kullanın:</td>
		</tr><tr><td>1. Lekelenmemiş hücreler</td>
		</tr><tr><td>2. Canlı / ölü tek leke</td>
		</tr><tr><td>3. Tam panel ile boyanmış, ancak analiz sırasında pozitif lipozom sinyalini belirlemek için lipozom floresansından yoksun hücreler</td>
		</tr><tr><td>Bu / bu fare / fareler, deneyimizde lipozom olmayan bir kontrole sahip olacağınız için lipozomların in vivo herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek için de kullanılacaktır.</td>
		</tr><tr><td>Yüksüz lipozomlar</td>
			<td>Lipozomlarınıza bir bileşik yüklüyorsanız, lipozom partinizin bir kısmı bileşik olmadan sentezlenmelidir. Bu, tek başına lipozomların in vivo etkilerini açıklar.</td>
		</tr><tr><td>Tek başına DiD</td>
			<td>DiD, hücresel membranlar tarafından da alınabildiğinden, bazı farelerin lipozomlarda bulunana eşit miktarda serbest boya alması için tahsis edilmesi, herhangi bir arka plan zarı boyanmasının hesaba katılmasına yardımcı olacaktır.</td>
		</tr><tr><td>Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri</td>
			<td>Bunlar, panelinizdeki antikorlardan biri hariç hepsiyle boyanmış hücrelerdir. Yukarıdaki kutudaki #3 gibi, bu da analiz sırasında bu antikor için gerçek pozitif sinyalin belirlenmesine yardımcı olur</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılacak denetimler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Çözüm</td>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Toplu iş/fare başına gereken yaklaşık hacim</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lipozom preparatı</td>
		</tr><tr><td>Kalsiyum asetat</td>
			<td>H2O cinsinden 1 M kalsiyum asetat</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES tamponu</td>
			<td>H2O'da 10 mM HEPES, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES sınırlarındaki Tesaglitazar</td>
			<td>10 mM HEPES içinde</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Doku toplama, işleme ve boyama</td>
		</tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, damıtılmışH2O'da 1,8 mM KH2PO 4</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparin</td>
			<td>PBS'de 0,1 mM Heparin</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES tamponu</td>
			<td>PBS'de 20 mM HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Sindirim tamponu</td>
			<td>HEPES tamponunda 2 mg/mL Kollajenaz Tip I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC lizis tamponu</td>
			<td>ddH 2 O cinsinden 0,158M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>FACS tamponu</td>
			<td>%1 BSA, PBS'de %0,05 NaN3</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Fc Blok (seyreltilmiş)</td>
			<td>1:50 FACS tamponunda Fc Bloğu</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fiksasyon Tamponu</td>
			<td>PBS'de %2 paraformaldehit</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Hazırlanacak çözümler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hücre Dışı Boyama (2x antikor karışımı)</td>
		</tr><tr><td>Antijen</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>100 μL test başına Ab hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>ve saire...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Antikor karışımınızı oluşturmak için, D sütununda hesaplanan antikorları FACS tamponu veya Brilliant Violet Boyama Tamponu* ile birleştirerek son hacme (50 μL x 1,2 x Toplam # numune) kadar birleştirin</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Canlı/Ölü boyama (1x)</td>
		</tr><tr><td>Canlı/Ölü</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>200 uL testi başına L/D hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>Canlı/Ölü</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hücre İçi Boyama (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antijen</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>50 μL test başına Ab hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Panelinizde Parlak Mor florofora konjuge edilmiş birden fazla antikor kullanılıyorsa Parlak Menekşe Boyama Tamponu kullanılmalıdır.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Örnek antikor paneli ve akış boyama için kullanılacak boyama karışımlarının hesaplanması.

Bu protokolün amacı, floresan olarak etiketlenmiş lipozomları sentezlemek ve lipozomların hücresel düzeyde in vivo lokalizasyonunu tanımlamak için akış sitometrisini kullanmaktır.

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Protokolümüz, tesaglitazar yüklü lipozomları hazırlamak için erişilebilir bir yöntemi, lipozom alımını hücresel düzeyde değerlendirmek için kapsamlı bir yaklaşımla birleştirir. Bu teknik, düşük sıcaklıklar kullanılarak hazırlanan ve elde edilmesi kolay ekipman olan floresan etiketli lipozomların alımını değerlendirmek için tarafsız bir yöntem sağlar. Kalsiyum asetat ve tesaglitazar ile yüklü floresan etiketli lipozomları hazırlamak için, önce oda sıcaklığında, 20 kilohertz ve% 50 güçte 30 saniye boyunca sonikasyon ile bir eter kloroform lipit çözeltisini emülsifiye etmek için yarım inçlik bir prob kullanın.Homojenize su ve yağ emülsiyon çözeltisini hemen özel bir adaptör, nanometre göstergesi ve basınç regülatör valfi ile döner bir buharlaştırıcıya aktarın ve evaporatörü bir vakum hattına bağlayın. Organik çözücüleri çıkarmak için dönüş hızını dakikada 100 devire ve vakumu 0,5 atmosfere ayarlayın. Bir jel oluştuktan ve kaybolduktan sonra, vakumu 0.9 atmosfere yükseltin ve lipozom sulu dispersiyonunu, iki gaz geçirmez şırınga ile donatılmış bir lipozom ekstrüderinde 200 nanometrelik bir polikarbonat filtreden birden çok kez süzün.Dinamik ışık saçılımı ile boyut dağılımını doğruladıktan sonra, lipozomlardan herhangi bir hapsedilmemiş tesaglitazarı çıkarmak için iki mililitrelik bir spin sütunu kullanın ve sıkışmış ilaç konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra kuru kolon jel yatağına 500 mikrolitreden fazla lipozom örneği eklemeyin. Lipozomları retro-orbital enjeksiyonla uygulamak için, gözü yüz düzleminin üzerine kaldırmak için açıkta kalan gözün üstündeki ve altındaki cilde hafifçe bastırın.Daha sonra iğnenin ucunu gözün ön köşesine dikkatlice yerleştirin, iğnenin dokunmadan kürenin altında olduğundan emin olun ve lipozomları yavaşça retro-orbital boşluğa enjekte edin. Kan örneğini toplamak için, uygun deney bitiş noktasında, farenin göğüs kafesinin kaudal ucunun kenarındaki deride dikkatlice bir kesi yapın ve pektoralis kasları açığa çıkana kadar hayvanın kafasına doğru bir santimetre düz bir çizgi kesin. İlk kesi yerinde, başa doğru çizgiye dik iki küçük kesi yapın ve iğne yerleştirme bölgesine daha iyi erişim ve görselleştirme sağlamak için açıkta kalan alanda göğüs kafesinin bir tarafındaki pektoralis kasını dikkatlice kesin.İğneyi, göğüs kafesinin merkez çizgisine mümkün olduğunca yakın tutarak üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasına yerleştirin ve kan toplamaya başlamak için şırıngayı yavaşça yukarı çekin. Mümkün olduğu kadar fazla hacim toplandığında, kanı buz üzerinde 10 mikrolitre 0.5 molar EDTA içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kasık sonrası doku pedini farenin her iki tarafından çıkarmak için, periton zarını sağ tarafta tutmak için bir forseps seti ve diğer tarafta cildin kenarını periton zarının üzerinde tutmak için ikinci forseps seti kullanın.Katmanları birbirinden ayırmak için cildi nazikçe zardan uzaklaştırın. Yağ deposuna daha iyi erişmek ve cilt boyunca kasık yağ dokusu deposunu bulmak için cildin dış kenarını sabitleyin. Ve lenf düğümünü gerektiği gibi çıkarmak için forseps ve makas kullanarak yağ deposunun ortasındaki kasık lenf düğümünü bulun.Lenf nodu çıkarıldıktan sonra, yağ deposunun sabitlenen noktaya en yakın ucunu dikkatlice kavramak için forsepsleri kullanın ve yağ dokusu ile cilt arasındaki bağ zarında küçük kesikler yapmaya başlayın. Membrana daha iyi erişim için kesikler yaparken yağ dokusunu ciltten uzaklaştırın ve depoyu buz üzerinde HEPES tamponu içeren bir polietilen şişeye yerleştirin. Epididimal yağ depolarını periton boşluğunun kaudal ucundan çıkarmak için, ilk epididimal yağ deposunu farenin dorsal ucundan nazikçe çekmek için forseps kullanın ve bu depoya bağlı epididim ve vas deferens'i bulun.Daha sonra, adipozu diğer dokulardan ayırmak için yağ deposu ile epididim ve vas deferens arasında dikkatlice kesin ve depoyu buz üzerinde HEPES tamponu olan bir polietilen şişeye yerleştirin. Tüm dokular toplandığında, yağ dokusu örneklerini 0,5 milimetre doku parçalarına ayırmak için bir ila iki makas kullanın. Daha sonra, yağ dokusu parçalarının şişelerine mililitre başına 1.5 mililitre iki miligram kollajenaz tamponu ekleyin ve şişeleri 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve dakikada 150 devirde çalkalama inkübatörüne yerleştirin.30 dakika sonra, numuneleri birkaç kez ezmek için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Doku parçaları kolay pipetleme için hala çok büyükse, numuneleri 15 dakika daha inkübatöre geri koyun. Numuneler tamamen sindirildikten sonra, tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulmasını sağlamak için parçaları 10 kez daha ezin ve her bir numuneyi ayrı ayrı 70 mikrometre filtrelerden numune başına 50 mililitrelik bir tüpe süzün.Kalan hücreleri toplamak için her bir dosyayı beş mililitre FACS tamponu ile durulayın ve her yıkamayı buz üzerindeki uygun hücre numunesi şişesine süzün. Tüm numuneler filtrelendiğinde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve numunelerden adiposit süpernatantını aspire edin. Daha sonra, stromal vasküler fraksiyon peletlerini sağlam bırakarak süpernatanları dikkatlice aspire edin ve peletleri tüp başına bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.Daha sonra süspansiyonları, standart protokollerle akış sitometrik analizine kadar buz üzerinde yeni 1.5 veya 1.7 mililitrelik tüplere aktarın. Dinamik ışık saçılımı, ortalama 163.2 nanometre lipozom çapı ve eksi 19.2 milivoltluk bir zeta potansiyeli ortaya çıkarır. Kriyojenik elektron mikroskobu görüntüleme, dinamik ışık saçılımı ile ölçülen ortalama çaptan elde edilen nispeten küçük bir standart sapmaya sahip dairesel lipozomları ortaya çıkarır.PBS ile tedavi edilen farelerden alınan numunelerin akış sitometrik analizi, DiD pozitif kapılar oluşturmak için bir DiD floresan eksi bir kontrol olarak kullanılabilir. Bu temsili analizde gösterildiği gibi, DiD'nin mililitre başına 10 miligram lipozom yükleme konsantrasyonu çok yüksektir ve test edilen üç dokuda da sitometrenin ölçülebilir aralığını aşmaktadır. Mililitre başına 0.1 miligramlık bir konsantrasyon bazı sinyalleri gösterir, ancak PBS ile tedavi edilen hücrelerin ötesinde net bir popülasyon gözlenmez.Bu nedenle, analizör tarafından hala okunabilir durumdayken, PBS kontrolünden net bir ayrım gösteren mililitre konsantrasyonu başına bir miligramın, lipozom preparatında kullanılması önerilir. Her doku tipi için biraz farklı geçit stratejileri gereklidir, ancak aynı hücre tiplerinin çoğu her birinde tanımlanabilir. İlgilenilen spesifik popülasyonlar tanımlandıktan sonra, her bir hücre popülasyonunun toplam boyutu ve bunların DiD pozitif olma sıklığı ölçülebilir.Reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanması ve her adım için sonuçların tahmin edilmesi çok önemlidir. Erken dönemde beklenmeyen sonuçlar gelecekteki sonuçları mahvedebilir. Histolojik yöntemler, tüm doku içindeki lipozom lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilirken, görüntüleme akış sitometrisi, hücre bazında lipozom içselleştirmesini doğrulamak için kullanılabilir.

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Bu videoda, hücre zarı taklitleri (büyük unilamellar veziküller veya LUV'ler, bir floresan boya ve bir söndürücü ile kapsüllenmiş) kullanarak hücreye nüfuz eden peptitlerin hücre zarlarıyla etkileşimlerini incelemek için floresan sızıntı testi tartışılmaktadır.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

in vivo görüntüleme için floroforların kullanımı, opsonizasyon, hızlı klirens, düşük saptama hassasiyeti ve konakçı üzerindeki sitotoksik etkiler nedeniyle büyük ölçüde sınırlanabilir. Floroforların lipozomlardaki film hidrasyonu ve ekstrüzyon ile kapsüllenmesi, floresan söndürme ve korumaya yol açar, bu da yüksek algılama hassasiyeti ile in vivo görüntülemeyi mümkün kılar.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme

Lipozomların heterojen intra-tümöral birikimi, anormal bir tümör mikroçevresi ile ilişkilendirilmiştir. Burada, perfüzyon görüntüleme ile tümör mikrosirkülasyonunu ölçmek ve görüntü kılavuzluğunda robotik bir sistem kullanılarak yüksek interstisyel sıvı basıncını (IFP) ölçmek için yöntemler sunulmaktadır. Ölçümler, hacimsel mikro-BT görüntüleme kullanılarak belirlenen lipozomların intratümöral birikimi ile karşılaştırılır.

Perfüzyon Mekansal Ölçümler, Solid Tümörlerde interstisyel sıvı basınç ve lipozomlar Birikim

Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir.

Kullanımı Ex Vivo Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Nanoilaçların in vivo performansının zayıf anlaşılması, klinik translasyonlarını engellemektedir. Tümör taşıyan immünokompetan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirme prosedürleri burada açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici kanser nanoilaçlarını tanımlamalarına yardımcı olabilir.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Eksvivo görüntüleme sistemlerini kullanan hücre penetran peptidler ile transdüksiyon derecesini değerlendirmek için protokolleri, parafin katıştırma, kesitleme ve konfokal floresan mikroskopisi kalp hedefleme peptidini örnek olarak kullanarak açıklıyoruz. Protokolümüzde, tek bir hayvan aynı organların her iki tür de görüntüleme değerlendirmesini elde etmek için kullanılabilir ve bu da çalışmalar için gerekli hayvan sayısını yarı yarıya azaltabilir.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Öğrenin floresan boyalı lipozomların akış sitometrisi ile in vivo hücresel alımını değerlendirme yöntemini. Bu protokol ilaç teslimatı ve hücre biyolojisi araştırmalarında uygulanabilir.

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet