Name: Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Keşfedin bakteriyel kalıcılığı etkileyen kimyasal bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemiyle. Bu protokol ilaç panelleri ve gen kütüphaneleri için uyarlanabilir. Görsel gösterimler araştırmacılara zaman yönetiminde yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Orman Lab üyelerine bu çalışma sırasındaki değerli girdileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIAID K22AI125468 kariyer geçiş ödülü ve Houston Üniversitesi başlangıç hibesi tarafından finanse edildi.

1. Büyüme ortamının hazırlanması, ofloksasin çözeltisi ve E. coli hücre stokları
<ol><li>Normal Luria-Bertani (LB) ortamı: Deiyonize (DI) suya 10 g/L tripon, 10 g/L sodyum klorür (NaCl) ve 5 g/L maya özü ekleyin. Otomatik kapatarak ortamı sterilize edin.</li>
	<li>LB agar plakaları: DI suyuna 10 g/L tripon, 10 g/L NaCl, 5 g/L maya özü ve 15 g/L agar ekleyin ve ortamı otomatik kapatarak sterilize edin. İstenilen sıcaklıkta (~55 °C), kare plakalara (10 x 10 cm) ~30 mL agar ortamı dökün. Plakaları kurutun ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Modifiye LB ortamı: DI suyuna 10 g/L tripton ve 5 g/L maya özü ekleyin. Otomatik kapatarak ortamı sterilize edin.</li>
	<li>Osmolyte dahil modifiye LB ortamı: 2x değiştirilmiş LB ortamını eşit hacimlerde 2x osmolyte çözeltisi ile karıştırın. 2x modifiye LB ortamı hazırlamak için DI suyuna 20 g/L tripton ve 10 g/L maya özü ekleyin ve otomatik olarak kapatarak sterilize edin. 2x osmolyte çözeltisini hazırlamak için, ilgi osmolytesini (2x miktarı) DI suyunda çözün ve ardından çözeltiyi filtreleyin. NOT: İlgi osmolyte ve konsantrasyonları Fenotip Mikroarray tarama tahlillerinden belirlenebilir (bkz. Protokol 4). Bununla birlikte, test edilen ozmolit ve ilişkili 2x konsantrasyonu araştırmanın niteliğine bağlı olarak ayarlanabilir. Örneğin, 1 mM sodyum klorürün etkisini incelemek için, 2x osmolit çözeltisi 2 mM sodyum klorür çözeltisi olacaktır.</li>
	<li>Ofloksasin stok çözeltisi (5 mg/mL): 1 mL DI suya 5 mgloksasin (OFX) tuzu ekleyin. OFX'in sudaki çözünürlüğünü artırmak için 10 μL 10 M sodyum hidroksit ekleyin ve ardından çözeltiyi filtreleyin. Aliquots hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. NOT: Ofloksasin, hem büyüyen hem de büyümeyen bakteri hücreleri için yaygın olarak kullanılan bir quinolone antibiyotiktir14,21. E. coli MG1655 hücreleri için OFX'in minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) 0.039–0.078 μg/mL19,20aralığındadır. Ayrıca ampisilin ve kanamycin gibi diğer antibiyotiklerin kalıcı araştırmalarda yaygın olarak kullanıldığını unutmayın. Antibiyotik seçimi çalışmanın doğasına bağlıdır.</li>
	<li>
E. coli MG1655 hücre stokları: 14 mL test tüpünde (snap-capped) tek bir koloni ile 2 mL normal LB ortamını aşılayın ve hücreleri 250 rpm ve 37 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda kültürlendir. Hücreler sabit faza ulaştığında, hücre kültürünün 500 μL'sini kriyojenik bir şişede% 50 gliserol (steril) 500 μL ile karıştırın ve -80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>2. Önceden var olan kalıcıları ortadan kaldırmak için hücrelerin yayılması
<ol><li>Bir gece kültürü hazırlamak için, steril bir pipet ucu ile donmuş bir hücre stoğundan az miktarda hücre kazıyın (gliserol hücre stoğunu çözmeyin) ve hücreleri 14 mL snap-capped test tüpünde 2 mL modifiye LB ortamında aşılayın. 250 rpm ve 37 °C'de 12 saat boyunca bir yörünge çalkalayıcıdaki hücreleri kültüre edin.</li>
	<li>İlk yayılma<ol>
<li>12 saat sonra, steril bir alüminyum folyo ile kaplı 250 mL şaşkın bir şişede 250 μL geceleme kültürünü 25 mL taze modifiye LB ortamına aktarın.</li>
		<li>Hücreler orta üstel faza ulaşana kadar hücre kültürünü 250 rpm ve 37 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda büyütün (OD600 = 0.5).</li>
		<li>Her 30 dakikada bir mikro plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu600 nm(OD 600) olarak ölçün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkinci yayılma<ol>
<li>OD600 = 0,5'te, ilk şişeden 250 μL hücre kültürünü 250 mL'lik şaşkın bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamına seyreltin.</li>
		<li>İkinci hücre kültürünü 250 rpm ve 37 °C'de OD600 =0.5'ekadar bir yörünge çalkalayıcıda büyütün.</li>
		<li>Optik yoğunluğu her 30 dakikada bir ölçün. NOT: Bir gecede kültür önemli miktarda kalıcı hücreye sahip olabilir4,5,22. Yukarıda açıklanan seyreltme/büyüme döngüsü yöntemi5, hücreleri mikroarraylara aktarmadan önce bu önceden var olan kalıcıları ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Bunların ortadan kaldırılması, Protokol 3'te açıklanan testle gece kültürlerinin kalıcı düzeyleri ölçülerek doğrulanabilir. Bu yöntem daha önceki bir çalışmada zaten doğrulanmıştır19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Önceden var olan kalıcı hücrelerin ortadan kaldırılmasının doğrulenmesi
<ol><li>İkinci yayılmadan sonra (bkz. adım 2.3), hücre kültürünün 250 μL'sini (OD600 = 0.5) 25 mL taze modifiye LB ortamında 250 mL şaşkın bir şişede seyreltin. NOT: Kontroller için, 250 mL'lik bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamında 250 μL geceleme kültürünü seyreltin (bkz. adım 2.1). Hücreleri şişeye aktarmadan önce, geceleme kültürünün hücre yoğunluğu, OD600 = 0.5 elde etmek için taze modifiye LB ortamında ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 25 μL OFX stok çözeltisi (5 mg/mL) ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. OFX'in son konsantrasyonu tahlil kültüründe 5 μg/mL'dir.</li>
	<li>250 rpm ve 37 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda test kültürünü kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tedavi sırasında her saat (0 saat dahil, OFX'i test kültürüne eklemeden önceki zaman noktası), tahlil kültürünün 1 mL'lik kısmını şişeden 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 17.000 x g'da mikrosantrifüj tüpündeki test kültürünü santrifüj edin.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan 950 μL'lik süpernatantını dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Mikrosantrifüj tüpüne 950 μL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Antibiyotik konsantrasyonu minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) altında olana kadar toplam 3x için 3,5-3,7 yıkama adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 μL PBS çözeltisinde yeniden kullanın, böylece 10x konsantre bir numune elde edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 96 kuyu yuvarlak alt plaka kullanarak 90 μL PBS çözeltisinde altı kez seri olarak seyreltin.</li>
	<li>Antibiyotiksiz taze agar plakalarında 10 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonu tespit edin. Algılama sınırını artırmak için, kalan 90 μL hücre süspansiyonu taze bir agar plakasına plakalayın.</li>
	<li>Agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın ve ardından koloni oluşturan birimleri (CFO' lar) sayın. 1 mL tahlil kültüründeki toplam CFO sayısını hesaplarken seyreltme oranlarını hesaba katın. Öldürme eğrileri, logaritmik CFU değerlerinin antibiyotik tedavisinin süresine göre çizilerek oluşturulur. NOT: E. coli hücreleri19,20için bifazik öldürme eğrisi elde etmek için 6 h OFX tedavisi yeterlidir. Yayılan hücrelerin kalıcı seviyesi (CFU sayıları ile 6 saat olarak ölçüldüğünde) gece kültürününkinden önemli ölçüde daha az olmalıdır. Protokol 2 ve 3'te açıklanan işlemler araştırma tasarımına bağlı olarak düzenli LB ile gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>4. Microarray plaka taramaları 
<ol><li>Mikroarray hücreli kültürlerin hazırlanması<ol>
<li>250 μL üstel fazlı hücreleri 50 mL santrifüj tüpünde 25 mL taze modifiye LB ortamına aktarın. Hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın. NOT: Üstel fazlı hücreler (OD600 = 0.5) ikinci yayılma adımından elde edilir (bkz. adım 2.3).</li>
		<li>Seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir 50 mL rezervuara aktarın.</li>
		<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 150 μL'lik kısmını bir mikroarray kuyusuna, yani çeşitli ozmolitler içeren 96 kuyu plakasına aktarın. NOT: Osmolytes olmayan kuyular kontrol görevi gösterir.</li>
		<li>Mikroarray'ı gaz geçirgen sızdırmazlık zarı ile örtün.</li>
		<li>Plakayı 37 °C ve 250 rpm'de 24 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda kuluçkaya yaslayın. NOT: Bu deneylerde, çeşitli konsantrasyonlarda kurutulmuş halde çok çeşitli ozmolitler, pH tamponları ve diğer kimyasalları içeren Fenotip Mikroarrayları (PM-9 ve PM-10) gibi ticari olarak mevcut plakalar kullanılmıştır. Bu mikroarraylar yarım alan 96 kuyu plakası formatlarındadır. Kültür hacimleri, kullanılan plakaların türüne bağlı olarak ayarlanmalıdır. Mikroarraylar manuel olarak da oluşturulabilir (aşağıya bakın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroarray plakalarının manuel hazırlanması<ol>
<li>75 μL 2x osmolyte çözeltilerini yarım alanlı 96 kuyu plakasının kuyularına aktarın.</li>
		<li>500 μL'lik üstel fazlı hücreleri 50 mL santrifüj tüpünde 25 mL modifiye LB ortamına aktarın. Hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın. NOT: Aşılama oranı 4.1'de açıklanan mikroarray tarama protokolü ile uyumlu olacak şekilde ayarlandı.</li>
		<li>2x ozmolit çözeltileri içeren yarım alanlı 96 kuyu plakasının her kuyusuna 75 μL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 °C ve 250 rpm'de 24 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda kuluçkaya yaslayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalıcı test plakaları hazırlanıyor<ol>
<li>50 mL santrifüj tüpünde 5 μg/mL OFX içeren 25 mL modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın.</li>
		<li>OFX ile modifiye LB ortamının 190 μL'lik kısmını çok kanallı pipet kullanarak rezervuardan genel bir düz tabanlı 96 kuyu plakasının (persister-tahlil plakası) her kuyusuna aktarın.</li>
		<li>Mikroarray'ı çalkalayıcıdan çıkarın (24 saat kültlemeden sonra) ve 10 μL hücre kültürünü mikroarraydan OFX ile modifiye LB ortamı içeren kalıcı test plakasının kuyularına aktarın.</li>
		<li>Kalıcı test plakasından 10 μL hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakası ve çok kanallı pipet kullanarak 290 μL PBS çözeltisinde üç kez seri olarak seyreltin.</li>
		<li>Seri seyreltmenin ardından, çok kanallı pipet kullanarak antibiyotik içermeyen taze agar plakalarında seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini tespit edin.</li>
		<li>Israrlı test plakasını (adım 4.3.3'te hazırlanmış) 37 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda ve 250 rpm'de 6 saat boyunca, plakayı gaz geçirgen sızdırmazlık zarı ile kapladıktan sonra kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Bir çalkalayıcıda 6 saat inkübasyondan sonra, kalıcı test plakasını çıkarın ve 4.3.4-4.3.5 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın ve ardından CFO'ları sayın. Antibiyotik tedavisinden önceki ve sonraki 6 h'lik CFU seviyeleri, her kuyuda kalıcı fraksiyonun hesaplanmasını sağlar. OFX tedavisinden önce CFU sayar, osmolitlerin ve E. coli canlılığının etkilerini değerlendirmeye de yardımcıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Belirlenen koşulların doğrulanmıştır
<ol><li>Üstel faz hücrelerinin 250 μL'lik kısmını mikroarray taramasından tanımlanan ozmolit içeren taze modifiye LB ortamının Adım 2,3 ila 25 mL'sine aktarın (bkz. Protokol 4).</li>
	<li>Şişeyi 250 rpm ve 37 °C'de 24 saat boyunca bir yörünge çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>24 saat sonra şişeyi çalkalayıcıdan çıkarın ve hücre kültürünün 250 μL'lik kısmını 250 mL'lik şaşkın bir şişede 25 mL taze modifiye LB ortamına aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu içine 25 μL OFX stok çözeltisi (5 mg/mL) ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. Şişeyi 37 °C ve 250 rpm'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tedavi sırasında her saat, test kültürünün 1 mL'lik kısmını şişeden 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 17.000 x g'da mikrosantrifüj tüpündeki test kültürünü santrifüj edin.</li>
	<li>950 μL süpernatant çıkarın ve 950 μL PBS ekleyin.</li>
	<li>3x için 5.6 ve 5.7 yıkama adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 μL PBS çözeltisinde yeniden kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 96 kuyu yuvarlak alt plaka kullanarak 90 μL PBS çözeltisinde 6x'i seri olarak seyreltin.</li>
	<li>Seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini antibiyotiksiz taze bir agar plakasında tespit edin. Algılama sınırını artırmak için, kalan 90 μL hücre süspansiyonu taze bir agar plakasına plakalayın.</li>
	<li>Agar plakasını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın ve ardından CFO'ları sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
<li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li>
<li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li>
<li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li>
<li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li>
<li>Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).</li>
<li>Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li>
<li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li>
<li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).</li>
<li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+%28p%29ppGpp+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li>
<li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).</li>
<li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).</li>
<li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li>
<li>Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+The+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).</li>
<li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li>
<li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yüksek verim kalıcı tahlili, çeşitli kimyasalların E. coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir. Ticari PM plakalarına ek olarak, mikroarraylar adım 4.2'de açıklandığı gibi manuel olarak inşa edilebilir. Ayrıca, burada sunulan protokol esnektir ve 96 kuyu plakası formatında olan ilaç panelleri ve hücre kütüphaneleri gibi diğer mikroarrayları taramak için kullanılabilir. Büyüme evresi, aşılama oranı ve ortam dahil olmak üzere deneysel koşullar bu kütüphaneleri te...

Bakteri kültürleri, alışılmadık derecede yüksek antibiyotik seviyelerine geçici olarak hoşgörülü olan kalıcı hücrelerin küçük bir alt nüfusunu içerir. Persister hücreleri genetik olarak antibiyotiğe duyarlı kins ile aynıdır ve hayatta kalmaları geçici büyüme inhibisyonlarına bağlanmıştır1. Persister hücreleri ilk olarak Gladys Hobby2 tarafından keşfedildi, ancak bu terim ilk olarak Joseph Bigger tarafından penisilinle tedavi edilen Staphylococcus pyogenes kültürlerinde tanımlandığında kullanıldı3. Balaban ve ark.4 tarafından yayınlanan ufuk açıcı bir çalışma iki kalıcı tip keşfetti: öncelikle sabit fazdan geçişle oluşturulan tip I varyantları ve üstel büyüme sırasında sürekli olarak oluşturulan tip II varyantları. Kalıcılar, antibiyotik tedavileri sırasında çeşitli aralıklarla kültür örneklerinin alındığı, yıkandığı ve antibiyotik yokluğunda kolonileşebilen hayatta kalan hücreleri saymak için tipik bir büyüme ortamına kaplandığı klonojenik sağkalım tahlilleri ile tespit edilir. Bir hücre kültüründe kalıcıların varlığı, ilk üstel çürümenin antibiyotiğe duyarlı hücrelerin ölümünü gösterdiği bifazik öldürme eğrisi4,5 ile değerlendirilir. Bununla birlikte, öldürme eğilimi zamanla azalır ve sonunda hayatta kalan kalıcı hücreleri temsil eden bir plato bölgesine yol açmaktadır.
Kalıcı hücreler tüberküloz6, kistik fibrozis7,kandidiyazis8 ve idrar yolu enfeksiyonları9gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Şimdiye kadar test edilen hemen hemen tüm mikroorganizmaların, son derece patojenik Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 ve Candida albicans8dahil olmak üzere kalıcı fenotipler ürettiği bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca kalıcı subpopulasyonlardan multidrug dirençli mutantların yükselişinin kanıtlarını salar11,12. Bu alandaki önemli çabalar, kalıcılık mekanizmalarının son derece karmaşık ve çeşitli olduğunu ortaya koydu; SOS yanıtı13 , 14, reaktif oksijen türleri (ROS)15,toksin/antitoksin (TA) sistemleri16,otofaji veya kendi kendine sindirim17ve ppGpp ile ilgili sıkı yanıt18 ile ilişkili stokastik ve deterministik faktörlerin kalıcı oluşumu kolaylaştırdığı bilinmektedir.
Kalıcılık fenotipini anlamada önemli ilerlemeye rağmen, ozmolitlerin bakteriyel kalıcılık üzerindeki etkileri tam olarak anlaşılamamıştır. Optimal ozmotik basıncın sürdürülmesi hücrelerin büyümesi, düzgün çalışması ve hayatta kalması için bir gereklilik olduğundan, ozmolitlerin derinlemesine incelenmesi anti-persister stratejiler için potansiyel hedeflere yol açabilir. Zahmetli, yüksek verimli tarama, kalıcılık fenotipinde çok önemli bir rol oynayan metabolitleri ve diğer kimyasalları tanımlamak için çok etkili bir yaklaşım olmasına rağmen19,20. Bu çalışmada, E. coli persistence'ı önemli ölçüde etkileyen ozmolitleri tanımlamak için çeşitli ozmolitler (örneğin sodyum klorür, üre, sodyum nitrit, sodyum nitrat, potasyum klorür) içeren 96 kuyu plakası gibi mikroarraylar kullandığımız yayınlanmış yöntem19'utartışacağız.

<table><tbody><tr><td>14 ml test tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>E. coli suşu MG1655</td><td>Princeton Üniversitesi</td><td></td><td>Brynildsen laboratuvarından elde edildi</td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 oyuklu plaka</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Gaz geçirgen sızdırmazlık membranı</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Gama ışınlaması ile sterilize edilmiştir ve sitotoksin içermez</td></tr><tr><td>Yarım alan düz tabanlı 96 oyuklu plaka</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Moleküler genetik sınıfı</td></tr><tr><td>Ofloksasin tuzu</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC & ge; 97.5</td></tr><tr><td>Fenotip mikrodizisi (PM-9 ve PM-10)</td><td>Biyolog</td><td>N/A</td><td>PM-9 ve PM-10 plakaları sırasıyla çeşitli ozmolitler ve tamponlar içeriyordu:</td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 96 kuyulu plaka</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Sertifikalı ACS sınıfı</td></tr><tr><td>Sodyum nitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>ACS reaktif sınıfı</td></tr><tr><td>Sodyum nitrit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>% 98 saflıkta</td></tr><tr><td>Kare petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Moleküler genetik sınıfı</td></tr><tr><td>Varioskan lux çok modlu mikroplaka okuyucu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>600 nm'de</td></tr> <tr><td>optik yoğunluk ölçümü için kullanılırMaya özü</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Moleküler genetik sınıfı</td></tr></tbody></table>

bakteriyel kalıcılık Üzerindeki etkilerini aydınlatacak kimyasal bileşiklerin yüksek verimli taranmasını

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bakteriyel kalıcılar, yüksek konsantrasyonlarda antibiyotikleri tolere etme yeteneğine sahip fenotipik varyantların küçük bir altopülasyonu olarak tanımlanır. Tekrarlayan kronik enfeksiyonlarla ilişkili oldukları için önemli bir sağlık sorunudur. Strese bağlı mekanizmaların stokastik ve deterministik dinamiklerinin kalıcılıkta önemli rol oynadığı bilinse de, kalıcılık durumuna/kalıcılıktan fenotipik geçişin altında kalan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Çevresel sinyallerin tetiklediği kalıcılık faktörleri (örneğin karbon, azot ve oksijen kaynaklarının tükenmesi) kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, ozmolitlerin kalıcılık üzerindeki etkileri henüz belirlenmemiştir. Mikroarraylar (yani, çeşitli kimyasallar içeren 96 kuyu plakası) kullanarak, çeşitli ozmolitlerin Escherichia coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini yüksek verimde aydınlatacak bir yaklaşım tasarladık. Bu yaklaşım, ilaç panelleri ve gen nakavt kütüphaneleri gibi diğer tarama dizileri için kolayca uyarlanabilebileceği için dönüştürücüdür.

Şekil 1 deneysel protokolümüzü açıklar. Seyreltme/büyüme döngüsü deneyleri (bkz. Protokol 2), keren ve ark.5 tarafından gece kültürlerinden kaynaklanan kalıcıları ortadan kaldırmak için yapılan bir çalışmadan uyarlanmıştır. Şekil 2A, OFX tedavisinden önce ve sonra hücre kültürlerinin CFU seviyelerini belirlemek için kullanılan agar plakalarının temsili bir görüntüsüdür. Bu deneylerde hücreler, adım 4.2'de açıklandığı gibi yarım alan 96 ku...

Bu yöntem makalesinde, bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkisi olan ozmolitler gibi kimyasal bileşikleri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama stratejisi sunuyoruz.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Burada açıklanan protokol, bakteri kalıcılığını yüksek verimli bir şekilde önemli ölçüde etkileyebilecek koşulları tanımlamayı mümkün kılar. Bu yöntem, ilaç panelleri, gen kütüphaneleri ve daha fazlası gibi çeşitli alanlar için taramaya kolayca uyarlanabilir. Yöntem, aynı anda gerçekleştirilecek çeşitli alt adımları içerdiği için, görsel gösterim araştırmacıların kesin sonuçlar elde etmek için zamanlamalarını yönetmelerine yardımcı olabilir.Mikroarray hücre kültürleri hazırlayarak başlayın. 250 mikrolitre üstel faz hücresini 50 mililitrelik santrifüj tüpünde 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın.Seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir 50 mililitrelik rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 150 mikrolitresini çeşitli kimyasallar içeren bir mikroarray plakasının her kuyusuna aktarın. Mikroarraylar, metin el yazmasında açıklanan yöntemi izleyerek manuel olarak da oluşturulabilir.Mikroarray plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve 37 santigrat derece ve 250 RPM'de 24 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Daha kalıcı test plakaları yapmak için, 50 mililitre santrifüj tüpünde mililitre Ofloksasin başına beş mikrogram içeren 25 mililitre modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın. Modifiye LB ortamının 190 mikrolitresini genel bir düz alt 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın.24 saatlik inkübasyondan sonra, mikroarray'ı çalkalayıcıdan çıkarın ve 10 mikrolitre hücre kültürünü mikroarraydan Ofloxacin ile modifiye LB ortamı içeren kalıcı test plakasının kuyularına aktarın. Kalıcı deneme plakasından 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak bir alt 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanarak 290 mikrolitre PBS çözeltisinde üç kez seri olarak seyreltin. Daha sonra antibiyotik içermeyen taze agar plakalarında seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini tespit edin.Kalıcı test plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve altı saat boyunca 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir yörünge çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Altı saatlik inkübasyondan sonra, seri seyreltme ve lekelenmeyi agar plakalarında tekrarlayın. Agar plakalarını 37 santigrat derecede 16 saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra koloni oluşturan birimleri veya CFO'ları sayın. Her kuyudaki kalıcı fraksiyonu hesaplamak için antibiyotik tedavisinden önce ve altı saat sonra CFU seviyelerini kullanın. OFX tedavisinden önce CFU sayar, osmolites'in e coli canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye de yardımcı yardımcıdır.250 mikrolitre üstel faz hücresini mikroarray taramasından tanımlanan osmolit içeren 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Matarayı 250 RPM ve 37 santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda 24 saat boyunca kuluçkaya yatır. 24 saat sonra şişeyi çalkalayıcıdan çıkarın ve hücre kültürünün 250 mikrolitresini 250 mililitrelik şaşkın bir şişede 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın.Hücre süspansiyonu için 25 mikrolitre Ofloxacin stok çözeltisi ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. Şişeyi 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Tedavi sırasında her saat, Ofloxacin'in eklenmesinden önceki bir zaman noktası da dahil olmak üzere, test kültürünün bir mililitresini şişeden 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üç dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin.950 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve hücreleri 950 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 mikrolitre PBS çözeltisinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın ve 96 kuyu yuvarlak alt plakanın içinde 90 mikrolitre PBS ile altı kez seri olarak seyreltin.Seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini antibiyotiksiz bir agar plakasında tespit edin. Algılama sınırını artırmak için, kalan 90 mikrolitre hücre süspansiyonunun plakasını taze bir agar plakasına koyun. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, sonra CFO'ları sayın.OFX tedavisinden önce ve sonra hücre kültürlerinin CFU seviyelerini belirlemek için kullanılan agar plakalarının temsili bir görüntüsü burada gösterilmiştir. İlk sütun denetim grubudur. İkinci sütunda 100 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler, üçüncü sütunda ise 60 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler bulunmaktadır.Basitlik için, sadece iki osmolites buraya odaklanmıştır. 96 kuyu plakasında test edilen hücre kültürlerinin plakalarından ve kalıcı fraksiyonlarından alınan CFU verilerinin grafiksel bir gösterimi burada gösterilmiştir. Fraksiyonları hesaplamak için, kalıcı sayımlar antibiyotik tedavisinden önce elde edilen hücre sayılarına normalleştirildi.Byphasic kill eğrileri oluşturmak için, hücreler belirtilen osmolitler ve şaşkın şişelerle 24 saat boyunca 25 mililitre değiştirilmiş LB ortamında kültürlendi, daha sonra kalıcı numaralandırma için kalıcı test şişelerine aktarıldı. Bu protokolü denerken, agar plakasındaki hücreleri tespit etmenin emek yoğun olduğunu ve odaklanma gerektirdiğini unutmayın. Adım sırasındaki bir hata, test edilen koşullar arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir.Bu nedenle, deneyden önce aynı anda birden fazla örneği tespit etmek önemlidir. Bu protokolün ardından, kalıcılık üzerindeki etkileri incelemek için ilaç panelleri ve mutant hücre kütüphaneleri taranabilir. Bu tarama ile bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkiye sahip bir dizi osmolite ve PS durumu belirledik.

high-throughput-screening-chemical-compounds-to-elucidate-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Venkateswaran, S., ve diğerleri. Tıbbi Cihazlar için Bakteri Kovucu Polimerlerin Yüksek Verimli Tanımlanması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, karışık bakteri kültürlerine maruz bırakılan bir mikrodizi slaytı kullanarak bakteri kovucu polimerleri tanımlamak için yüksek verimli bir yöntemi göstermektedir. Bakteriyel bağlanma, azaltılmış sinyalin minimum yüzey ekine sahip polimerleri gösterdiği DAPI floresansı ile değerlendirilir.

Mikrodizi taraması ile bakteri kovucu polimerlerin yüksek verimli tanımlanması

Bu videoda, ozmolitlerin bakteriyel kalıcıların oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir yöntem gösteriyoruz. Bakteri hücreleri önce ozmotik stresi indüklemek için ozmolitlere maruz bırakılır, kalıcı oluşumu tetikler, daha sonra kalıcıları saymak için antibiyotiklerle muamele edilir.

İn Vitro Persister Testi: Osmolitlerin Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Charcoal agar r esazurin assay (CARA), test ajanlarının replike eden, replike olmayan veya her ikisi olan mikobakterilere karşı aktivitesini değerlendirmek için yarı kantitatif, orta verimli bir yöntemdir.  CARA, zamana ve konsantrasyona bağlı aktivitenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir ve koloni oluşturan birim (CFU) tahlilleri ile izlenecek parametreleri tanımlar.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Keşfedin bakteriyel kalıcılığı etkileyen kimyasal bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemiyle. Bu protokol ilaç panelleri ve gen kütüphaneleri için uyarlanabilir. Görsel gösterimler araştırmacılara zaman yönetiminde yardımcı olur.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Daha fazla video keşfet