Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

Protokolümüz, tesaglitazar yüklü lipozomları hazırlamak için erişilebilir bir yöntemi, lipozom alımını hücresel düzeyde değerlendirmek için kapsamlı bir yaklaşımla birleştirir. Bu teknik, düşük sıcaklıklar kullanılarak hazırlanan ve elde edilmesi kolay ekipman olan floresan etiketli lipozomların alımını değerlendirmek için tarafsız bir yöntem sağlar. Kalsiyum asetat ve tesaglitazar ile yüklü floresan etiketli lipozomları hazırlamak için, önce oda sıcaklığında, 20 kilohertz ve% 50 güçte 30 saniye boyunca sonikasyon ile bir eter kloroform lipit çözeltisini emülsifiye etmek için yarım inçlik bir prob kullanın.

Homojenize su ve yağ emülsiyon çözeltisini hemen özel bir adaptör, nanometre göstergesi ve basınç regülatör valfi ile döner bir buharlaştırıcıya aktarın ve evaporatörü bir vakum hattına bağlayın. Organik çözücüleri çıkarmak için dönüş hızını dakikada 100 devire ve vakumu 0,5 atmosfere ayarlayın. Bir jel oluştuktan ve kaybolduktan sonra, vakumu 0.9 atmosfere yükseltin ve lipozom sulu dispersiyonunu, iki gaz geçirmez şırınga ile donatılmış bir lipozom ekstrüderinde 200 nanometrelik bir polikarbonat filtreden birden çok kez süzün.

Dinamik ışık saçılımı ile boyut dağılımını doğruladıktan sonra, lipozomlardan herhangi bir hapsedilmemiş tesaglitazarı çıkarmak için iki mililitrelik bir spin sütunu kullanın ve sıkışmış ilaç konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra kuru kolon jel yatağına 500 mikrolitreden fazla lipozom örneği eklemeyin. Lipozomları retro-orbital enjeksiyonla uygulamak için, gözü yüz düzleminin üzerine kaldırmak için açıkta kalan gözün üstündeki ve altındaki cilde hafifçe bastırın.

Daha sonra iğnenin ucunu gözün ön köşesine dikkatlice yerleştirin, iğnenin dokunmadan kürenin altında olduğundan emin olun ve lipozomları yavaşça retro-orbital boşluğa enjekte edin. Kan örneğini toplamak için, uygun deney bitiş noktasında, farenin göğüs kafesinin kaudal ucunun kenarındaki deride dikkatlice bir kesi yapın ve pektoralis kasları açığa çıkana kadar hayvanın kafasına doğru bir santimetre düz bir çizgi kesin. İlk kesi yerinde, başa doğru çizgiye dik iki küçük kesi yapın ve iğne yerleştirme bölgesine daha iyi erişim ve görselleştirme sağlamak için açıkta kalan alanda göğüs kafesinin bir tarafındaki pektoralis kasını dikkatlice kesin.

İğneyi, göğüs kafesinin merkez çizgisine mümkün olduğunca yakın tutarak üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasına yerleştirin ve kan toplamaya başlamak için şırıngayı yavaşça yukarı çekin. Mümkün olduğu kadar fazla hacim toplandığında, kanı buz üzerinde 10 mikrolitre 0.5 molar EDTA içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kasık sonrası doku pedini farenin her iki tarafından çıkarmak için, periton zarını sağ tarafta tutmak için bir forseps seti ve diğer tarafta cildin kenarını periton zarının üzerinde tutmak için ikinci forseps seti kullanın.

Katmanları birbirinden ayırmak için cildi nazikçe zardan uzaklaştırın. Yağ deposuna daha iyi erişmek ve cilt boyunca kasık yağ dokusu deposunu bulmak için cildin dış kenarını sabitleyin. Ve lenf düğümünü gerektiği gibi çıkarmak için forseps ve makas kullanarak yağ deposunun ortasındaki kasık lenf düğümünü bulun.

Lenf nodu çıkarıldıktan sonra, yağ deposunun sabitlenen noktaya en yakın ucunu dikkatlice kavramak için forsepsleri kullanın ve yağ dokusu ile cilt arasındaki bağ zarında küçük kesikler yapmaya başlayın. Membrana daha iyi erişim için kesikler yaparken yağ dokusunu ciltten uzaklaştırın ve depoyu buz üzerinde HEPES tamponu içeren bir polietilen şişeye yerleştirin. Epididimal yağ depolarını periton boşluğunun kaudal ucundan çıkarmak için, ilk epididimal yağ deposunu farenin dorsal ucundan nazikçe çekmek için forseps kullanın ve bu depoya bağlı epididim ve vas deferens'i bulun.

Daha sonra, adipozu diğer dokulardan ayırmak için yağ deposu ile epididim ve vas deferens arasında dikkatlice kesin ve depoyu buz üzerinde HEPES tamponu olan bir polietilen şişeye yerleştirin. Tüm dokular toplandığında, yağ dokusu örneklerini 0,5 milimetre doku parçalarına ayırmak için bir ila iki makas kullanın. Daha sonra, yağ dokusu parçalarının şişelerine mililitre başına 1.5 mililitre iki miligram kollajenaz tamponu ekleyin ve şişeleri 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve dakikada 150 devirde çalkalama inkübatörüne yerleştirin.

30 dakika sonra, numuneleri birkaç kez ezmek için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Doku parçaları kolay pipetleme için hala çok büyükse, numuneleri 15 dakika daha inkübatöre geri koyun. Numuneler tamamen sindirildikten sonra, tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulmasını sağlamak için parçaları 10 kez daha ezin ve her bir numuneyi ayrı ayrı 70 mikrometre filtrelerden numune başına 50 mililitrelik bir tüpe süzün.

Kalan hücreleri toplamak için her bir dosyayı beş mililitre FACS tamponu ile durulayın ve her yıkamayı buz üzerindeki uygun hücre numunesi şişesine süzün. Tüm numuneler filtrelendiğinde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve numunelerden adiposit süpernatantını aspire edin. Daha sonra, stromal vasküler fraksiyon peletlerini sağlam bırakarak süpernatanları dikkatlice aspire edin ve peletleri tüp başına bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra süspansiyonları, standart protokollerle akış sitometrik analizine kadar buz üzerinde yeni 1.5 veya 1.7 mililitrelik tüplere aktarın. Dinamik ışık saçılımı, ortalama 163.2 nanometre lipozom çapı ve eksi 19.2 milivoltluk bir zeta potansiyeli ortaya çıkarır. Kriyojenik elektron mikroskobu görüntüleme, dinamik ışık saçılımı ile ölçülen ortalama çaptan elde edilen nispeten küçük bir standart sapmaya sahip dairesel lipozomları ortaya çıkarır.

PBS ile tedavi edilen farelerden alınan numunelerin akış sitometrik analizi, DiD pozitif kapılar oluşturmak için bir DiD floresan eksi bir kontrol olarak kullanılabilir. Bu temsili analizde gösterildiği gibi, DiD'nin mililitre başına 10 miligram lipozom yükleme konsantrasyonu çok yüksektir ve test edilen üç dokuda da sitometrenin ölçülebilir aralığını aşmaktadır. Mililitre başına 0.1 miligramlık bir konsantrasyon bazı sinyalleri gösterir, ancak PBS ile tedavi edilen hücrelerin ötesinde net bir popülasyon gözlenmez.

Bu nedenle, analizör tarafından hala okunabilir durumdayken, PBS kontrolünden net bir ayrım gösteren mililitre konsantrasyonu başına bir miligramın, lipozom preparatında kullanılması önerilir. Her doku tipi için biraz farklı geçit stratejileri gereklidir, ancak aynı hücre tiplerinin çoğu her birinde tanımlanabilir. İlgilenilen spesifik popülasyonlar tanımlandıktan sonra, her bir hücre popülasyonunun toplam boyutu ve bunların DiD pozitif olma sıklığı ölçülebilir.

Reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanması ve her adım için sonuçların tahmin edilmesi çok önemlidir. Erken dönemde beklenmeyen sonuçlar gelecekteki sonuçları mahvedebilir. Histolojik yöntemler, tüm doku içindeki lipozom lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilirken, görüntüleme akış sitometrisi, hücre bazında lipozom içselleştirmesini doğrulamak için kullanılabilir.