Murine Eksizyonel Yara İyileştirme Modeli ve Histolojik Morfometrik Yara Analizi
21 Ağustos 2020
Bu protokol, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaraların nasıl üretileceğin ve yaraların morfometrik analiziçin nasıl izlendiğini, hasat edilip hazırlanacağını açıklar. Morfometrik kusurları tanımlamak, tam olarak ölçmek ve tespit etmek için seri histolojik bölümlerin nasıl kullanılacağına iliş bir açıklama dahildir.
Bu protokol, fare eksizyonel yaralarının sağlam morfometrik ölçümlerini elde etmek için histolojik analizi kullanır. Bu tekniği kullanarak, seri bölümlerin bir alt kümesini kullanarak tüm yarayı analiz edebilir, böylece aksi takdirde gözden kgelebilecek kusurları daha doğru bir şekilde tespit edebiliriz. Prosedürü gösteren Lindsey Rhea, benim laboratuvar bir araştırma görevlisi olacaktır.
Anestezili yetişkin farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve omuz seviyesinde farenin arka sındaki kürkü çıkarmak için kaudal-rostral hareketle elektrikli jiletli makas kullanın. Maruz kalan tüyleri açığa çıkarmak için arkadan 20 derecelik açıyla tutulan bir jilet kullanın, ardından bir povison iyot ve %70 isopropil alkol hazırlık pedi silme ile cildi temizleyin. Yara indüksiyonu için, temiz bir kağıt tabanlı havluyu diş balmumuyla kaplı düz bir yüzeye yerleştirin ve fareyi uygun pozisyonda havlunun üzerine yerleştirin.
Farenin derisini sırt orta hattı boyunca kürek kemikleri arasında sıkıştırın ve sandviçli deriyi vücuttan katlamaya çekin. Fareyi yan yatan bir pozisyona getirerek, istenilen yara büyüklüğünde bir biyopsi yumruğu nu vücuda mümkün olduğunca yakın bir yere yerleştirin ve cildin rahatlamasını bekleyin. Derinin tüm katmanlarını delmek için sallanan bir hareket kullanarak yumruğu bastırın ve gerekli olduğu gibi çevredeki deriden yumruk serbest etmek için steril makas ve cımbız kullanarak yaradan yumruk biyopsileri kaldırın.
Sonra fare izleme ve analjezi ile kurtarmak için izin verin. Yara yatağının morfometrik analizi için dijital lekeli yara görüntüsü açın. Ölçek ve ölçüm tercihlerini belirlemek için, Analiz altında Ölçek Ayarla'yı seçin ve piksellere, bilinen uzaklıkta ve uzunluk birimine mesafeyi girin.
Her açık görüntü için ölçeği aynı tutmak için Genel ve Tamam'ı seçin ve alan kutusunun işaretli olduğunu doğrulamak için Ölçümleri Analiz ve Ayarla'yı seçin. Yara uzunluğunu ölçmek için, serbest el seçin ve dermal-epidermal kavşak boyunca izlemek için aracı kullanın, yaranın bir tarafında yaralanmamış dokunun son saç folikülbaş diğer tarafta yaralanmamış doku ilk saç folikül. Epidermis yaranın tamamını kaplamazsa, göçük dilin bittiği yaranın bir tarafındaki dermal-epidermal kavşağı takip edin ve granülasyon dokusunun üstün yönünü veya granülasyon dokusu ile kabuk arasındaki kavşağı takip etmeye devam edin, ta ki göç eden dil ve yaranın diğer tarafındaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülü ne kadar.
Ardından Analiz et ve Ölç'i tıklatın. Ölçümün uzunluğu, ölçekte ayarlanan birimlerde görünür. Epidermis yaranın tamamını kaplamazsa, granülasyon dokusunun üstün yönünü veya granülasyon dokusu ile ilk saç folikülüne giden kabuk arasındaki kavşağı takip eden her epidermal öncü kenar arasındaki mesafeyi ölçün.
Yara alanını ölçmek için, yaranın bir tarafındaki yaralanmamış dokunun son saç folikülünden başlayarak epidermisin üstün yönünü veya granülasyon dokusunun üstün yönünü takip etmek için serbest el aracını kullanın. Granülasyon dokusuiçine saç folikülü boyunca dikey takip etmeye devam edin. Karşı saç folikülü ve yağ dokusu veya kas ulaşıldıktan sonra, yaranın karşı tarafına granülasyon dokusunun alt sınırını takip edin ve alanı kapatmak için saç folikülü boyunca başlangıç noktasına katılın.
Yara tam olarak epitelize değilse, önden gelen etekkadar epidermisin üstün yönü boyunca iz ve dermal-epidermal kavşak aşağıdaki başlangıç noktasına dönmek. Gösterildiği gibi, yaranın tamamında 2D ölçümler yaparken, sadece yaranın ortasında 2D analizi ile mümkün olmayan parametreleri hesaplayabildik, bu da sahada yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu deneyde yara alanının 2D ölçümleri kullanıldı ve yaranın tüm veya orta alt kümesi üzerinde ortalama olarak kullanıldı ve deney grupları ile analiz yöntemleri arasında anlamlı bir fark saptanmama.
Ancak hesaplanan yara hacmi deney grupları arasında anlamlı olarak farklı ydı ve yara iyileşme parametrelerinin derinlemesine histolojik analizinin önemini gösterdi. Histolojik analiz için sürekli boyutlu yaralar üretmek ve doğru bir morfometrik analiz için çok önemlidir. Lekesiz kesitler, yara iyileşmesinin diğer yönlerini ölçmek için immünoresans veya Masson'un trikrom boyaması için kullanılabilirken, flaş dondurulmuş yaralar kantitatif protein analizi için morfometri ile birlikte kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, farelerde bilateral, tam kat eksizyonel yaraların oluşturulmasını ve ardından bu yaraların morfometrik analiz için izlenmesini ve hazırlanmasını açıklamaktadır. Protokol, morfometrik kusurları doğru şekilde nicelendirmek ve tespit etmek için seri histolojik kesitlerin kullanımını vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Histoloji
Arka Plan
- Yara iyileşme mekanizmalarını anlamak, biyomedikal araştırmalarda kritik öneme sahiptir.
- Farelerdeki eksizyonel yaralar, cilt rejenerasyonunu incelemek için bir model görevi görür.
- Histolojik analiz, doku morfolojisi ve iyileşme süreçleri hakkında bilgiler sağlar.
- Yara iyileşmesini değerlendirmek için doğru morfometrik ölçümler esastır.
Çalışmanın Amacı
- Farelerde eksizyonel yaralar oluşturmak için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- İyileşme sürecini morfometrik analiz yoluyla izlemek ve analiz etmek.
- Yara özelliklerinin ayrıntılı değerlendirmesi için histolojik kesitlerden yararlanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezi altındaki farelerde bilateral, tam kat eksizyonel yaraların oluşturulması.
- Doku örneklerini hazırlamak için histolojik tekniklerin uygulanması.
- Yara morfolojisini analiz etmek için seri kesitlerin kullanılması.
- Detaylı ölçümlerle morfometrik defektlerin miktarlaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Minimum komplikasyonlarla eksizyonel yaraların başarılı bir şekilde indüklenmesi.
- Histolojik analiz, yara iyileşmesine dair önemli bilgiler sağlamıştır.
- Kantitatif veriler, protokolün etkinliğini kanıtlamıştır.
- Yara iyileşmesindeki kusurlar, kullanılan yöntemle doğru bir şekilde tanımlanmıştır.
Sonuçlar
- Protokol, farelerde yara iyileşmesinin incelenmesi için sağlam bir çerçeve sunmaktadır.
- Histolojik analiz, morfometrik değerlendirme için değerli bir araçtır.
- Gelecekteki çalışmalar, iyileşme mekanizmalarını keşfetmek için bu metodolojiyi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Yara iyileşme parametrelerinin doğru şekilde nicelleştirilmesi, preklinik modellerdeki ince fenotipik değişikliklerin tespit edilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, dermatolojik ve rejeneratif tıp programlarında hedef doğrulamayı ve mekanik risk azaltmayı destekleyerek, fare eksizyonel yaralarının titiz morfometrik analizine olanak tanır. Ölçüm hassasiyetini artırarak, erken evre terapötik değerlendirmelerde öngörü güvenilirliğini geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İyileşme evreleri boyunca epidermal ve yara boyutlarının hassas ölçümü aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşim çalışmalarındaki değişkenliği azaltan standardize edilmiş morfometrik çıktılar sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yara iyileşme modülatörlerinin yüksek içerikli taraması için uygun olan kantitatif yara alanı ve hacmi metrikleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Seri kesit alma ve görüntü tabanlı analiz iş akışları yoluyla assay standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Geleneksel 2D analizlerle tespit edilemeyen üç boyutlu yara dinamiklerini yakalayarak hastalıkla ilgili sistem modellemesini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Preklinik süreklilik ve devam/durdurma kararları için iyileşme sürecinin boylamsal takibine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef seçimi ve aday ilaç optimizasyonuna yön veren kantitatif histopatolojik sonuçlar sağlayarak keşif biyolojisi iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Objektif morfometrik fenotipleme yoluyla yolak netleştirmeyi ve biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Bileşik taramaları ve yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları için temel teşkil edenle tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Deneysel koşullar arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan epidermal hacim, yara hacmi ve alan ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Ölçülebilir yara iyileşmesi son noktaları aracılığıyla keşif bulgularını preklinik validasyonla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Programlar arası yara iyileşmesi incelemeleri için yeniden kullanılabilir, histoloji tabanlı bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Geleneksel analizlerde gözden kaçan küçük etkili morfometrik kusurları tespit ederek öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış kesit alma ve ölçüm protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Fenotipik taramalarda yalancı negatif oranlarını düşürerek devam/dur karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Güçlü histopatolojik verilere dayanarak yara iyileşmesi adaylarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Histolojik kesme, boyama ve morfometrik yazılım kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Seri kesit işleme için mikrotom, mikroskopi ve görüntü analiz altyapısına bağımlıdır.
- Çok merkezli çalışmalar için yara oluşturma ve kesme prosedürlerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı fare soylarına veya yara modellerine uygulandığında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Tek kesit analizine kıyasla artan zaman ve kaynak gereksinimleri ile sınırlıdır, ancak bu durum artan saptama hassasiyeti ile gerekçelendirilmektedir.
