Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Protokol, araştırmacıların, perigonadal beyaz yağ dokusu stromal hücrelerinin fonksiyonel ve moleküler olarak farklı alt popülasyonlarını ilgilenilen fare modellerinden izole etmelerine izin verir. Bu tekniğin avantajı, tüm aletlerin ve reaktiflerin yaygın olarak bulunmasıdır. Prosedürü göstermek, Dr.Rana Gupta'nın laboratuvarından kıdemli bir laboratuvar araştırma analisti olan Lavanya Vishvanath olacak.

Gonadal beyaz yağ dokusundan veya WAT'tan stromal vasküler hücre izolasyonundan sonra, hücre peletini oda sıcaklığında bir ila iki dakikalık inkübasyon için bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. 10 mililitre% 2 FBS ve PBS ile lizisi durdurun ve hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne süzün. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti FC bloğu ile desteklenmiş 400 ila 800 mikrolitre FBS ve PBS'de yeniden süspanse edin.

Dört santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, 400 ila 800 mikrolitre hücreyi floresan konjuge antikor boyaması için uygun sayıda tüpe aktarın ve hücreleri, 15 dakika boyunca dört santigrat derecede kontrol ve deneysel antikorlarla etiketleyin, ışıktan korunarak. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve hücreleri tüp başına 400 mikrolitre taze FBS ve PBS ile yıkayın. Yıkamadan sonra, peletleri tüp başına 400 ila 800 mikrolitre taze FBS ve PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikron filtre kapaklarından FACS için beş mililitre polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.

Antijen sunan hücreleri ve fibroinflamatuar progenitörleri elde etmek için kompanzasyon ve deney kapılarını ayarlayın. Hücre tasnif işleminden sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve yıkayın ve peletleri fraksiyon başına 500 mikrolitre gonadal antijen sunan hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Adipojenik ve adipojenik olmayan hücre fraksiyonlarının immünomanyetik boncuk ayrımı için, stromal vasküler peleti 10 mililitre MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten süzün

Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, MS tampon konsantrasyonunun mililitresi başına 10 ila sekizinci hücreden en fazla bir kez yeniden süspanse edin. Daha sonra, buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyon için altı hücreye bir kere on kere başına 0.25 gramdan fazla anti-CD31 ve anti-CD45 biotin konjuge antikor eklemeyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile dört mililitre MS tamponunda yıkayın ve peleti 100 mikrolitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin.

Buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyon için hücrelere 10 mikrolitre streptavidin nano boncuk ekleyin, ardından dört mililitre MS tamponunda başka bir yıkama yapın. Peleti 2.5 mililitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri beş mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. Etiketlenmemiş hücreleri yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne boşaltmadan önce tüpü beş dakika boyunca bir mıknatısın üzerine yerleştirin.

Yıkamayı gösterildiği gibi iki kez daha tekrarlayın, her yıkamadan sonra etiketlenmemiş hücreleri çekin ve endotelyal ve hematopoietik soy tükenmiş hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri 100 mikrolitre MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri, altıncı hücrelerin 10'u kadar buz üzerinde 15 dakika boyunca 0.25 mikrogramdan fazla olmayan Ly6C ve CD-9 antikoru ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, Ly6C pozitif adipojenik olmayan hücreleri toplamadan önce gösterildiği gibi bağlanmamış Ly6C negatif CD-9 negatif adipojenik hücreleri toplayın.

Daha sonra, her iki hücre popülasyonunu santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, fraksiyon başına 500 mikrolitre gonadal antijen sunan hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Farklılaşma için hücre kültürleri kurmak için, her bir fraksiyonu, 48 oyuklu bir kültür plakasının ayrı oyuklarında konsantrasyon olarak oyuk başına dördüncü hücrenin 10'u kadar dört kez plakalayın ve plakaları yedi ila 10 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Adiposit öncü hücreleri, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacak, fibroin enflamatuar progenitörleri ise adipogenez geçirmeye dirençli olacaktır.

Bu protokol kullanılarak, farklı stromal hücre popülasyonları, gösterildiği gibi FACS veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla yetişkin farelerin intraabdominal WAT depolarından izole edilebilir. İmmünomanyetik boncuk ayırma ile, adipojenik ve adipojenik olmayan hücreler gonadal WAT stromal vasküler fraksiyondan izole edilebilir. Akış sitometrisi ile gözlemlendiği gibi, adipojenik fraksiyon içindeki hücrelerin %75'i Ly6C negatif CD-9 negatif adiposit öncü hücreleri iken, adipojenik olmayan fraksiyonun %75'inden fazlası Ly6C pozitif fibroinflamatuar progenitör hücrelerdir.

Her iki yöntemde de izole edilen adiposit öncü hücreleri, kaplamadan sonraki yedi ila 10 gün içinde yüksek bir saflığa kadar lipid içeren adipositlere farklılaşır. Buna karşılık, adipojenik olmayan öncüler fibroblast benzeri kalır ve aynı kültür koşulları altında adiposit haline gelmezler. Protokol, perigonadal beyaz yağ dokusundan adipojenik ve fibroinflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için çalışır.

Benzer hücre popülasyonları, farelerin diğer yağ depolarında da bulunabilir. Bununla birlikte, seçimleri farklı antikorların kullanımına bağlı olacaktır. FACS ve manyetik ayırma yoluyla izole edilen hücre popülasyonları, hücre farklılaşmasının in vitro testleri için kullanılabilir veya gen ekspresyon analizi yoluyla daha fazla karakterize edilebilir.