Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bu yöntem, enfeksiyon sırasında in vivo fitness için önemli olan temel genleri, antibiyotik direnci genlerini ve genleri tanımlamak için çeşitli bakteri türlerinde kullanılabildiği için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, pahalı restriksiyon enzimleri, adaptör radyasyonu ve jel saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldıran genomik DNA ve Poly-CTL baskısının mekanik paylaşımıdır. Enfeksiyon veya antibiyotik direnci için önemli olarak tanımlanan genler, yeni anti-mikrobiyal terapötikler için hedef olarak hizmet verebilir, çünkü bu tekniğin etkileri sorunlu bakteriyel enfeksiyonların tedavisine kadar uzanır.

Bu yöntem, gram-negatif ve gram-pozitif bakteri türleri arasında karmaşık genotip, fenotip ilişkileri hakkında bilgi sağlayabilir ve bakteri genetiği hakkındaki mevcut anlayışımızı geliştirebilir. Başlamak için, 50 mililitrekonik tüpler gecede kültürleri aktarın ve pelet hem alıcı ve donör kültürleri 5, 000 kez G 7 dakika santrifüj kullanarak. Supernatant atın.

Diaminopimelik asit ile desteklenen LB 4.5 mililitre donör süzme pelet yeniden askıya almak için 10 mililitre serolojik pipet kullanın. Yeniden askıya alınan donör türünü alıcı gerinim tüpüne aktarın. Ve hemen LB agar plakaları üzerinde bireysel 100 mikrolitre damlacıklar olarak miyon süspansiyon dağıtmak, diaminopimelic asit ile desteklenen oda sıcaklığında plakaları kuluçka 30 dakika.

Daha sonra, plakaları dikkatlice 37 santigrat dereceden kuvöze aktarın ve kültürlerin bir saat çiftleşsin. Kuluçka sonra her plaka üzerine LB 1.5 mililitre ekleyin ve 50 mililitre konik tüp içine bakteri hasat. Pelet 7 dakika için 5, 000 kez G santrifüj kullanarak çiftleştirilmiş hücreleri.

Sonra, supernatant atın ve lb 10 mililitre hücreleri yeniden askıya, tekrar hücreleri artık diaminopimelic asit Pellet kaldırmak için, ve LB ile yıkama tekrarlayın. Bittiğinde 10 mililitre serolojik pipet yeniden lb 10 mililitre pelet askıya almak için, ile takviye 25%gliserol. El yazması talimatlara göre hücreleri tabaklara yayın. Sonra, tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.

Kalan bakterilerin bir mililitre aliquots oluşturun ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın. Buz üzerinde dondurulmuş miyon bir aliquot dökün. Sonra, seyreltme 150 mikrolitre yaymak için steril cam boncuklar kullanın, her 30 üzerine 150 milimetre Luria-Bertani agar plaka, Kanamisin ile takviye.

Aşırı mipling içeren kullanılan tüpü atın ve 14 saat boyunca 37 derecede kuluçka yada tazyikli tabakları atın. Kuluçka sayısından sonra, transposon kütüphanesindeki toplam mutantları tahmin etmek için her plaka üzerinde koloni oluşturan birimler sayılmalıdır. Koloni sayımını belirlemek için en az üç plakanın %20'sini say.

Tahmini koloni verimi hesaplandıktan sonra, her plakaya üç ila beş mililitre LB ekleyin ve steril bir kazıma aleti kullanarak bakterileri kazıyın. Tüm plakalardan gelen bakteriyel süspansiyonları 50 mililitrelik konik tüplere çekin ve süspansiyonları 5,000 kez G'de yedi dakika süreyle santrifüj ederek peletleyin. Supernatant atın ve lb beş mililitre pelet yeniden askıya, ile birlikte 30%gliserol.

Sonra, cryovials transposon kütüphanenin bir mililitre aliquots yapmak ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın. Te tamponu ile gDNA'yı mikrolitre başına 250 nanogram konsantrasyona, toplam 200 mikrolitre hacimde seyreltin ve su banyosu sonicator'una yerleştirin. Yaklaşık 300 nükleotit parçası elde etmek için DNA'yı sonicate edin.

DNA'nın 10 mikrolitre sheared DNA ve 10 mikrolitre de yıkınmış DNA'yı %1 domuz kızartma jeli üzerinde çalıştırarak yıkağıladığını doğrulayın. Gerekirse sonication tekrarlayın. Polly tohum kuyruğunu saf DNA'nın üç ana ucuna eklemek için, metin el yazmasında açıklandığı gibi politika reaksiyonu ayarlayın ve reaksiyon tüplerini 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.

Politika reaksiyonu arındırmak için, her örnek ve girdap reaksiyon tüpü için boyut seçimi paramanyetik boncuklar 40 mikrolitre ekleyin. Beş dakika oda sıcaklığında inkübasyon örnekleri. Sonra, kısaca tüpün altındaki sıvı toplamak için onları santrifüj.

Tüpleri manyetik bir rafa aktarın ve iki dakika veya çözelti temizolana kadar oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Dikkatle supernatant çıkarın ve boncuk rahatsız etmeden, taze hazırlanmış 200 mikrolitre ekleyin, 80%etanol. Çözelti temizlenene kadar numuneleri kuluçkaya yatırın.

Sonra supernatant çıkarın ve etanol yıkama tekrarlayın. Kısaca tüpleri santrifüj ve geri manyetik raf koymak, kalan sıvı kaldırmak için. Örnekleri oda sıcaklığında 2-5 dakika kuluçkaya yatırın ve kurumasını bekleyin.

Ve her tüpe 25 mikrolitre su ekleyin. Yaklaşık beş saniye veya pipet yukarı ve aşağı onları girdap. Sonra, alt sıvı toplamak için tüpler santrifüj.

Tüpleri manyetik rafa aktarın ve çözelti temize gelene kadar yaklaşık iki dakika boyunca oturun. Sonra, boncuk rahatsız etmeden yeni bir tüp için supernatant aktarın. Bu protokol, Plazmid pJNW684'ü taklit eden E-coli MFD DAP auxotroph kullanılarak bakteriyel konjugasyon yoluyla, A-baumannii suşu ATCC 17978'de yüksek yoğunluklu transpozon kütüphanesi oluşturmak için kullanılmıştır.

Çekilen A-baumannii transposon mutant kütüphanesi, anti-mikrobiyalin alt inhibitör konsantrasyonları altında Kolistin direnci için önemli olan fitness faktörlerini tanımlamak için kullanıldı. Kolistin direncine katkıda bulunan genlerin mutant kütüphanesini tükettikten sonra, kalan kütüphane çekiminin toplam gDNA'sı kontrol ve deneysel kültürlerden izole edildi. GDNA mekanik yamultma ile parçalanmış ve sıralamaya hazırlanmak için DNA parçalarına bir politika kuyruğu eklenmiştir.

DNA konsantrasyonları hesaplandı ve örnekler başarılı kütüphane yapılarını doğrulamak için çip esaslı kılcal elektroforez kullanılarak analiz edildi. Bu yordamı çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, yüksek çözünürlüklü mutant kütüphane oluşturmak için belirli hedef suşları için CFU sayıları dayalı, miyon hacmi ayarlamaktır. Ayrıca, alıcı zorlanma antibiyotik direnci belirteci duyarlı olmalıdır, mutagenez önce transpozon kullanarak.

Bu prosedürü takiben, gen delemesi veya ses söyleme yöntemi tek tek kafaları sıralama sonuçları elde nakavt ve zor koşullar altında ilgi genleri doğrulamak için yapılabilir.