Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43

Bu protokol önemlidir, çünkü daha önce izlenemeyen bir serotipin genetik modifikasyonuna izin verir, bu da serotipin araştırılmasını ve anlaşılmasını mümkün kılar. Bu, aşı geliştirme gibi biyolojik çalışmalar için yollar açar. Prosedürü göstermek, Londra Hijyen ve Tropikal Tıp Okulu'ndan yardımcı doçent Vanessa S.Terra olacak.

Başlamak için, pGEM-T Easy System I üretici talimatlarını izleyerek bir ligasyon gerçekleştirerek plazmid pSD1 oluşturun. Reaksiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, kimyasal olarak yetkin E.coli Dh5-alfa'yı pSD1 ile dönüştürün, hücrelerin 50 mikrolitresini üç mikrolitre pSD1 ligasyon reaksiyonu ile buz üzerinde 15 dakika inkübe edin, ardından hücreleri termik şoka maruz bırakın ve hücreleri iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Hücreleri buzdan çıkarın ve 350 mikrolitre SOC ortamı ekleyin, ardından kültürü 37 santigrat derece ve 120 RPM'de iki saat inkübe edin. Plaka üzerinde büyüyen tüm kolonilerin plazmid omurgasına sahip olmasını sağlamak için 0.4 milimolar IPTG, mavi-beyaz seçim için mililitre X-Gal başına 0.24 miligram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş Luria-Bertani agar üzerindeki dönüşümü plakalayın. pSD1 içeren üç beyaz koloni seçin ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş 10 mililitre L-B'de gece boyunca büyümeler ayarlayın.

Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, kültürleri 3.082 G'de santrifüjleyin ve peleti plazmit ekstraksiyonu için kullanın. Plazmit DNA'sını çıkardıktan sonra, hem pSD1 plazmidi hem de spektinomisin kaseti için bir BamH1 kısıtlama sindirimi ayarlayın.

Kısıtlama sindirim reaksiyonlarını ve kontrollerini 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. Kısıtlama bittiğinde, ürünleri elektroforez ile analiz edin, ardından doğru bandı çıkarın ve ticari bir kit kullanarak saflaştırın. Ardından, BamH1 ile sindirilmiş pSD1 ve spektinomisin kullanarak bir ligasyon reaksiyonu çalıştırın.

Bu, plazmid pSD2'yi üretecektir. pSD2'yi daha önce açıklandığı gibi kimyasal olarak yetkin E.coli DH5-alfa'ya dönüştürün. Daha sonra, mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ve ampisilin ile desteklenmiş LBA'da büyüme yeteneklerine göre plazmid pSD2 taşıyan transformatörleri seçin ve plazmit DNA'sını çıkarın.

BHI'da bir gece boyunca S.pneumoniae 519/43 kültürü hazırlayın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte statik olarak büyümesine izin verin. Ertesi gün, kültürleri 1:50 ve 1:100 oranında 10 mililitre taze BHI suyunda seyreltin. Kültürü, 595 nanometredeki OD 0.05 ile 0.1 arasında olana kadar 37 santigrat derecede statik olarak inkübe edin.

Uygun OD'ye ulaşıldığında, 860 mikrolitre kültür alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 100 mikrolitre 100 milimolar sodyum hidroksit, 10 mikrolitre% 20 BSA, 10 mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür, mililitre CSP1 başına iki mikrolitre 50 nanogram ve 500 nanogram pSD2 ekleyin. Reaksiyonu statik olarak 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.

Daha sonra, üç saatlik bir inkübasyon süresi boyunca her saat mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ile desteklenmiş% 5 kan agar plakalarına 330 mikrolitre plaka. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Spektinomisine dirençli kolonileri, mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ile takviye edilmiş başka bir kan agar plakasına ve plazmit omurgasının varlığını test eden mililitre ampisilin başına 100 mikrogram takviye edilmiş kan agar plakalarına yamalayın.

Her iki plaka setini de gece boyunca inkübe edin. pSD2'nin doğru montajı, kısıtlama sindirimi ile doğrulandı. pSD2 daha sonra 519.43 vahşi tip hücreyi dönüştürmek için kullanıldı.

Bir gece inkübasyondan sonra spektinomisin üzerinde büyüyen koloniler pozitif dönüştürücüler olarak kabul edildi. Pnömolizin mutasyonunun fenotipik doğrulaması, D39, 519/43 vahşi tip ve mutant 519/43 delta kat için hemolitik aktivite değerlendirilerek gerçekleştirildi. Bu, kırmızı kan hücrelerinin hemolizi ile karşılaştırıldı% 0.5 saponin,% 100 olarak kabul edilir. Mutant, kırmızı kan hücrelerini parçalama yeteneğini kaybetti.

Tüm pozitif koloniler, yerleştirmenin yerini değerlendirmek için dizileme ile daha da doğrulandı. Homoloji bölgesi dışında bağlanma yerleri olan primerler kullanıldı. Dönüşüm reaksiyonunu gerçekleştirirken, reaktifleri doğru sırayla eklemek önemlidir.