Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Bu protokol, cis-düzenleyici mekanizmaları ve bunun hastalık üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için birincil örneklerin yüksek verimli ChIP-Seq analizine izin vermesi açısından önemlidir. Bu yöntemin temel avantajları, verilerin tekrarlanabilirliği ve uygulamalı laboratuvar süresinin önemli ölçüde azaltılmasıdır. Kromatin kesme için, oda sıcaklığında bir dakikalık bir inkübasyon için glisin ile sabitlenmiş, anında dondurulmuş ve çözülmüş bir hücre peletine 70 mikrolitre taze, oda sıcaklığında, tam lizis tamponu ekleyin, ardından kabarcıklar olmadan bir dakikalık yeniden süspansiyon yapın.

Hücreleri buzun üzerine yerleştirmeden önce numuneyi oda sıcaklığında bir dakika daha inkübe edin. Tüpü bir sonikatörün tüp tutucusuna yüklemeden önce, yeniden askıya alınmış peleti buz üzerinde 0.65 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. Herhangi bir boşluğu 70 mikrolitre su içeren denge tüpleriyle doldurun ve sonikasyona başlamadan önce hücrelerin su banyosunda yaklaşık bir dakika stabilize olmasına izin verin.

Üç döngüden sonra, hafif girdaplama için numuneleri sonikatörden çıkarın ve tüpleri tekrar tutucuya yerleştirmeden önce darbeyle döndürün. Histon modifikasyonu için, iki çipli sekiz tüplü şeridin her bir tüpüne 100 mikrolitre tam tC1 tamponu ekleyin ve 16 kromatin paylaşımlı numunenin her birinin 20 mikrolitresini çip sekiz tüplü şeritlerin ayrı tüplerine aktarın. Kromatin tüplerini 80 mikrolitre tam tC1 tamponu ile yıkayın ve yıkamaları, tüp başına 200 mikrolitre çözeltinin nihai hacmi için çip sekiz tüplü şeritlerin uygun tüplerinde toplayın.

500 mikrolitre TBW1 tamponuna uygun miktarda antikor ekleyin ve hızlı bir şekilde girdap yapın ve nabız döndürün. Daha sonra yeni bir çip sekiz tüplü şeridin her bir tüpüne 70 mikrolitre tBW1 ve 30 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir protein A boncuk çözeltisi kabını iyice girdaplayın ve yeni bir tüp şeridine 0.5 mikrogram antikor başına beş mikrolitre boncuk ekleyin.

Boncuk şeridini darbeyle döndürün ve talaş sıvı işleyicinin son sırasını etiketli, boş, talaş sekiz tüplü şeritlerle doldurun. Ardından, şeritlerin geri kalanının yerleştirilmesi için çip 16-I pure 200 D program özelliklerini takip edin ve tamponları doğru konumlara yükleyin. Sıralamadan sonra, boncukları sekiz tüplü bir şerit mıknatısta yakalayın ve her tüpe 25 mikrolitre etiketleme tamponu aktarın.

Tüpler mıknatıstan çıkarıldıktan sonra, boncuk çözeltileri homojen olana kadar hafifçe karıştırın ve yeniden kapaklı tüpleri üç dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ThermoMixer'a yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, çip sıvı işleyicisinin son sırasındaki çip sekiz tüplü şeritleri çıkarın ve her numuneye iki mikrolitre Rnase A ekleyin. Daha sonra yeniden kapatılmış tüpleri darbeyle döndürün ve boncuk çözeltileri homojen olana kadar hafifçe karıştırın.

Etiketlenmiş DNA parçalarının saflaştırılması için, 100 mikrolitre D çapraz bağlı DNA örneğini ayrı ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri tüp başına 100 mikrolitre DNA bağlama tamponu ile yıkayın. Yıkamaları uygun tüplere çekin ve numuneleri sütunlara yükleyin. Sütunları yeni 1,5 mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin ve dokuz mikrolitre 55 santigrat derece Tris-EDTA tamponunu doğrudan sütun matrislerine ekleyin.

Bir dakika sonra, sütunları santrifüjleyin ve her sütundan dokuz mikrolitre elüatı buz üzerinde sekiz tüplü yeni bir şeride aktarın. DNA parçalarını gösterildiği gibi tekrar elute edin, ancak sekiz mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile ve elüatı daha önce hasat edilmiş DNA fragmanı çözeltisi ile birleştirin. Saflaştırılmış DNA fragmanı örneklerini çoğaltmak için, örnekleri çok kanallı bir pipetle karıştırın ve uygun sayıda döngü ile bir amplifikasyon programı gerçekleştirin.

Amplifikasyondan sonra, boncukları yakalamak için bir plaka mıknatısı kullanın ve süpernatanı atın. Boncukları, boncuk peletini bozmadan, yıkama başına 200 mikrolitre taze% 80 etanol ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, fazla etanolü çıkarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve boncukların 10 dakika veya boncuk peletlerinde çatlaklar oluşana kadar kurumasını bekleyin.

Kurutulmuş her numuneye 40 mikrolitre önceden ısıtılmış su ekleyin ve iyice girdap oluşturmadan önce plakayı kapatın ve kısa bir süre nabız döndürün. Daha sonra, standart protokollere göre bir floresan niceleme testi kullanarak DNA'yı ölçün. Kesilmiş kromatin fragman boyutu ölçümleri, numunelerin %70'inden fazlasının 14 döngü boyunca 100 ila 500 baz çifti arasında gözlemlenmesiyle mükemmel tekrarlanabilirlik gösterir.

Gösterildiği gibi, etiketlenen numunenin yoğunluğunun ortalama maksimumun yarısı olduğu döngü, döngü belirleme için en uygunudur. En iyi dizileme verileri, DNA fragmanlarının %85'inden fazlası 200 ila 1000 baz çifti arasında değiştiğinde elde edilir. Dört gen lokusu için bu temsili zenginleştirme yollarında, her örnek için ayrı izler yüksek bir haritalama kalitesi ve sinyal-gürültü oranı gösterir.

İlk iki lokus, bu hücre tiplerinde iyi ifade edilmiş genleri barındırırken, son iki lokustaki genler eksprese edilmez ve arka plan kontrolleri olarak görev yapar. İkili karşılaştırmaların çoğu için, Pearson korelasyon indeksleri %90'dan fazla korelasyon gösterir ve bu da biyolojik kopyalar arasında yüksek düzeyde bir tutarlılık olduğunu gösterir. Hücre tipine özgü lokuslar uygun hücrelerde yüksek bir zenginleşme sergilerken, bir temizlik geni çok tutarlı histon modifikasyonu gösterir.

100.000'den az hücreye sahip örneklerden gerçekleştirilen ChIP-Seq veri seti arasındaki korelasyon analizi, hala yüksek bir tekrarlanabilirlik ve 10.000 hücreye kadar korelasyon göstermektedir. Bununla birlikte, hücre sayıları azaldıkça artan bir arka plan ve korelasyon katsayılarında bir azalma vardır. Hücrelerin uygun şekilde parçalanması, yüksek kaliteli veri üretmek için çok önemlidir, çünkü eksik hücre lizizinin protokolün geri kalanını etkilediğini bulduk.

Bu yöntemi kullanarak, cis-düzenleyici elementleri daha iyi anlamamızı sağlamak için birçok farklı histon modifikasyonu ve transkripsiyon faktörü, ilgilenilen çeşitli hücre türleri üzerinde test edilebilir.