Name: Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin, biyolüminesan E. coli kullanarak yenidoğan sepsisinin gerçek zamanlı görüntüleme modelini. Bu yöntem, bakteri yayılımını izlemeyi ve hastalık belirteçlerini patojen yüküyle ilişkilendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kurumsal Fonlar tarafından C.M.R.'ye destek ve.M.

<ol><li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+a+major+global+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li>
<li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+compromise+protective+immunity+in+a+mouse+model+of+Gram-negative+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis.</a> Infections and Immunity. , (2019).</li>
<li>Schrag, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Early-Onset+Neonatal+Sepsis%2C+2005+to+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014.</a> Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).</li>
<li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+onset+neonatal+sepsis%3A+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li>
<li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States%2C+2005-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+and+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li>
<li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).</li>
<li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+an+international+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li>
<li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li>
<li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li>
<li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li>
<li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+L-selectin+and+CD11b+on+neutrophils+of+adults+and+neonates+during+the+first+month+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life.</a> Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).</li>
<li>Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+antigen-presenting+cell+function+in+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective antigen-presenting cell function in human neonates.</a> Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).</li>
<li>Le Garff-Tavernier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NK+cells+display+major+phenotypic+and+functional+changes+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.</a> Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).</li>
<li>Weinberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+reduced+responsiveness+of+neonatal+neutrophils+to+distinct+chemoattractants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants.</a> Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewss+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%2C+8th+ed%22">Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li>
<li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+new+insights+into+metastasis+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).</li>
<li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li>
<li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Patho%22%5BJournal%5D)">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li>
<li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li>
<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
<li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Neonatal farelerde bakteriyel sepsisi indükleyen subskapular enfeksiyon modelimiz, bakteriyel patojenlerin uzunlamasına yayılmasını gerçek zamanlı olarak incelemek için yeni bir yöntemdir. İntravital görüntüleme, bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak yenini keşfetme fırsatı sağlar. Bu bakteriyel yayma kinetik anlamak ve daha fazla hastalığın uygun aşamasında konak yanıt ve hasar çalışma için önemlidir. Fare yavrularına bakteriyel inokülin subskapular enjeksiyonu deri altı, subskapular enjeksiyonuygulanır. Bu enjeksi...

Bakteriyel sepsisenfeksiyonakarşı yeterli koruma sağlamaz yaşamın ilk günlerinde benzersiz bir bağışıklık profili sergileyen yeniler için önemli bir endişe 1 . Yenidoğan sepsis önemli bir ABD sağlık sorunu sadeceABD'deyılda 75.000 'den fazla vaka için muhasebe olmaya devam ediyor 2 . Bu enfeksiyonları derinlemesine incelemek için, insan hastalığının yönlerini özetleyen yeni hayvan modelleri gereklidir. Biz Escherichia colikullanarak bir neonatal fare enfeksiyonu modeli kurduk , O1:K1:H73. E. coli ABD'de yenidoğan sepsisin ikinci önde gelen nedenidir, ancak sepsis ilişkili mortalite çoğunluğu sorumlu4,5. Ancak, ön dönem ve çok düşük doğum ağırlığı (VLBW) bebekler bağımsızolarak5 olarak kabul edildiğinde önde gelen nedenidir. K1 serotipi en sık invaziv kan dolaşımı enfeksiyonları ve menenjit ile ilişkilidir6,7. Şu anda, antibiyotik ve destekleyici bakım dışında başka bir tedavi seçeneği vardır. Bu arada, antibiyotik direnci oranları birçok patojenik bakteriler için artmaya devam, E. coli bazı suşları ile yaygın tedavide kullanılan antibiyotik çok sayıda dirençli8. Bu nedenle, sepsis ve ev sahibi tepki mekanizmalarını yeniler üzerinde incelemek için yöntemler üretmeye devam etmek zorunludur. Bu sonuçlar mevcut tedaviler ve enfeksiyon sonuçları üzerine geliştirmek için yardımcı olabilir.
Neonatların bağışıklık durumu yetişkinlere göre hem henotibik hem de fonksiyonel farklılıklar ile karakterizedir. Örneğin, interlökin (IL)-10 ve IL-27 gibi anti-inflamatuar ve düzenleyici sitokinlerin yüksek seviyeleri, kordon kanı kaynaklı makrofajlar tarafından üretildiği gösterilmiştir ve9,10,11. Bu, yenidoğan hücrelerinden erişkin retlere göre sıklıkla bildirilen IFN-α, IFN-on, IL-12 ve TNF-α düzeylerinin daha düşük olması ile tutarlıdır10. Ayrıca, neonatal bağışıklık sistemi yetişkinlere göre bir Th2 ve düzenleyici T hücre yanıtı doğru çarpık12. Nötrofil, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositlerin yüksek sayıda da neonatlarda mevcuttur, ancak önemli fonksiyonel bozukluklar ile. Bu hücre yüzey belirteçleri ve immaturity13,14,15öneririz antijen sunumu ifade kusurları içerir. Ayrıca, neonatal nötrofiller kemotaktik faktörlere göç etme kabiliyetlerinde önemli ölçüde eksiktir16. Miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MKHK) da neonatlarda yüksek seviyelerde bulunur ve son zamanlarda IL-2711kaynağı olarak gösterilmiştir. MKh'ler T hücrelerine karşı son derece bastırıcıdır17. Bu veriler, yenidoğan bağışıklığında enfeksiyona karşı duyarlılığın artmasına neden olan sınırlamaları toplu olarak göstermektedir.
Neonatal sepsis sırasında bakteriyel yükün ilerlemesini incelemek ve koruyucu konak immün yanıtlarını incelemek için yeni bir enfeksiyon modeli geliştirdik. Yaşamın 3-4 gününde yenidoğan farelerin intraperitoneal uzaya veya kuyruk damarına enjekte etmesi zordur. Bizim modelinde, gün 3 veya 4 yavru skapular bölgeye bakteriyel inoculum veya PBS subkutan olarak uygulanır. Sistemik bir enfeksiyon gelişir ve lüminesanE E. coli O1:K1:H7 kullanarak, periferik dokularda yayılan bakteriyel yükü takip etmek için tek tek yenidoğan farelerini boylamsal olarak görüntüleyebiliriz. Bu, intravital görüntülemeyi kullanarak sepsis sırasında bakterilerin yayılmasının kinetiklerini anlamak için kullanılan ilk rapor edilen modeldir3.
Burada, yenidoğan farelerde septik E. coli enfeksiyonları neden bir protokol tarif3. Bakteriyel inokülün enjeksiyoniçin nasıl hazırlanacağını ve patolojinin değerlendirilmesi için dokunun nasıl hasat edilebildiğini, gen ekspresyonu analizi ile inflamatuar belirteçlerin ölçülmesini ve bakteri yükünün numaralandırmasını anlatıyoruz. Buna ek olarak, enfekte yenidoğan yenidoğanların intravital görüntüleme ve neonatal bağışıklık hücreleri tarafından bakteri öldürme niceliksel için lüminesan E. coli kullanımı da açıklanmıştır. Bu protokoller aynı zamanda yeniniler diğer önemli bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir. Burada sunulan veriler, translatable neonatal sepsis modelinde enfeksiyon dinamiklerini anlamak için genel bir yeni yaklaşımı temsil etmektedir.

<table><tbody><tr><td>1 mL İnsülin Şırınga</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>İnokulum veya PBS enjeksiyonu</td></tr><tr><td>% 10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>Histopatoloji</td></tr><tr><td>ACK Lizis Tamponu</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>Bakteriyel klirens testi</td></tr><tr><td>Hayvan Dövme Mürekkebi Yapıştır</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>Hayvan tanımlama</td></tr><tr><td>Hayvan Dövme Mürekkebi Yeşil Macun</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>Hayvan tanımlama</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6B.2 Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>Hücre</td></tr> <tr><td>izolasyonuEscherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (lusiferazı ifade eder)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>WVU'da</td></tr> <tr><td>şirket içinde inşa edilmiştirE.Z.N.A. HP Toplam Ekstraksiyon RNA Kiti</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco Triptik Soya Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>Bakteri üremesi</td></tr><tr><td>IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Sitokin ekspresyonu qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Sitokin ekspresyonu qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>Gerçek zamanlı kantitatif PCR</td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA sentezi</td></tr><tr><td>İzolasyon Tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Bakteriyel klirens testi</td></tr><tr><td>IVIS Spektrumu CT ve Canlı Görüntü 4.5 Yazılım</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>İntravital görüntüleme</td></tr><tr><td>LB Et suyu, Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td>Bakteri üremesi</td></tr><tr><td>EASYstrainer (Naylon Sepet)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>Hücre süzgeci</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>Plaka okuyucu</td></tr><tr><td>Pelet Havaneli Motor</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>Doku homojenizasyonu</td></tr><tr><td>Polipropilen Pelet Pestles</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Doku homojenizasyonu</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>cDNA sentezi</td></tr><tr><td>TNF-alfa Primer/Probe (Mm00443258)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Sitokin ekspresyonu qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent (GTCP)</td><td>Moleküler Araştırma Merkezi</td><td>TR 118</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr></tbody></table>

gram-negatif bakteriyel sepsisin yenidoğan görüntüleme modeli

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates onlar yaşamın ilk aylarında görüntülemek benzersiz bağışıklık profili nedeniyle bakteriyel sepsis riski altındadır. Yeninelerde yüksek mortalite oranlarından sorumlu bir serotip olan E. coli O1:K1:H7 patogenezinin incelenmesi için bir protokol oluşturduk. Yöntemimizde enfeksiyonun ilerlemesi sırasında farklı zaman noktalarında yenidoğan yavrularının intravital görüntülemesi kullanılmaktadır. Kandaki bakterilerin ölçülmesi, inflamatuar profilleme ve doku histopatolojisi ile paralel lik gösteren bu görüntüleme, sepsis sırasında enfeksiyon dinamiklerini anlamak için titiz bir yaklaşım anlamına gelir. Mevcut raporda, bakteriyel yüklerin karşılaştırılması ve hastalığın şiddetini karşılaştırmak için iki enfeksiyöz inokül modellenmiştir. Subscapular enfeksiyonun enfeksiyon sonrası 10 saat ile yaygın enfeksiyona yol açtığını bulduk. 24 saat, Parlak E. coli enfeksiyonu kan, akciğerler ve diğer periferik dokularda bol oldu. Akciğerlerde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu 24 saat önemlidir, ve bu hücresel infiltrasyon ve enfeksiyöz doz ile artar doku hasarı kanıt takip eder. İntravital görüntülemenin bazı sınırlamaları vardır. Bu bir Parlak sinyal eşiği ve anestezi sırasında neonates ile ortaya çıkabilecek bazı komplikasyonlar içerir. Bazı sınırlamalara rağmen, enfeksiyon modelimizin yenidoğan mürin sepsisi sırasında uzunlamasına enfeksiyon dinamiklerini anlamak için bir fikir verdiğini ve bugüne kadar iyice incelenmediğini görüyoruz. Biz bu model de erken yaşam sırasında diğer kritik bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir bekliyoruz.

Bu protokol neonatal farelerde bakteriyel sepsise neden oldu ve hastalığın seyrini incelemek için uzunlamasına intravital görüntüleme, kandaki bakterilerin numaralandırılması, patolojinin histolojik değerlendirmeleri ve inflamatuar sitokin ekspresyon profilleri kullandık. Zaman içinde hem düşük (~2 x 106 CPU) hem de yüksek (~7 x 106 CPU) inokülleri ile enfekte olan yenidoğan yavrularında morbidite belirtileri gözlendi. Daha fazla inokül alan yavrular, hareket kabiliyetinin azalması, duruşla...

Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Protokolümüz, deneysel bir neonatal sepsis modelinde bakteriyel yayma ve yük takibine ve hastalığın diğer belirteçlerini patojen yüküyle ilişkilendirebilme ye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, bireysel yenidoğan farelerde sepsisi uzunlamasına analiz etmemizi sağlayarak enfeksiyon dinamiklerini ve bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak gözlemleme ve karşılaştırma fırsatı sağlar. Yenidoğan sepsisi için girişimlerin klinik öncesi testleri bu yöntemle yapılabildiği gibi, bakterilerin konak kontrolünün etkilerinin izlenmesine olanak sağlar.Bir biyogüvenlik seviyesi iki kabine içinde ya yüksek veya düşük doz çöp gruplarına yaş eşleşen yavru yerleştirerek başlayın. Doğum sonrası üçüncü veya dördüncü günde, aşılamadan önce tüm yavruların ağırlıklarını kaydedin. Biyogüvenlik kabininde PBS veya yüksek veya düşük doz E.coli lux inoculum ile insülin şırıngaları yükleyin ve yüklü şırıngaları buza yerleştirin.Biyogüvenlik kabine içinde temiz bir yüzeye enjekte edilecek yenidoğan yerleştirin ve yavru scruff gibi boyun ense de deri yükseltmek. İğneyi deri ile kas arasında oluşturulan boşlukta derinin hemen altına yerleştirin. İğne deri altında hissedilebilir, aynı anda geri akışı önlemek için derinin kıstırılmış kısmını serbest ederken inoculant 50 mikrolitre enjekte, sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne çıkarın.Tüm yavrulara aynı şekilde enjekte edildiğinde, yavruları barajlarına geri döndürün. Enjeksiyondan hemen sonra ve bundan sonra uygun deneysel zaman noktalarında, E.coli lux enfekte yenidoğan fareler ve baraj ile kafesi biyogüvenlik seviyesi iki laminar akış başlığına yerleştirin ve yazılımı mikro BT bilgisayarında açın. Sistemi başlatmave sahne sıcaklığının 37 santigrat derecede kilitlenmesi ve CCD sıcaklığının negatif 90 santigrat derecede kilitlenmesi için bekledikten sonra, en fazla dört anestezili yavruyu eğilimli pozisyondaki görüntüleme odasına yerleştirin.Görüntüleme odasının kapağını kapatın ve Lüminesans görüntüleme seçeneğini seçin. Filtreyi aç ve sonrayı seçin ve uyarma filtresini engelleyecek şekilde ayarlayın ve emisyon filtresini de açın. 500, 520, 560, 580, 600 ve 620 nanometre seçin.Daha sonra anestezi iyileşene kadar izleyerek baraj ile kafese dönmeden önce yavruları görüntüleyin. Uygun deneysel uç noktada, bir biyogüvenlik kabinesinde, kontaminasyonu önlemek ve hayvanı sağ tarafına yerleştirmek için ötenazi yenisini %70 etanol ile aşındırın. Karın ve arka sol bacak arasındaki cildi kavramak için forceps kullanın ve bir deri kesi yapmak için ince ucu cerrahi makas kullanın.Daha sonra tüm dalak açığa çıkana kadar hayvanın arkasına doğru kesi devam edin. Dalağını karından çıkarmak ve aşağı doğru uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirmek için forsepsleri ve makasları kullanın. Akciğerleri elde etmek için, göğüs derisi tamamen soyma ve göğüs kafesi bölünmüş kadar yukarı kesilmiş makas ile göğüs tabanına girerek.Tek tek sağ ve sol akciğerleri kavramak ve torasik kavite akciğerleri kaldırmak için forceps kullanın. Kalp makasla akciğer dokusundan çıkar. Daha sonra akciğeri aşağı akım uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirin.Bir in vitro bakteriyel öldürme tahlili gerçekleştirmek için, steril bir içinde 40 mikrometre naylon süzgeç içine 40 mikrometre naylon süzgeç içine yerleştirin 10% fetal sığır serum ile desteklenen PBS beş mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak ve tek bir hücre süspansiyon içine doku ayrıştırmak için steril üç mililitreşyon şırınga piston kullanın. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj ile toplayın. Üç ila dört dalak başına kırmızı kan hücresi lisis tampon bir mililitre pelet resuspend.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, PBS dalak yıkayın ve pbs 250 mikrolitre sığır serum albumin ve sayma için iki milimolar EDTA ile birlikte pelet resuspend. Daha sonra, üreticiprotokolüne göre uygun immünomanyetik boncuklar ile Ly6 B2 pozitif hücreleri izole ve bir kez zenginleştirilmiş Ly6 B2 pozitif hücreleri tohum bir kez 10 siyah veya beyaz 96-iyi plaka iyi yoğunluk başına tam orta 100 mikrolitre başına beş hücre. Her kuyuda 100 mikrolitrelik son bir hacimde bakteriin inokülü istenilen sayıda hazırlayın ve hücre kültürü kuluçka sında bir saatlik kuluçka için her kuyuya tek başına 100 mikrolitre bakteriyel inokül veya orta ekleyin.Kuluçka sonunda, kalan hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve hücreleri iki saat daha hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürmek için mililitre başına 100 mikrogram gentamisin ile takviye edilmiş 200 mikrolitre taze tam ortam ile orta yı değiştirin. Kuluçka sonunda ve bundan sonraki her deneysel zaman noktasında, bir sonraki okuma kadar hücre kültürü kuluçka için plaka dönmeden önce kapaklı kültür plaka her kuyuda parlaklık ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Çoğu hayvan enfeksiyon sonrası 24 saat kanda yüksek düzeyde bakteri sergilerken, bazı yavrularda kanda düşük veya tespit edilemeyen bakteriler vardır, bu da enfeksiyonun bu zaman noktasına kadar temizlenebildiğini düşündürmektedir.Buna ek olarak, ekstrasellüler bakterilerin çıkarılması ndan önce bir saat boyunca biyolüminesans E.coli ile enfekte olan neonatal Ly6 B2 pozitif dalak hücreleri ve müteakip gentamisin tedavisi, üç saat içinde yüksek düzeyde parlaklık ifade etti ve bu da zamanla bakteriyel açıklık göstergesidir. Parlak bakterilerin canlı hayvan görüntülemesi, enfeksiyon sonrası 10 ve 24 saat içinde yenidoğan yavrularında bakteri yayılması ve büyümesindeki artışı daha da doğrular. Mikro BT ile birlikte intravital görüntüleme beyin içinde enfeksiyon foci belirlenmesini kolaylaştırır, akciğerler, ve diğer periferik dokular.Bazı yüksek enfekte farelerin akciğerleri, parlak bakteri sinyallerine eş lokalize inflamatuar konsolidasyon ile uyumlu opak bölgeler gösterir. Enfekte olmayan kontrol akciğerlerinde inflamatuar eksüda olduğu tahmin edilen bu bölgelergözlenmez. Kontrollere göre inflamatuar sitokin ekspresyonunda da belirgin bir artış gözlenir, alveoler duvarın belirgin kalınlaşma ile ilişkili hem düşük hem de yüksek inokül grupları, artmış alveoler kanama, ve bu hayvanlarda inflamatuar infiltrasyon.Unutulmaması gereken en önemli şey enjeksiyonları yaparken uygun tekniği uygulamak ve anestezi yi uygularken neonatlara sıkı dikkat etmektir. Bu tekniği kullanarak, girişimleri incelemek için neonatal sepsisi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilir ve immün yanıtı iyileştirmeye yönelik tedavilere ev sahipliği yapabiliriz.

a-neonatal-imaging-model-of-gram-negative-bacterial-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Seman, B. G., et.al. Gram-negatif bakteriyel sepsisin yenidoğan görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, nötrofillerin ve inflamatuar monositlerin neonatal fare dalaklarından izole edilmesini ve bunların parlak bakteri öldürücü testte uygulanmasını göstermektedir. Mekanik ayrışma, kırmızı kan hücresi lizisi, manyetik boncuk bazlı hücre zenginleştirmesi, bakteriyel kuluçka ve antibiyotik koruma konularını kapsar. Zamanlanmış lüminesans ölçümleri, başlangıçta bakteriyel...

Yenidoğan fare dalak fagositleriyle bakteriyel öldürmenin in vitro değerlendirmesi

Kaynak: Seman, B. G. ve diğerleri. Gram-negatif bakteriyel sepsisin neonatal görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)Video, kapsüllü biyolüminesans bakteriler kullanılarak sistemik enfeksiyonu incelemek için yeni doğumlu fare modelini gösteriyor. Yenidoğan yavrulara yüksek veya düşük dozlu bakteriyel askı enjeksiyonu yapılır ve doğum sonrası bakım için annelerine geri verilir. Kapsüllü bakteriler erken bağışıklık tespitinden kaçınır, sistematik olarak yayılır ve zamanla lüminesans görüntüleme...

Kapsüllenmiş Biyolüminesans Bakterilerle Yenidoğan Farelerde Enfeksiyonun Modellenmesi

Burada bir prosedür, Escherichia coli K1 kültürleri ile neonatal sıçanda sistemik enfeksiyon kurulması için tarif edilmiştir. Bu non-invazif prosedür da koroid pleksusa de mide-bağırsak yolunun kolonizasyonu, sistemik dolaşıma patojenin translokasyonu ve merkezi sinir sisteminin istilası izin verir.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli Escherichia coli Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Perinatal asfiksiyi takiben hipoksik-iskemik ensefalopati hayvan modelleri kullanılarak incelenebilir. Yenidoğan hipoksik-iskemik ensefalopatisinin bir domuz yavrusu modeli oluşturmak için gerekli prosedürleri gösteriyoruz.

Yenidoğan Hipoksik-İskemik Ensefalopati A Piglet Modeli

Prematüre ensefalopatisi, erken doğumdan kaynaklanan yaralanma ile ilişkili merkezi sinir sistemi anormalliklerini kapsar. Bu rapor, koryoamniyoniti taklit eden in utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik lipopolisakkarit uygulamasının (LPS) klinik olarak anlamlı bir sıçan modelini ve enfeksiyöz uyaranların ve plasental underperfüzyonun CNS gelişimi üzerindeki ilişkili etkisini açıklamaktadır.

Prematüre Modelleme Ensefalopati Sıçanlarda İçi amniyotik Lipopolisakkarid ile Prenatal Hipoksi-iskemi kullanma

Bu iletişim kuralı kurmak ve 7 günlük eski farelerde neonatal sepsis değerlendirmek için gerekli adımları sağlar.

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

FEMI'nin yavruların bağırsak sisteminin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için canlı organizmaların komplikasyonları olmadan anne iltihabına (FEMI) fetal maruziyeti simüle etmek için bir chorioamnionitis modeli geliştirdik. Bu, chorioamnionitis'i takiben bağırsak hasarı gelişimi için mekanistik nedenlerin incelenmesine izin verir.

Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Erken doğum (37 haftadan &lt; doğum), optimal olmayan önleme ve tedavi seçenekleriyle acil bir küresel sağlık sorunudur. Artan vajinal bakteriyel enfeksiyon kaynaklı erken doğumun bir fare modelini sunuyoruz ve ortaya çıkan yenidoğan morbidite ve mortalitesinin nasıl analiz edileceğini özetliyoruz.

Farelerde Yükselen Vajinal Enfeksiyon, Erken Doğum ve Yenidoğan Morbiditesinin Modellenmesi

Bu protokol, nekrotizan enterokolitin (NEC) yenidoğan fare modelini ve ardından yenidoğan murin ince bağırsağından lamina propria bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu özetlemektedir.

İmmün Hücre Profili Oluşturma için Nekrotizan Enterokolit ve Lamina Propria İzolasyonunun Yenidoğan Fare Modeli

Keşfedin, biyolüminesan E. coli kullanarak yenidoğan sepsisinin gerçek zamanlı görüntüleme modelini. Bu yöntem, bakteri yayılımını izlemeyi ve hastalık belirteçlerini patojen yüküyle ilişkilendirmeyi sağlar.

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Daha fazla video keşfet