Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Bu protokol, tek bir görüntüleme oturumu içinde birden fazla embriyonun aynı anda edinilmesini sağlar. Numune hazırlama, yüksek içerik çözümleyicisi kullanılarak çok noktalı edinim için uyarlanırken, bu protokol kullanılarak hazırlanan numuneler, çok noktalı edinim yapabilen ters mikroskopta görüntülenebilir. Başlamak için, bir yumurta toplayıcı aracı kullanarak büyük plaka temiz bir bölümünde 15-20 embriyolar iki satır düzenlemek.

Ön ve arka uçlara göre aynı yönde ventral tarafında embriyolar hizalamak. Bir spacer'ı bir kapak kaymasına yapıştırın ve 10 mikrolitre heptane tutkalı açığa çıkan coverslip cam insetinaşağı doğru çizgileyin. Tutkal kururken, embriyoların iki satır etrafında bir dikdörtgen kesmek için bir jilet kullanın.

Birincinin yanındaki ikinci bir dikdörtgeni kesin ve paslanmaz çelik spatulanın düz kenar tarafıyla ikinci dikdörtgeni çıkarın. Spatulanın düz kenarını ilk dikdörtgenin altına dikkatlice kaydırın ve çıkarın. Sonra, 3,5 santimetrelik bir yemeğin dış tarafında embriyolar ile cutout yerleştirin.

Stereo mikroskop altında, embriyoların üzerine hazırlanmış bir kapak kapağını düşürün ve iki embriyo sırasını tutkalüzerine nazikçe bastırın. Mikroenjeksiyon gerçekleştirmiyorsanız, silikon boşluk formunu bire bir halokarbon yağı 700 ile halokarbon yağı 27 ile yarıya kadar doldurun. Dört slaytlı plaka adaptörünün alt kenarlarını çift taraflı bantla hizalayın.

Bu, slaytın görüntüleme sırasında hareket etmesini önler. Teypi objektif lensin yoluna yerleştirmeyin. Coverslip'i dört slaytlı plaka adaptörüne monte edin.

Embriyolara mikroenjekte ediyorsanız, desiccation ve mikroenjeksiyon sırasında kapak alt kirli olmasını önlemek için bir slayt üzerinde embriyolar ile coverslip yerleştirin. Embriyoları 5 ila 10 dakika desiccate, sonra hemen bire bir halokarbon yağı ile kaplayın 700 halokarbon yağı 27, silikon spacer yarısına kadar doldurarak üst. Uzun bir yükleme ucu kullanarak yaklaşık iki mikrolitre enjektör ile iki veya üç mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.

Mikroenjektöre bir iğne saplayın ve pistonu ucun yarısına kadar bastırın, cam kılcal damarın içindeki hava basıncını artırın. Cam iğneyi cam bir kaydırağın üzerine indirin ve iğnenin ucunu yeni bir dokuz numaralı jiletle kesin, keskin bir açık uç üretmek için 45 derecelik bir açıyla kesin. Enjektör iğneden dışarı akmadan ucun dibine doğru akmalıdır.

Dikkatlice iğneucu üzerinde halokarbon yağı 20 mikrolitre ekleyin ve 45 derecelik bir açıyla açıldı yeniden kesti. Enjektör hızla akmaya başlamalıdır, bu yüzden pistonu geri çekerek basıncı ayarlamayı unutmayın. İğneyi görüş alanının ortasına konumlandırmak için mikromanipülörü kullanın.

Sonra iğne kaldırın ve altından cam slayt çıkarın. Embriyoları stereo mikroskop aşamasına, mikroenjeksiyon iğnesinin altına yerleştirin ve 50 kat büyütülerek üzerlerine odaklanın. İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine gelene kadar indirin.

Bir el ile slayt taşıma ve diğer mikroenjektör işletim, embriyoların bir satır enjekte. İğneyi kaldırın ve ikinci embriyo sırasını mikroenjeksiyon iğnesine maruz bırakmak için kaydırağı 180 derece döndürün. İğneyi indirve ikinci sıra embriyoları enjekte edin.

Bu protokol Drosophila embriyosunda mitoz sırasında mikrotübüllerin endoplazmik retikulum reorganizasyondaki rolünü incelemek için kullanılmıştır. Birkaç mikroenjekte ilaç tedavisinin ER yeniden yapılanması üzerindeki etkileri kantitatif olarak karşılaştırıldı. Yeni mikrotübül polimerizasyonunu engelleyen kolşisinin, mitoz sırasında iri direklere ER'nin lokalizasyonunu önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur.

32 embriyo için zaman atlamalı görüntüleme verileri elde edildi. Ortalama ve maksimum yoğunluk ölçümleri özel bir MATLAB komut dosyası kullanılarak 12, 800 ilgi bölgesinden analiz edildi. Bu protokolü ilk kez denerken, herhangi bir adımda çok uzun sürmeyin, aksi takdirde görüntülemek istediğiniz gelişimsel aşamayı kaçırma riskine girebilirsiniz.

Herhangi bir deneme denemeden önce bu protokolü adım adım uygulayın. Örnek hazırlama yöntemimiz, bir deney sırasında birden fazla embriyonun aynı anda edinimi nin kolaylaştırılmasını ve böylece nicel analiz için yeterli deneysel kopyaoluşturmayı kolaylaştırır. Bu protokol, nitel görüntüleme deneylerinden gelişimsel embriyolojigeçişine yardımcı olabilir.

Tek bir görüntüleme oturumu içinde birden fazla embriyo görüntü yeteneği de çoğaltmalar arasında deneysel gürültü ortadan kaldırır.