Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43
September 11th, 2020
Burada, doğal olarak DNA ve intihar plazmidini elde etme kabiliyeti kullanılarak genetik olarak değiştirilebilen bir S. pneumoniae serotip 1 suşu 519/43'ü tanımlıyoruz. İlke kanıtı olarak, pnömolysin (kat) geninde izojenik bir mutant yapıldı.
Bu protokol önemlidir, çünkü daha önce izlenemeyen bir serotipin genetik modifikasyonuna izin verir, bu da serotipin araştırılmasını ve anlaşılmasını mümkün kılar. Bu, aşı geliştirme gibi biyolojik çalışmalar için yollar açar. Prosedürü göstermek, Londra Hijyen ve Tropikal Tıp Okulu'ndan yardımcı doçent Vanessa S.Terra olacak.
Başlamak için, pGEM-T Easy System I üretici talimatlarını izleyerek bir ligasyon gerçekleştirerek plazmid pSD1 oluşturun. Reaksiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, kimyasal olarak yetkin E.coli Dh5-alfa'yı pSD1 ile dönüştürün, hücrelerin 50 mikrolitresini üç mikrolitre pSD1 ligasyon reaksiyonu ile buz üzerinde 15 dakika inkübe edin, ardından hücreleri termik şoka maruz bırakın ve hücreleri iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Hücreleri buzdan çıkarın ve 350 mikrolitre SOC ortamı ekleyin, ardından kültürü 37 santigrat derece ve 120 RPM'de iki saat inkübe edin. Plaka üzerinde büyüyen tüm kolonilerin plazmid omurgasına sahip olmasını sağlamak için 0.4 milimolar IPTG, mavi-beyaz seçim için mililitre X-Gal başına 0.24 miligram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş Luria-Bertani agar üzerindeki dönüşümü plakalayın. pSD1 içeren üç beyaz koloni seçin ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş 10 mililitre L-B'de gece boyunca büyümeler ayarlayın.
Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, kültürleri 3.082 G'de santrifüjleyin ve peleti plazmit ekstraksiyonu için kullanın. Plazmit DNA'sını çıkardıktan sonra, hem pSD1 plazmidi hem de spektinomisin kaseti için bir BamH1 kısıtlama sindirimi ayarlayın.
Kısıtlama sindirim reaksiyonlarını ve kontrollerini 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. Kısıtlama bittiğinde, ürünleri elektroforez ile analiz edin, ardından doğru bandı çıkarın ve ticari bir kit kullanarak saflaştırın. Ardından, BamH1 ile sindirilmiş pSD1 ve spektinomisin kullanarak bir ligasyon reaksiyonu çalıştırın.
Bu, plazmid pSD2'yi üretecektir. pSD2'yi daha önce açıklandığı gibi kimyasal olarak yetkin E.coli DH5-alfa'ya dönüştürün. Daha sonra, mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ve ampisilin ile desteklenmiş LBA'da büyüme yeteneklerine göre plazmid pSD2 taşıyan transformatörleri seçin ve plazmit DNA'sını çıkarın.
BHI'da bir gece boyunca S.pneumoniae 519/43 kültürü hazırlayın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte statik olarak büyümesine izin verin. Ertesi gün, kültürleri 1:50 ve 1:100 oranında 10 mililitre taze BHI suyunda seyreltin. Kültürü, 595 nanometredeki OD 0.05 ile 0.1 arasında olana kadar 37 santigrat derecede statik olarak inkübe edin.
Uygun OD'ye ulaşıldığında, 860 mikrolitre kültür alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 100 mikrolitre 100 milimolar sodyum hidroksit, 10 mikrolitre% 20 BSA, 10 mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür, mililitre CSP1 başına iki mikrolitre 50 nanogram ve 500 nanogram pSD2 ekleyin. Reaksiyonu statik olarak 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.
Daha sonra, üç saatlik bir inkübasyon süresi boyunca her saat mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ile desteklenmiş% 5 kan agar plakalarına 330 mikrolitre plaka. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Spektinomisine dirençli kolonileri, mililitre başına 100 mikrogram spektinomisin ile takviye edilmiş başka bir kan agar plakasına ve plazmit omurgasının varlığını test eden mililitre ampisilin başına 100 mikrogram takviye edilmiş kan agar plakalarına yamalayın.
Her iki plaka setini de gece boyunca inkübe edin. pSD2'nin doğru montajı, kısıtlama sindirimi ile doğrulandı. pSD2 daha sonra 519.43 vahşi tip hücreyi dönüştürmek için kullanıldı.
Bir gece inkübasyondan sonra spektinomisin üzerinde büyüyen koloniler pozitif dönüştürücüler olarak kabul edildi. Pnömolizin mutasyonunun fenotipik doğrulaması, D39, 519/43 vahşi tip ve mutant 519/43 delta kat için hemolitik aktivite değerlendirilerek gerçekleştirildi. Bu, kırmızı kan hücrelerinin hemolizi ile karşılaştırıldı% 0.5 saponin,% 100 olarak kabul edilir. Mutant, kırmızı kan hücrelerini parçalama yeteneğini kaybetti.
Tüm pozitif koloniler, yerleştirmenin yerini değerlendirmek için dizileme ile daha da doğrulandı. Homoloji bölgesi dışında bağlanma yerleri olan primerler kullanıldı. Dönüşüm reaksiyonunu gerçekleştirirken, reaktifleri doğru sırayla eklemek önemlidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, DNA elde etme doğal yeteneğini kullanarak S. pneumoniae serotip 1 suş 519/43'ün genetik modifikasyonu için bir yöntem sunar. Çalışma, pnömolisin (ply) geninde izojenik bir mutantın oluşturulmasını gösterir ve daha ileri araştırmalar için yol açar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Genetik Mühendisliği
- Patojenik Araştırma
Arka Plan
- Streptococcus pneumoniae önemli bir insan patojenidir.
- Bu serotipin genetik modifikasyonu zorlu olmuştur.
- Genlerinin anlaşılması aşı geliştirmeye yardımcı olabilir.
- Bu çalışma genetik manipülasyonda yeni bir yaklaşım sunar.
Çalışmanın Amacı
- S. pneumoniae serotip 1'in genetik modifikasyonunu sağlamak.
- Araştırma amaçlı bir mutant suş oluşturmak.
- Pnömolisin ve patojenezdeki rolü üzerindeki çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- pGEM-T Easy Sistem I kullanılarak pSD1 plazmidinin oluşturulması.
- E. coli Dh5-alpha'nın ligasyon reaksiyonu ile transformasyonu.
- Kompetan hücreler için inkübasyon ve termal şok prosedürleri.
- Standart moleküler tekniklerle genetik modifikasyonların doğrulanması.
Ana Sonuçlar
- Ply geninde izojenik mutantın başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Gen modifikasyonu için protokolün etkinliğinin gösterilmesi.
- Aşı araştırma ve geliştirme için potansiyel etkiler.
- S. pneumoniae üzerinde çalışmalar için yeni bir modelin kurulması.
Sonuçlar
- Yöntem, daha önce zorlu olan bir serotipin genetik manipülasyonuna izin verir.
- Bu, biyolojik araştırmalar için yeni yollar açar.
- Daha fazla çalışma, bu tekniği aşı geliştirme için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Genetic modification of Streptococcus pneumoniae serotype 1 has been a longstanding barrier in infectious disease research, particularly for vaccine and therapeutic target validation in high-burden regions. This protocol enables functional genomics in a clinically relevant strain, supporting mechanistic de-risking of virulence factors like pneumolysin. By establishing a reliable mutagenesis system, it improves predictive confidence in target selection and accelerates preclinical evaluation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isogenic mutant construction in a clinically relevant serotype.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of virulence genes such as ply.
- Strategic Value: Supports target de-risking by linking genotype to phenotype in infection models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates defined mutant strains for standardized phenotypic assays, including hemolysis and infection models.
- Operational Value: Establishes a workflow for generating isogenic controls essential for assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables scalable screening of genetic variants using selectable markers and counter-selection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates phenotype-genotype correlation in vivo using intraperitoneal and intranasal challenge models.
- Operational Value: Produces validated mutant stocks for downstream efficacy and safety testing.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing serotype-specific pathogenic mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling target validation through genetic manipulation prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene knockout to clarify pathway involvement in pathogenesis.
- Screening: Generates isogenic mutant panels for comparative phenotypic screening in cell-based and animal models.
- Analytics: Enables quantitative measurement of dependent variables such as hemolytic activity and bacterial burden in tissues.
- Translational Research: Connects molecular findings to preclinical outcomes by comparing infection phenotypes across serotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for serial mutagenesis applicable to other vaccine candidate antigens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in serotype-specific pathogenesis.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible method for generating defined genetic mutants in S. pneumoniae.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by enabling early assessment of target essentiality and virulence contribution.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on virulence factors before costly preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial transformation, and allelic exchange techniques.
- Dependent on access to electroporation or chemical transformation systems for E. coli and S. pneumoniae.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, restriction digestion, and ligation to ensure plasmid integrity.
- Requires biosafety level 2 containment for handling pathogenic S. pneumoniae strains.
- Success depends on optimizing competence-inducing conditions, including CSP1 concentration and calcium chloride levels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
