Name: Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin, FACS veya immünomanyetik boncuk ayrımı kullanarak murin intraabdominal yağ dokusundan adipojenik ve fibroinflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını izole etme yöntemini. Bu teknik metabolik hastalık araştırmaları için fonksiyonel olarak benzersiz hücre tiplerinin incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, mükemmel teknik yardımları için Lisa Hansen ve Kirsten Vestergaard'a ve el yazmasının eleştirel okuması için P. Scherer, N. Joffin ve C. Crewe'ye minnettardır. Yazarlar, burada açıklanan protokollerin geliştirilmesinde mükemmel rehberlik ve yardım için UTSW Akış Sitometrisi Çekirdeğine teşekkür eder. R.K.G., NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ve NIDDK R01 DK119163 tarafından desteklenir. J.P., Danimarka İnovasyon Fonu'ndan bir doktora öncesi ödül ile desteklenmektedir.

Tüm hayvan protokolleri ve prosedürleri, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Gonadal beyaz yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
<ol><li>6-8 haftalık farelerden gonadal beyaz yağ dokusunu inceleyin ve yağ pedlerini 1x PBS çözeltisine yerleştirin.</li>
	<li>4 adede kadar yağ deposunu birleştirin (1-2 fareden 2-4 depo önerilir) ve dokuyu 200 μL sindirim tamponu (1x HBSS,% 1.5 BSA ve 1 mg / mL kollajenaz D) içeren 10 mL'lik bir beherde kıyın.</li>
	<li>Kıyılmış dokuyu 10 mL sindirim tamponu içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Karışımı 37 °C'de bir su banyosunda çalkalayarak 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için sindirilmiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Filtrelenmiş numuneyi% 2 FBS içeren PBS ile 30 mL'ye seyreltin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Olgun adipositler içeren süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Hemen tercih edilen hücre izolasyon yöntemine geçin.</li>
</ol>2. FACS kullanarak APC'lerin ve FIP'lerin izolasyonu
<ol><li>Tüpü hafifçe sallayarak peleti 1 mL 1x RBC lizis tamponunda çözün.</li>
	<li>RT'de 1-2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10 mL %2 FBS/PBS ekleyin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne geçirin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve peleti Fc bloğu (1:200) içeren 400-800 μL %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>mL'de ≤106 hücre içeren 400 μL-800 μL hücre süspansiyonlarını 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir.<ol><li>1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO (floresan eksi bir) kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.</li>
		<li>Örnekleri PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C antikorları ile boyayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 400 μL'lik %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra 40 μm filtre kapaklarından FACS için 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere geçirin.</li>
	<li>Geçit için aşağıdaki adımları izleyin.<ol><li>Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.</li>
		<li>Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.</li>
		<li>APC'leri ve FIP'leri elde etmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisini kullanın. Kapı APC'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- ve FIP'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ hücreleri olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıralanmış hücreleri 500 μL% 100 serum içeren tüplerde toplayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da tekrar santrifüjleyerek yıkamak için% 2 FBS / PBS ekleyin. Süpernatanı atın, peletlenmiş hücreleri kullanın.</li>
	<li>Peletlenmiş hücreleri, sonraki analiz için uygun hacimde gonadal APC kültür ortamında (hücre kültürü için) veya uygun tamponda yeniden süspanse edin.</li>
</ol>3. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların immünomanyetik ayrımı
<ol><li>1.1-1.7 adımlarını izleyerek SVF'yi gonadal beyaz yağ dokusundan izole edin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve SVF peletini 10 mL 1x ticari olarak temin edilebilen MS Tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri 100 μL 1x MS Tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Aşağıda tartışıldığı gibi CD31 + ve CD45 + hücre tükenmesini gerçekleştirin (Şekil 2A, Adım 1). Bu, endotelyal ve hematopoietik soy hücrelerini çıkarmak için yapılır.<ol><li>Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu ≤ 1 x 108 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Biyotin konjuge CD31 ve CD45 antikorlarını, her biri 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda hücre süspansiyonuna ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>4 mL 1x MS Tampon ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
		<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponu ile yeniden süspanse edin.</li>
		<li>10 μL streptavidin nanoboncuk ekleyin ve hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>4 mL 1x MS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
		<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri 2.5 mL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin ve 5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüpü 5 dakika boyunca mıknatıs rafına yerleştirin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu temiz bir 15 mL santrifüj tüpüne dökerek etiketlenmemiş hücreleri toplayın. NOT: İstenmeyen hücre fraksiyonundan kontaminasyona yol açtığından, asılı damlacıkları sallamaktan veya lekelemekten kaçının.</li>
		<li>Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 3.6.9 adımlarını tekrarlayın. 3.6.11'e kadar. toplam 3 yıkama için iki kez daha.</li>
	</ol></li>
	<li>Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların ayrılması (Şekil 2A, Adım 2)<ol><li>Etiketlenmemiş kesir (yani, CD45- CD31- kesir) ile çalışmaya devam edin.</li>
		<li>Etiketlenmemiş hücreler içeren 15 mL'lik tüpü 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Biyotin konjuge LY6C ve CD9 antikorlarını, sırasıyla, 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>3.6.3 adımlarını takip edin. 3.6.12'ye kadar. ikinci ayrımı tamamlamak için.</li>
		<li>İlişkilendirilmemiş kesirleri toplayın. Etiketlenmemiş hücreler (LY6C-CD9-), APC'leri içeren adipojenik fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).</li>
		<li>Tüpü mıknatıstan çıkarın, yeniden süspanse edin ve bağlı hücreleri 1x MS tamponunda elüte edin. Elüatlar veya etiketli fraksiyon (LY6C + CD9 +), FIP içeren adipojenik olmayan fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).</li>
		<li>Etiketli ve etiketsiz fraksiyonları 600 x g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de pelet hücrelerine santrifüjleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hemen hücre kültürüne geçin (adım 6) veya tercih edilen analizler için farklılaşmamış öncüler kullanın (adım 4 ve/veya adım 5).</li>
</ol>4. Akış sitometrisi ile adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların saflığını değerlendirin
<ol><li>Fc bloğu (1:200) içeren 200-400 μL'lik %2 FBS/PBS'de boncuk izole hücre fraksiyonlarını yeniden süspanse edin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.<ol><li>1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.</li>
		<li>Örneklere CD45, CD31, CD9 ve LY6C antikorları ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatan aspire edin ve hücreleri 400 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Süspansiyonu 600 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile analiz için 40 μm filtre kapaklarından 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.</li>
	<li>Saflığı değerlendirmek için akış sitometrisi analizi<ol><li>Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.</li>
		<li>Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.</li>
		<li>Şekil 2B'de gösterildiği gibi canlı ve tek hücreler için geçit stratejisini kullanın.</li>
		<li>CD2, CD45, LY31C ve CD6 için Şekil 9B'de gösterildiği gibi geçitleme işlemini gerçekleştirin.</li>
		<li>İzole fraksiyonlar içinde CD45- CD31- LY6C- CD9- hücrelerinin (APC'ler) ve CD45- CD31- LY6C + hücrelerinin (FIP'ler) frekanslarını değerlendirmek için akış sitometrisi yazılımını kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. FIP'lerin ve APC'lerin saflığını değerlendirmek için kantitatif PCR kullanarak gen ekspresyonu analizi
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen ekstraksiyon kitini ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak manyetik veya FACS izole hücrelerden mRNA'yı çıkarın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Ters Transkriptaz kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 1 μg RNA kullanın.</li>
	<li>SYBR yeşil PCR ana karışımı kullanarak kantitatif PCR ile APC ve FIP'leri seçici genlerin (Tablo 1) nispi mRNA seviyelerini belirleyin.<ol><li>PCR için numune reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 μL 2x SYBR yeşil boya, 1 μL cDNA (~50 ng/ μL), her bir ileri ve geri astardan 0.5 μL (10 μM) ve 3 μL su.</li>
		<li>Kantitatif PCR çalıştırması için aşağıdaki standart PCR koşullarını kullanın: tutma aşaması: 50 °C 2 dakika, 95 °C 10 dakika; PCR aşaması (40 döngü): 15 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>ΔΔ-Ct'yi hesaplayarak değerleri temizlik geni (Rps18) seviyelerine normalleştirin.</li>
	<li>İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Hücre kültürü ve farklılaşması
<ol><li>Manyetik olarak veya FACS ile izole edilmiş hücreleri 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Peletleri 500 μL gonadal APC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir kültür plakasındaki her fraksiyondan 40K hücre / kuyu plakalayın.</li>
	<li>Ortamı her 1-2 günde bir değiştirin. APC'ler, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacaktır. Aynı ortamda tutulan FIP'ler, adipogenez geçirmeye dirençlidir.</li>
</ol>

<ol><li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Eto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+structure+and+cellular+components+of+aspirated+and+excised+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).</li>
<li>Hirsch, J., Batchelor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+cellularity+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue cellularity in human obesity.</a> Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).</li>
<li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li>
<li>Hepler, C., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+problem+of+adipose+depot+remodeling+and+postnatal+adipocyte+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment.</a> Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and%2For+Hyperplasia%3A+Dynamics+of+Adipose+Tissue+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth.</a> PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).</li>
<li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li>
<li>Kloting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue+Remodeling%3A+Its+Role+in+Energy+Metabolism+and+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).</li>
<li>Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+adipocyte+precursors+and+their+role+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease.</a> Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> Elife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364 (6438), 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).</li>
<li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Dissection+of+Diverse+Mouse+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+white+adipose+hyperplastic+potential+is+associated+with+enhanced+susceptibility+to+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).</li>
<li>Vishvanath, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfrbeta%2B+Mural+Preadipocytes+Contribute+to+Adipocyte+Hyperplasia+Induced+by+High-Fat-Diet+Feeding+and+Prolonged+Cold+Exposure+in+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha%2FPDGFRbeta+signaling+balance+modulates+progenitor+cell+differentiation+into+white+and+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes.</a> Development. 145 (1), 155861(2018).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Buffolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Paracrine+Signaling+Mechanism+Linking+CD34%28high%29+Progenitors+to+the+Regulation+of+Visceral+Fat+Expansion+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling.</a> Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+adipocyte+differentiation+from+Pdgfrbeta%28%2B%29+preadipocytes+protects+against+pathologic+visceral+adipose+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity.</a> Nature Communications. 9 (1), 890(2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6+family+proteins+in+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Ly6 family proteins in neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).</li>
<li>Vijay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+adipose+tissue+identifies+depot+and+disease+specific+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types.</a> Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).</li>
</ol>

T.A.P., Novo Nordisk A/S'nin bir çalışanı ve hissedarıdır

Farelerin C57BL / 6 suşu, diyete bağlı obezite çalışmalarında en çok kullanılan fare türüdür. C57BL / 6 fareleri, yüksek yağlı bir diyete (HFD) yerleştirildiğinde hızla kilo alır ve obezite ile ilişkili metabolik sendromun bazı belirgin özelliklerini geliştirir (örneğin, insülin direnci ve hiperlipidemi). Özellikle, yüksek yağlı diyet (HFD) beslemesi ile ilişkili olarak meydana gelen WAT genişlemesi, depoya özgü bir şekilde gerçekleşir 19,20,21,22,23.<...

Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya "yağ hücreleri", büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazınınçeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar 1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT 4,5'te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50'sinden daha azını temsil eder. WAT'ın adiposit olmayan bölmesi veya stromal-vasküler fraksiyon (SVF) oldukça heterojendir ve vasküler endotel hücreleri, dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve adiposit öncü hücre (APC) popülasyonlarını içerir.
WAT, enerji depolama talebi arttıkça boyut olarak genişleme konusundaki olağanüstü kapasitesi açısından olağanüstüdür. Bu doku plastisitesinin korunması önemlidir, çünkü lipitlerin WAT'ta yeterli depolanması, adipoz olmayan dokulara zararlı ektopik lipid birikimine karşı koruma sağlar6. Bireysel WAT depolarının kalori fazlalığına yanıt olarak bu genişlemeye maruz kalma şekli, obezite ortamında insülin duyarlılığının kritik bir belirleyicisidir7. Metabolik sendromlu obez bireylerde gözlenen patolojik WAT genişlemesi, metabolik olarak uygun deri altı yağ dokusu pahasına viseral WAT depolarının tercihli genişlemesi ile karakterizedir. Ayrıca, obezitede insülin direnci, WAT'ın patolojik yeniden şekillenmesi ile ilişkilidir. Bu, mevcut adipositlerin hipertrofik büyümesi (boyutta artış), yetersiz anjiyogenez, kronik metabolik inflamasyon, hücre dışı matris bileşenlerinin birikimi (fibroz) ve doku hipoksisiile karakterizedir 8,9. Obezitenin bu WAT fenotipleri, lipodistrofi durumunda gözlenene benzer şekilde hepatik steatoz ve insülin direnci ile ilişkilidir (fonksiyonel WAT yokluğu). Buna karşılık, metabolik olarak sağlıklı obez popülasyonda sağlıklı WAT genişlemesi gözlenir ve koruyucu deri altı WAT'ın tercihli genişlemesi ve adiposit hiperplazisi10 yoluyla depo genişlemesi ile karakterize edilir. Yeni adipositlerin alımına, adiposit öncü hücrelerinden (APC'ler) ("adipogenez" olarak adlandırılır) de novo adiposit farklılaşması aracılık eder. Adiposit hiperplazisi, nispeten daha düşük derecelerde WAT fibrozu ve metabolik inflamasyon ile çakışır 6,11. WAT mikro çevresindeki çok sayıda hücre tipi, obezitede WAT'ın sağlığını ve genişletilebilirliğini doğrudan etkiler12. Bu nedenle, WAT'ta bulunan çeşitli hücre tiplerinin işlevini tanımlamak, alan için yüksek bir öncelik olmaya devam etmektedir.
Son on yılda, yerel APC'leri insan ve fare WAT SVF13'ten tanımlamak ve izole etmek için çeşitli stratejiler kullanılmıştır. Bu tür stratejiler, antikor bazlı hücre ayırma teknikleri kullanarak ortak mezenkimal kök / progenitör hücre belirteçlerinin hücre yüzeyi ekspresyonuna dayalı olarak APC'leri izole eder. Bu yaklaşımlar, florofor işaretli antikorlar kullanılarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya immünomanyetik boncuk ayrımını (yani kimyasal olarak modifiye edilmiş antikorlar) içerir. APC'lerin izolasyonu için hedeflenen hücre yüzey proteinleri arasında PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ve SCA-1 bulunur. Bu yaklaşımlar APC'ler için zenginleştirmeye yardımcı oldu; Bununla birlikte, bu belirteçlere dayalı olarak izole edilen hücre popülasyonları oldukça heterojendir. Çok yeni tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) çalışmaları, murin WAT14,15,16,17'nin izole edilmiş stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) içindeki stromal hücrelerin moleküler ve fonksiyonel heterojenliğini vurgulamıştır. Kendi scRNA-seq ve fonksiyonel analizlerimizden, yetişkin farelerde intraabdominal WAT'ın stromal bölmesinde fonksiyonel olarak farklı bağışıklık modüle edici ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımladık ve karakterize ettik15. Fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler, PDGFRβ+ hücrelerinin belirgin bir alt popülasyonunu temsil eder ve LY6C ekspresyonuna (LY6C + PDGFRβ+ hücreleri) dayalı olarak izole edilebilir15. FIP'ler adipojenik kapasiteden yoksundur, çeşitli uyaranlara güçlü bir pro-inflamatuar yanıt verir, kollajen üretir ve anti-adipojenik faktörler salgılar15. Bu hücrelerin pro-enflamatuar ve fibrojenik aktivitesi, farelerde obezite ile ilişkili olarak artar ve bu hücreleri WAT yeniden şekillenmesinin düzenleyicileri olarak gösterir. LY6C- CD9- PDGFRβ+ alt popülasyonu, adiposit öncü hücrelerini (APC'ler) temsil eder. Bu APC'ler, Pparg ve diğer pro-adipojenik genlerin ekspresyonu ile zenginleştirilir ve in vitro ve in vivo15 olarak olgun adipositlere kolayca farklılaşır. Burada, bu farklı hücre popülasyonlarının FACS kullanılarak yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından izolasyonu ve biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayrımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yetişkin erkek ve dişi farelerin birden fazla karın içi WAT deposundan fonksiyonel olarak farklı adipoz progenitör alt popülasyonları izole etmek için kullanılabilir15. Bu fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarını izole edilmiş olarak incelemek, sağlık ve hastalıkta adipogenezi ve intraabdominal yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkındaki mevcut anlayışımıza büyük katkı sağlayabilir.
Aşağıdaki protokol, murin epididimal WAT'tan adipoz progenitörlerin izolasyonunu detaylandırmaktadır; bununla birlikte, aynı prosedür, hem erkek hem de dişi farelerin mezenterik ve retroperitoneal WAT depolarından karşılık gelen hücreleri izole etmek için kullanılabilir15. Farelerde bu depoların nasıl tanımlanacağı ve izole edileceğine dair ayrıntılı bir protokol Bagchi ve ark.18'de bulunabilir. Bu protokol, 6-8 haftalık farelerin kullanımı için optimize edilmiştir. APC'lerin sıklığı ve farklılaşma kapasitesi yaşlanma ile ilişkili olarak azalabilir.

<table><tbody><tr><td>< Güçlü> Mekanik Doku Hazırlama ve SVF İzolasyonu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 ve 100 &mikro; m hücreli süzgeçler</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml polipropilen tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sindirim Tamponu (10 mL için)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg Kollajenaz D (1 mg/ml final cc.)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0,15 g BSA (%1,5 final cc.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>APC'lerin ve APC olmayanların immünomanyetik ayrımı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSort Tamponu (MS tamponu)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Mıknatıs (MS mıknatıs)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Saflık Kontrolü ve FACS< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloğu (Fare CD16 / CD32)</td> <td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Konsantrasyonu: &le; 0.25 &mikro; 10^6 hücre başına g Tür: Fare Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotin CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Konsantrasyon: &le; 0.25 &mikro; 10^6 hücre başına g Tür: Fare Klon: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotin CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Konsantrasyonu: &le; 0.25 &mikro; 10^6 hücre başına g Tür: Fare Klon: MZ3</td></tr><tr><td>Biotin LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Konsantrasyon: &le; 0.25 &mikro; 10^6 hücre başına g Tür: Fare Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>Konsantrasyon: Seyreltme 1:400 Tür: Fare Klon: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Konsantrasyon: Seyreltme 1:400 Tür: Fare Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Konsantrasyon: Seyreltme 1:50 Tür: Fare Klon: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Konsantrasyon: Seyreltme 1:400 Tür: Fare Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>Konsantrasyon: Seyreltme 1:400 Tür: Fare Klon: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hücre Kültürü ve Farklılaşma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Gonadal APC Kültür ortamı (500 mL için)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM, 1 g/L glikoz ile</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Fetal sığır serumu (FBS)** lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL %100 ITS ön karışımı</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-askorbik asit-2-2fosfat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 & mikro; L 100 g/ml FGF-temel</td><td>R& D sistemleri</td><td>3139-FB-025 / CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Kalem / Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 ve mikro; L Gentamisin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**NOT: Birincil APC'lerin adipojenik kapasitesi, ticari FBS'lerin partisinden partisine değişebilir. FBS'nin birden fazla lotu/kaynağı test edilmelidir.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murin İntraabdominal yağ depolarından adipojenik ve fibroinflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarının İzolasyonu

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Beyaz yağ dokusunun (WAT) stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) oldukça heterojendir ve yetişkinlikte WAT'ın genişlemesine ve yeniden şekillenmesine işlevsel olarak katkıda bulunan çok sayıda hücre tipinden oluşur. Bu hücresel heterojenliğin etkilerini incelemenin önündeki muazzam bir engel, in vitro ve in vivo analizler için işlevsel olarak farklı hücre alt popülasyonlarını WAT SVF'den kolayca izole edememektir. Tek hücreli dizileme teknolojisi, son zamanlarda yetişkin farelerin karın içi WAT depolarında fonksiyonel olarak farklı fibro-inflamatuar ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımlamıştır. Fibro-inflamatuar progenitörler ("FIP'ler" olarak adlandırılır), proinflamatuar bir fenotip uygulayabilen adipojenik olmayan kollajen üreten hücrelerdir. PDGFRβ+ adiposit öncü hücreleri (APC'ler), hücre transplantasyonu üzerine hem in vitro hem de in vivo olarak oldukça adipojeniktir. Burada, bu stromal hücre alt popülasyonlarının murin intraabdominal WAT depolarından izolasyonu için birden fazla yöntem tanımlanmıştır. FIP'ler ve APC'ler, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile veya biyotinile antikor bazlı immünomanyetik boncuk teknolojisinden yararlanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler moleküler ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Stromal hücre alt popülasyonunun fonksiyonel özelliklerini izole olarak incelemek, hücresel düzeyde fizyolojik veya patolojik koşullar altında yağ dokusunun yeniden şekillenmesi hakkındaki mevcut bilgilerimizi genişletecektir.

Bu protokol, yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından farklı stromal hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin veren iki stratejiyi tanımlar. APC'ler ve FIP'ler, FACS (Şekil 1) veya biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayırma (Şekil 2) ile izole edilebilir. Her iki yaklaşım da ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve antikorları kullanır. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, gWAT SVF'den adipojenik olmayan hücrelerden adipojenik hücrelerin ayrılmasın...

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Protokol, araştırmacıların, perigonadal beyaz yağ dokusu stromal hücrelerinin fonksiyonel ve moleküler olarak farklı alt popülasyonlarını ilgilenilen fare modellerinden izole etmelerine izin verir. Bu tekniğin avantajı, tüm aletlerin ve reaktiflerin yaygın olarak bulunmasıdır. Prosedürü göstermek, Dr.Rana Gupta'nın laboratuvarından kıdemli bir laboratuvar araştırma analisti olan Lavanya Vishvanath olacak.Gonadal beyaz yağ dokusundan veya WAT'tan stromal vasküler hücre izolasyonundan sonra, hücre peletini oda sıcaklığında bir ila iki dakikalık inkübasyon için bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. 10 mililitre% 2 FBS ve PBS ile lizisi durdurun ve hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne süzün. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti FC bloğu ile desteklenmiş 400 ila 800 mikrolitre FBS ve PBS'de yeniden süspanse edin.Dört santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, 400 ila 800 mikrolitre hücreyi floresan konjuge antikor boyaması için uygun sayıda tüpe aktarın ve hücreleri, 15 dakika boyunca dört santigrat derecede kontrol ve deneysel antikorlarla etiketleyin, ışıktan korunarak. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve hücreleri tüp başına 400 mikrolitre taze FBS ve PBS ile yıkayın. Yıkamadan sonra, peletleri tüp başına 400 ila 800 mikrolitre taze FBS ve PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikron filtre kapaklarından FACS için beş mililitre polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.Antijen sunan hücreleri ve fibroinflamatuar progenitörleri elde etmek için kompanzasyon ve deney kapılarını ayarlayın. Hücre tasnif işleminden sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve yıkayın ve peletleri fraksiyon başına 500 mikrolitre gonadal antijen sunan hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Adipojenik ve adipojenik olmayan hücre fraksiyonlarının immünomanyetik boncuk ayrımı için, stromal vasküler peleti 10 mililitre MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten süzün.Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, MS tampon konsantrasyonunun mililitresi başına 10 ila sekizinci hücreden en fazla bir kez yeniden süspanse edin. Daha sonra, buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyon için altı hücreye bir kere on kere başına 0.25 gramdan fazla anti-CD31 ve anti-CD45 biotin konjuge antikor eklemeyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile dört mililitre MS tamponunda yıkayın ve peleti 100 mikrolitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin.Buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyon için hücrelere 10 mikrolitre streptavidin nano boncuk ekleyin, ardından dört mililitre MS tamponunda başka bir yıkama yapın. Peleti 2.5 mililitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri beş mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. Etiketlenmemiş hücreleri yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne boşaltmadan önce tüpü beş dakika boyunca bir mıknatısın üzerine yerleştirin.Yıkamayı gösterildiği gibi iki kez daha tekrarlayın, her yıkamadan sonra etiketlenmemiş hücreleri çekin ve endotelyal ve hematopoietik soy tükenmiş hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri 100 mikrolitre MS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri, altıncı hücrelerin 10'u kadar buz üzerinde 15 dakika boyunca 0.25 mikrogramdan fazla olmayan Ly6C ve CD-9 antikoru ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, Ly6C pozitif adipojenik olmayan hücreleri toplamadan önce gösterildiği gibi bağlanmamış Ly6C negatif CD-9 negatif adipojenik hücreleri toplayın.Daha sonra, her iki hücre popülasyonunu santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, fraksiyon başına 500 mikrolitre gonadal antijen sunan hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Farklılaşma için hücre kültürleri kurmak için, her bir fraksiyonu, 48 oyuklu bir kültür plakasının ayrı oyuklarında konsantrasyon olarak oyuk başına dördüncü hücrenin 10'u kadar dört kez plakalayın ve plakaları yedi ila 10 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Adiposit öncü hücreleri, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacak, fibroin enflamatuar progenitörleri ise adipogenez geçirmeye dirençli olacaktır.Bu protokol kullanılarak, farklı stromal hücre popülasyonları, gösterildiği gibi FACS veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla yetişkin farelerin intraabdominal WAT depolarından izole edilebilir. İmmünomanyetik boncuk ayırma ile, adipojenik ve adipojenik olmayan hücreler gonadal WAT stromal vasküler fraksiyondan izole edilebilir. Akış sitometrisi ile gözlemlendiği gibi, adipojenik fraksiyon içindeki hücrelerin %75'i Ly6C negatif CD-9 negatif adiposit öncü hücreleri iken, adipojenik olmayan fraksiyonun %75'inden fazlası Ly6C pozitif fibroinflamatuar progenitör hücrelerdir.Her iki yöntemde de izole edilen adiposit öncü hücreleri, kaplamadan sonraki yedi ila 10 gün içinde yüksek bir saflığa kadar lipid içeren adipositlere farklılaşır. Buna karşılık, adipojenik olmayan öncüler fibroblast benzeri kalır ve aynı kültür koşulları altında adiposit haline gelmezler. Protokol, perigonadal beyaz yağ dokusundan adipojenik ve fibroinflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için çalışır.Benzer hücre popülasyonları, farelerin diğer yağ depolarında da bulunabilir. Bununla birlikte, seçimleri farklı antikorların kullanımına bağlı olacaktır. FACS ve manyetik ayırma yoluyla izole edilen hücre popülasyonları, hücre farklılaşmasının in vitro testleri için kullanılabilir veya gen ekspresyon analizi yoluyla daha fazla karakterize edilebilir.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Gen ekspresyonlarını ve kollajenolitik aktivitelerini değerlendirmek için stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fare inguinal (subkütan) ve perigonadal (viseral) yağ dokusu depolarından izole etmek için gerekli teknikleri sunuyoruz. Bu yöntem, immünomanyetik hücre ayrımı kullanılarak Sca1yüksek yağ kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) zenginleştirilmesini içerir.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Öğrenin, FACS veya immünomanyetik boncuk ayrımı kullanarak murin intraabdominal yağ dokusundan adipojenik ve fibroinflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını izole etme yöntemini. Bu teknik metabolik hastalık araştırmaları için fonksiyonel olarak benzersiz hücre tiplerinin incelenmesini sağlar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Daha fazla video keşfet