Name: Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Öğrenin, fare beyin dokularında serbest yüzen kesitlerle immünohistokimyasal boyama yöntemini. Kalın kesitler, uzun süreli depolama ve düşük ekspresyonlu proteinlerin tespiti için ideal bir tekniktir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ne (K99/R00 AG055683'ten JMR'ye), George ve Anne Ryan Sinirbilim Enstitüsü'ne (EP, GC, JMR), Rhode Island Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne (EP, GC, JMR) ve Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse'ye (JMR) teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi Genetik Bölümü Profesörü Susan Dymecki ile eğitim alan doktora öğrencisi Rebecca Senft'e, bizi serbest yüzen yöntemle tanıştırdığı için teşekkür ederiz. Şekil 1'de kullanılan bazı görüntüler "kullanımı ücretsiz, paylaşması veya değiştirmesi, hatta ticari olarak bile ücretsiz" kaynaklardan elde edilmiştir: fare ve mikrosantrifüj tüpü (Pixabay), fare beyni (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kriyostat ve fare beyni bölümü (DataBase Yaşam Bilimleri Merkezi, Wikimedia Commons), cam kap (OpenClipart, FreeSvg.org) ve mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Kriyoseksiyon için doku hazırlığı
<ol><li>Uygun bir numune matrisi kullanarak bir numune bloğu oluşturmak için sabit dokuları uygun bir gömme kalıbına gömün (bkz. Malzeme Tablosu) ve kuru buz üzerinde dondurun. Numune bloklarını kesitlenmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Sabit dokular tipik olarak, yetişkin (yaklaşık 2,5 – 30 aylık) erkek veya dişi kemirgenlerin (fare veya sıçan)34, mevcut etik izne uygun olarak, uygun bir fiksatif (örneğin% 10 formalin) ile perfüze edilmesiyle, ardından 4 ° C'de 12 saat boyunca aynı fiksatif içinde sabitleme sonrası dokular, 1x PBS ile üç kez yıkanarak hazırlanır. ve dokuları% 15 ve% 30 oranında sakkaroz, gece boyunca veya dokular batana kadar 1x PBS'desakkaroz 35. Araştırmacılar bu genel protokolü farklı gelişim aşamalarına uyarlamaya çalışabilirler.</li>
</ol>2. Kriyoseksiyon
<ol><li>Kesitlemeye hazır olduğunda, dokunun parçalanmasını önlemek için kesitlemeden önce kriyostattaki numuneleri en az 1-2 saat iklimlendirin.</li>
	<li>Bir kriyostat kullanarak, dokuyu bölümlere ayırın (20-50 μm) ve 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş 6 veya 12 delikli eklerde toplayın (bkz. NOT: Kesit kalınlığına, ne kadar doku toplanacağına ve kullanılan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak, her kuyu kuyu için yaklaşık 10 ila 40 dilim arasında değişen sayıda kesit içerecektir. Örneğin, tüm beyin 40 μm'de kesitlenirse, 12 delikli ekler kullanılarak her bir kuyuda yaklaşık 18-24 bölüm toplanacaktır. Ayrıca, 20 μm kesitlerin kullanımı biraz zor olabilir, bu nedenle toplu boyama için 40 μm önerilir (bkz.</li>
</ol>3. Bölümlerin depolanması
<ol><li>Toplandıktan sonra, bölümleri taze hazırlanmış 1x PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Bölümleri 1-1.5 mL depolama çözeltisi ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın (250 mL için, 70 g sakaroz, 75 mL etilen glikol karıştırın ve 0.1 M fosfat tamponu ile hacme getirin).</li>
	<li>Boyama için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Boyama Günü I
<ol><li>Numuneleri dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika boyunca dengeleyin.</li>
	<li>Depolama solüsyonunu bölümlerden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu ucuna dökün.</li>
	<li>Kuyu ucunu yaklaşık 6 mL 1x TBS içeren başka bir kuyuya taşıyın. RT'de düşük hız kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 1x TBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Bölümler yıkanırken,% 0.3 Triton X-100 ve% 3 normal serum (örneğin, normal at serumu) ile 1x TBS'den oluşan bir bloke geçirgenlik çözeltisinden 7 mL (numune başına) hazırlayın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca bölümleri engelleyin. NOT: Sera ile blokaj, antikorların dokuya veya spesifik olmayan Fc-reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını önler – ikincil antikor türleriyle eşleşen bir serum önerilir, ancak mevcut değilse, birincil antikor konakçı hayvandan farklı bir türden herhangi bir normal serum kullanılabilir. Deterjan Triton X-100, dokuyu geçirgenleştirerek daha iyi antikor penetrasyonu sağlar.</li>
	<li>% 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum ile 1x TBS'de seçilmiş birincil antikordan (uygun şekilde seyreltilmiş) oluşan primer antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın (bakınız Adım 4.4 Not). Kuyu girişinden kesitleri, ilgilenilen antijen (ler) e bağlanmak için birincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Birden fazla primer antikor kullanılabilir (farklı konakçı türlerde üretilir).</li>
	<li>Düşük hız (örneğin, 7 rpm hız) kullanan döner bir karıştırıcı üzerine kesitli 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.</li>
</ol>5. Boyama Günü II
<ol><li>Ertesi gün, bölümleri birincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün. NOT: Antikor çözeltisi toplanabilir ve tekrar kullanılabilir; mikrobiyal büyümeyi inhibe etmek için% 0.02 (w / v) sodyum azid ekleyin.</li>
	<li>RT'de 1x TBS ile bölümleri 3 kez yıkayın (ilk 2 yıkama için 30 s ve son yıkama için 10 dakika).</li>
	<li>% 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum (ışıktan kalkan çözeltisi) ile 1x TBS'de uygun sekonder antikordan (buna göre seyreltilmiş) oluşan ikincil antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın. NOT: Konjuge sekonder antikor ile dolaylı etiketleme, sinyali yükseltir ve protein hedefinin kolorimetrik veya floresan görselleştirmesine izin verir.</li>
	<li>Kesitleri ikincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan kalkan çözeltisi).</li>
	<li>Bölümleri ikincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.</li>
	<li>Numuneleri ışıktan korumaya devam ederek, RT'de 30 s için 1x TBS ile 2 kez yıkayın. Daha sonra 1x TBS'de 15 dakika yıkayın, isterseniz DAPI (1-0.1 μg / ml) ekleyin.</li>
</ol>6. Montaj
<ol><li>Bölümleri bir bardağa dökün, dikdörtgen histolojik oda dörtte üçünü 1x TBS ile doldurun.</li>
	<li>Bir cam slaytı 1x TBS'ye batırın ve bölümleri slayda doğru koaksiyel hale getirmek için ince bir boya fırçası kullanın.</li>
	<li>Bölümlere slaytın üzerine hafifçe dokunarak kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olun.</li>
	<li>Tüm bölümler slayt(lar)a monte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. NOT: Örneğin, tüm bir beyin 40 μm'de kesitlendiğinde, 18-24 bölüm içeren bir aliquot ile 12 kuyucuklu eklerde toplandığında; dilimler tipik olarak 1-2 slayta monte edilir, ancak araştırmacının tercihine bağlı olarak slayt başına daha az bölüm de monte edilebilir.</li>
</ol>7. Kapak kaydırma
<ol><li>Kesitler slayt(lar)ın üzerine kurutulduktan sonra, RT'de yaklaşık 10-15 dakika veya kesitler opak görünene kadar (slaytları ışıktan korumayı unutmayın), uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın (sertleştirme veya sertleştirmeyen). Antifading, floresan konjuge sekonder antikor kullanılıyorsa tercih edilir. NOT: Sertleştirme montaj ortamı kullanılırken floresan kalitesi daha düşük olabilir, ancak kızaklar daha uzun süre dayanmalıdır.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, ortamın üstüne bir kapak parçası yerleştirin. Kapağı filtre kağıdıyla örtün ve fazla montaj ortamını çıkarmak için sıkıca bastırın. NOT: Sertleşmeyen bir montaj parçası kullanıyorsanız, kapağın kaydırılmış sürgüsünün kenarlarını sızdırmaz hale getirmek için şeffaf oje ile boyayın.</li>
	<li>Uygun bir mikroskop kullanarak görüntü bölümleri. 4 °C'de karanlık bir slayt kutusunda saklayın. NOT: Bölümler, lazer tarama konfokal ve ters veya dik geniş alan floresansı gibi çeşitli mikroskoplar kullanılarak, araştırmacının ihtiyaçlarına göre büyütmelerde (örneğin, 10x, 20x, 40x) görüntülenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV%3A+Techniques+in+Experimental+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+indispensable+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li>
<li>Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+SN+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22">The Quarterly Review of Biology</a>. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374(1999).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NationalAcademy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Hermersdörfer, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermersd%C3%B6rfer%2C+H+%22Immunocytochemistry.+A+Practical+Approach%22">Immunocytochemistry. A Practical Approach</a>. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Review+of+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphoproliferative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).</li>
<li>Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).</li>
<li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focus+on+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A focus on fixation.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fos%3A+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li>
<li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li>
<li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofClinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li>
<li>Lönnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li>
<li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+and+Pro-GnRH%2C+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li>
<li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li>
<li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li>
<li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain%3A+a+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury%3A+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li>
<li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li>
<li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papel+da+imuno-histoqu%C3%ADmica+no+diagn%C3%B3stico+do+c%C3%A2ncer+de+pulm%C3%A3o%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+Brasileiro+de+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22Immunocytochemistry%22">Immunocytochemistry</a>. , 65-77 (2009).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarr%2C+WB+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+Methods%22">Neuroanatomical Tract-Tracing Methods</a>. , Springer. 207-262 (1981).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cresyl+violet%3A+A+red+fluorescent+Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li>
</ol>

Açıklanacak bir şey yok

İmmünohistokimya (IHC), doku kesitlerinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tanımlamada çok önemli hale gelen çok yönlü bir tekniktir. Bu tahlil, normal fonksiyon aşamalarından hastalık durumlarına kadar dokunun özelliklerini daha iyi anlamak için bilimsel topluluk genelinde kullanılır. IHC, kanser gibi hastalıkların klinik teşhisinden klinik öncesi araştırmalardaki ilk keşiflere kadar çeşitli alanlarda kullanılmaktadır10,36.
IH...

İmmünoboyama, 130 yıl önce 1890 yılında Von Behring1 tarafından serum antikorlarının keşfi ile başlayan popüler bir araştırma uygulamasıdır. 20. yüzyılın başlarında, boyalar reaksiyonları ölçmenin ve görselleştirmenin bir yolu olarak antijenlere ve daha sonra antikorlara bağlandı1 ve 1941'de Albert Coons, ışık mikroskobu 2,3'te devrim yaratan bir keşif olan ilk floresan antikor etiketlerini geliştirdi. "İmmünoboyama" terimi, Western blot, flow cytometry, ELISA, immünositokimya ve immünohistokimya 3,4 dahil olmak üzere bu prensip kullanılarak geliştirilen birçok tekniği kapsar. Western blot, doku veya hücre ekstraktlarından spesifik proteinlerin varlığını tespit eder5. Proteinler jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır, bir zara aktarılır ve antikorlar kullanılarak incelenir. Bu teknik, proteinin varlığını ve ne kadar protein bulunduğunu gösterir; Bununla birlikte, proteinin hücreler veya dokular içindeki lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi ortaya koymaz. Başka bir yöntem olan immünositokimya (ICC), hücrelerdeki proteinleri, tipik olarak in vitro olarak yetiştirilen hücreleri etiketler. ICC, hücresel bölmelerde hem protein ekspresyonunu hem de lokalizasyonu gösterir6. Doku düzeyinde spesifik bir proteini tespit etmek ve görselleştirmek için immünohistokimya (IHC) kullanılır.
IHC, araştırmacıların bağışıklık sisteminin kimyasal özelliklerinden yararlanarak doku içindeki spesifik antijenleri hedeflemek için kullandıkları bir yöntemdir 7,8. Bir enzime veya floresan boyaya bağlı spesifik birincil ve ikincil antikorlar üretilerek, ilgilenilen antijenler çoğu dokuda etiketlenebilir ve ortaya çıkarılabilir (Mepham ve Britten'de gözden geçirildiği gibi)9. "İmmünohistokimya" terimi tek başına, ilgilenilen antijeni ortaya çıkarmak için kullanılan etiketleme yöntemini belirtmez; Bu nedenle, bu terminoloji genellikle etiketleme yöntemini açıkça tanımlamak için tespit tekniği ile birleştirilir: ikincil antikorun peroksidaz gibi bir enzime ne zaman konjuge olduğunu belirtmek için kromojenik immünohistokimya (CIH); veya ikincil antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) veya tetrametilrodamin (TRITC) gibi bir florofora konjuge olduğunu belirtmek için floresan IHC. IHC'nin seçiciliği, klinisyenlerin ve araştırmacıların dokular boyunca, çeşitli sağlık ve hastalık durumlarında protein ekspresyonunu ve dağılımını görselleştirmelerini sağlar10. Klinik alanda, IHC yaygın olarak kanseri teşhis etmek ve çeşitli kanser türlerindeki farklılıkları belirlemek için kullanılır. IHC ayrıca Hepatit B veya C11 gibi vücuttaki farklı mikrobiyal enfeksiyon türlerini doğrulamak için de kullanılmıştır. Biyomedikal araştırmalarda, IHC genellikle dokulardaki protein ekspresyonunu haritalamak için kullanılır ve hastalık durumlarında görülen anormal proteinleri tanımlamada önemlidir. Örneğin, nörodejenerasyona genellikle Alzheimer hastalığında Αβ plakları ve nörofibriler yumaklar gibi beyinde anormal proteinlerin birikmesi eşlik eder. Hayvan modelleri genellikle bu patolojik durumları taklit etmek için geliştirilir ve IHC, araştırmacıların ilgilendikleri proteinleri bulmak ve ölçmek için kullandıkları bir yöntemdir10,12,13. Buna karşılık, bu hastalıkların nedenleri ve onlarla ortaya çıkan komplikasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
IHC'nin gerçekleştirilmesinde birçok adım vardır. İlk olarak, ilgilenilen doku toplanır ve boyama için hazırlanır. Muhtemelen çoğu araştırmacı sabit doku örnekleri hazırlar, fiksatifin dolaşım sistemi yoluyla perfüzyonu, morfolojiyi koruduğu için optimal 14,15'tir. Doku örneklerinin fiksasyonu sonrası da kullanılabilir, ancak ideal sonuçlardan daha az sonuç verebilir16. Formaldehit gibi çapraz bağlanan fiksatörler, dokudaki proteinler arasında kimyasal bağlar oluşturarak hareket eder17. Sabit doku daha sonra bir mikrotom kullanılarak çok ince tabakalara veya bölümlere dilimlenir, birçok araştırmacı bir kriyostat kullanarak dondurulmuş bölümleri toplamayı tercih eder. Buradan doku toplanır ve ya doğrudan bir mikroskop slaydına (slayta monte edilmiş yöntem) monte edilir ya da fosfat tamponlu salin (PBS) 18 gibi bir çözelti içinde askıya alınır (serbest yüzen yöntem). Kullanılan toplama yöntemi, araştırmacının ihtiyaçlarına göre önceden belirlenir ve bu iki yöntemin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar.
Kızağa monte edilen yöntem açık ara en yaygın kullanılanıdır, önemli bir yararı çok ince kesitlerin (10-14 μm) hazırlanabilmesidir, bu da örneğin protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemlidir. Ayrıca, numunenin minimum düzeyde işlenmesi vardır, bu da dokunun yapısal bütünlüğüne potansiyel hasarı azaltır19. Araştırmacılar genellikle bu tekniği sabit dokuya kıyasla çok hassas olan taze dondurulmuş doku (kuru buz, isopentan vb. kullanılarak hemen dondurulan doku) ile kullanırlar ve numunenin çözülmesini önlemek için çok özen gösterilmesi gerekir. Kızağa monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bir diğer avantajı, boyama için büyük hacimli çözeltilerin genellikle gerekli olmamasıdır4. Böylece, araştırmacılar lekeyi tamamlamak için daha az miktarda pahalı antikor veya diğer kimyasalları kullanabilirler. Ek olarak, birkaç farklı deney grubundan bölümleri aynı slayta monte etmek mümkündür, bu da özellikle görüntü yakalama sırasında avantajlı olabilir. Öte yandan, slayda monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır, özellikle doku bölümünün slayda yapıştırılması, böylece bölümün bir tarafına antikor penetrasyonunu kısıtlaması, bu da kesit kalınlığını ve dokunun 3D gösterimini sınırlar. Ayrıca, yıkama sırasında, dokunun kenarlarının ve tüm bölümlerin slayttan ayrılabileceği ve tüm deneyi işe yaramaz hale getirebileceği de olabilir. Dahası, tipik olarak -20 veya -80 ° C'de saklanan, genellikle örtülmüş ve yatay olarak veya slayt kutularında saklanan işlenmemiş slaytlarla antijen epitop 20,21'in bozulmasını önlemek için slayta monte edilmiş yaklaşım kullanıldığında IHC genellikle nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, bu da nispeten büyük bir depolama ayak izi ile sonuçlanır. Son olarak, slayta monte tekniği, araştırmacıların çok sayıda doku bölümünü işlemek için çok sayıda slaytı ele almaları gerekiyorsa da zaman alıcı olabilir.
Slayta monte edilmiş yöntemi kullanan bu zorlukların bazıları nedeniyle, serbest yüzen yöntem adı verilen bir değişiklik popüler bir alternatif haline gelmiştir. Bu teknik 1960-70'lerde literatüre girdi 22,23,24, 1980'lerde popülerlik kazandı 25,26,27,28,29 ve şimdi 12,30,31 numaralı slayta yapışmak yerine süspansiyonda toplanan bölümlerdeki lekeyi gerçekleştirmeyi içeren köklü bir yöntemdir. . Doku kesitleri 20 μm'den az olduğunda serbest yüzen yöntem önerilmez; Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, daha kalın (40-50 μm) kesitlerin boyanması gerektiğinde tercih edilen yaklaşımdır. Belirgin bir yararı, antikorların serbest yüzen bölümlere tüm açılardan nüfuz edebilmesi ve daha etkili yıkama nedeniyle daha az arka plan lekelenmesi üretebilmesidir, bu da görüntüleme sırasında daha iyi sinyal vermeyle sonuçlanır. Ek olarak, bölümler işlemden sonra slaytlara monte edilir, böylece doku dekolmanı olasılığını ortadan kaldırır ve kriyostatı işgal eden süreyi azaltır. Serbest yüzen yöntem, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalar için çok daha az emek yoğun olabilir. Örneğin, aynı numuneden birçok (18-40) bölümün aynı kuyuda bir araya getirilmesi mümkündür, bu da hem yıkama hem de antikor inkübasyon adımlarının gerçekleştirilmesinde zaman kazandırır. Ayrıca, bu yaklaşım kullanılarak slayt başına daha fazla sayıda (12-16) bölüm monte edilebildiğinden, araştırmacının bölümleri görüntülemesi ve görüntülemesi genellikle daha uygun ve daha hızlıdır. Özellikle, doku dilimlerinin slaytlara montajı sırasında, istenen yön elde edilene kadar bölümler takılabilir ve ayrılabilir. Araştırmacılar ayrıca serbest yüzen yöntemi kullanarak genellikle biraz daha düşük antikor konsantrasyonları kullanırlar ve inkübasyonlar mikrosantrifüj tüplerinde gerçekleştirildiğinden, antikorlar yeniden kullanım için sodyum azid ile kolayca toplanabilir ve korunabilir (bakınız Adım 5.1). Diğer bir avantaj, kesitlerin kriyoprotektan çözeltisi32 ile küçük mikrosantrifüj tüplerinde -80 ° C'de doğrudan saklanabilmesidir, böylece depolama alanını en aza indirir ve numunelerin ömrünü en üst düzeye çıkarır33. Bu tekniği kullanmanın bir dezavantajı, bölümlerin çok fazla ele alınması ve bu nedenle hasara yatkın olmasıdır. Bununla birlikte, bu, düşük sallanma ve dönme hızları kullanılarak ve ayrıca araştırmacıları numunelerin nasıl aktarılacağı ve bölümlerin slaytlara nasıl monte edileceği konusunda uygun şekilde eğiterek hafifletilebilir.
Birlikte ele alındığında, IHC hem klinik hem de biyomedikal araştırma alanlarında protein ekspresyonunu görselleştirmek ve lokalize etmek için yerleşik, gerekli bir araçtır. Serbest yüzen IHC, özellikle büyük ölçekli histolojik çalışmalar gerçekleştirirken verimli, esnek ve ekonomik bir yöntemdir. Burada, bilimsel topluluk için kromojenik IHC ve hematoksilin ve eozin veya cresyl violet boyama gibi diğer boyamalar için uygun şekilde uyarlanabilen güvenilir bir serbest yüzen floresan IHC protokolü sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf oje</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıpları</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>At serumu, ısıyla etkisiz</td><td>hale getirilmiş Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slayt kutuları</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Birincil antikor</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dikdörtgen Lameller</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Dikdörtgen boyama kabı</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak sanatçı boya fırçası #2</td><td>Princeton Select Serisi</td><td>3750R</td><td>Marka önemli değil</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gömmek için örnek matrisiLeke tepsisi &ndash; slayt boyama sistemi Elektron</td><td>Mikroskobu Hizmetleri</td><td>71396-B</td><td>Koyu kapak</td></tr><tr><td>Sucrose</td> kullanın <td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarlar</td><td>H-1000 12</td><td></td></tr><tr><td>oyuklu plakalar için sertleşmeyen kuyu ekleri</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar için kuyu ekleri</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

serbest yüzen doku kesitleri kullanılarak histolojik tabanlı boyamalar

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

İmmünohistokimya, spesifik doku yapılarının yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Boyama prosedürü sırasında doku kesitlerini işlemek için iki alternatif yaklaşım yaygın olarak kullanılmaktadır, bir yaklaşım bölümleri doğrudan cam slaytlara monte etmekten oluşurken, ikinci bir yaklaşım olan serbest yüzen, çözelti içinde askıya alınırken sabit bölümlerin korunmasına ve boyanmasına izin verir. Slayta monte edilmiş ve serbest yüzen yaklaşımlar benzer sonuçlar verebilse de, serbest yüzen teknik daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir ve bu nedenle dokuların 3D rekonstrüksiyonu için daha kalın bölümler kullanılacaksa, örneğin deneyin odak noktası beyin bölgelerindeki dendritik ve aksonal projeksiyonlar hakkında bilgi edinmek olduğunda tercih edilen yöntem olmalıdır. Ek olarak, bölümler çözelti içinde tutulduğundan, tek bir aliquot, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalarda, kullanımı daha az zahmetli olan 30 ila 40 bölümü kolayca barındırabilir. Burada, serbest yüzen yöntemin floresan immünohistokimya boyamasına nasıl uygulanacağını ve beyin bölümlerine odaklanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, serbest yüzen tekniğin, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl kolayca değiştirilebileceğini ve doku örnekleri tipik olarak paraformaldehit veya formalin ile düzgün bir şekilde sabitlendiği sürece, hematoksilin ve eozin ve cresyl violet gibi diğer histokimyasal bazlı boyamaların yanı sıra diğer dokulara nasıl uyarlanabileceğini de tartışacağız.

Bir floresan immünohistokimyasal tahlil gerçekleştirmek için serbest yüzen yöntemin kullanılmasının genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ekspresyonunu inceleyen fare beyninde serbest yüzen yöntemi kullanan floresan IHC'nin temsili örneği, boyamanın genel kalitesini göstermek için Şekil 2'de hem daha düşük hem de daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Bu yaklaşım, Şekil 3'te gösterilen GFP düşük...

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Bu serbest yüzen teknik, fare beyin dokusu örneklerinde azaltılmış immünohistokimya gerçekleştirmek için kullanılabilir. Serbest yüzdürme tekniği çeşitli avantajlar sağlar. Daha kalın doku kesitlerinin elde edilmesi, büyük ölçekli çalışmaların gerçekleştirilmesi, alikot başına 30 ila 40 dilim kullanılması ve numunelerin uzun süreli saklanması.Bu tekniği ilk kez deniyorsanız, yöntemle ilgili deneyim kazanmak için deneyiniz için kritik olmayan bölümleri monte etme alıştırması yapmanızı öneririz. Kesitlemeden en az bir ila iki saat önce, kriyostattaki ilgili numuneleri uygun doku kesme sıcaklığında iklimlendirin. Dokular hazır olduğunda.20 ila 50 mikron kalınlığında kesitler elde etmek için kriyostatı kullanın ve bölümleri altı veya 12 oyuklu bir plakanın PBS dolgulu oyuklarında ayrı eklere yerleştirin. Tüm bölümler elde edildiğinde, her bir bölüm oyuğunu, tüp başına bir ila 1,5 mililitre depolama çözeltisi içeren iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarmadan önce, numuneleri üç beş dakikalık yıkama boyunca yıkama başına yaklaşık altı mililitre ile örtün. Daha sonra numuneleri lekelenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Doku kesiti boyama için, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltmadan önce numuneleri 10 ila 20 dakika oda sıcaklığına dengeleyin. Depolama çözeltisinin tamamı boşaltıldığında, ekleri, oda sıcaklığında düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama başına taze TBS ile beş dakika boyunca üç yıkama için oyuk başına yaklaşık altı mililitre TBS içeren yeni kuyucuklara taşıyın. Son yıkamadan sonra, çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa yedi mililitre taze hazırlanmış bloke edici geçirgenleştirici solüsyon ekleyin.İnkübasyonun sonunda, ilgilenilen birincil antikor çözeltisinin bir mililitresini, her bir ek için iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve her bir parçadaki tüm bölümleri uygun iki mililitrelik tüpe aktarın. Ardından tüpleri dönen bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için dakikada yaklaşık yedi devir ekleyin.Ertesi sabah, her bir tüpten gelen bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki ayrı kuyucuk eklerine boşaltın ve bölümleri yıkama başına 30 saniye boyunca iki kez ve yıkama başına taze TBS'de 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kesit gruplarını, tüp başına bir mililitre uygun ikincil antikor çözeltisi içeren ayrı ayrı iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri, ışıktan korunmuş, düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltın ve numuneleri ışıktan korunarak yıkama başına 30 saniye ve 15 dakika boyunca taze TBS'de iki kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, bölümleri dörtte üçü TBS ile doldurulmuş bir cam dikdörtgen histolojik odaya boşaltın ve TBS'ye bir cam slayt batırın. İstenirse ince bir boya fırçası ve büyüteç lambası kullanarak, bölümleri slayta doğru dikkatlice ikna edin ve kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olarak slaytın üzerine bir bölüme hafifçe vurun. Tüm bölümler bir kızağa yakalandığında, slaytların oda sıcaklığında, ışıktan korunarak, bölümler opak olana kadar yaklaşık 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin ve bölümlere uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın.Ortamın üzerine bir kapak fişi yerleştirmek için cımbız kullanın ve fazla ortamı çıkarmak için kapak mendilini sıkıca bastırmak için bir parça filtre kağıdı kullanın. Kesitler daha sonra uygun bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir veya dört santigrat dereceye ayarlanmış karanlık bir slayt kutusunda saklanabilir. Bu temsili görüntülerde görüldüğü gibi, glial fibriller asidik protein ekspresyonunu incelemek için fare beyin dokusu kesitleri üzerinde serbest yüzer yöntem kullanılarak floresan immünohistokimyasal analiz yapılabilir.Bu yaklaşım aynı zamanda, düşük eksprese eden transgenik fare beyin örneğinde veya kresil menekşe gibi floresan olmayan histokimyasal boyama protokollerinde GFP gibi düşük ekspresyonlu proteinleri ortaya çıkarmak için de uygundur. Diğer periferik dokular da bu düşük seviyeli GFP eksprese eden karaciğer dokusu örnekleri için gözlemlendiği gibi herhangi bir modifikasyon gerekmeksizin bu tekniğin kullanımına uygundur. Serbest yüzdürme tekniği ile hatırlanması gereken en önemli şey, özellikle transferler sırasında ve numuneler çalkalayıcılar veya döndürücüler üzerindeyken bölümlere karşı nazik olmaktır.İmmünofloresan boyamaya ek olarak, bu yöntem hematoksilen ve eozin ve kresil menekşe gibi diğer histokimyasal boyalar veya kromojen immünohistokimyası için kolayca değiştirilebilir.

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Aşağıdaki videoda, formalin fiksasyonu ve parafin gömme ile bir dokunun morfolojisinin nasıl korunacağı açıklanmaktadır.

Formalinle Sabit Parafin Gömülü (FFPE) Doku Koruma: Doku Morfolojisini İncelemek İçin Bir Yöntem

Burada, artefaktların donmasını önlemek için kas biyopsilerinin dondurulması, gömülmesi, kriyoseksiyonu ve boyanması için en etkili yöntemleri gösteriyoruz.

Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Burada, 100 μm'den birkaç milimetreye kadar değişen sabit üç boyutlu hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunuyoruz, böylece morfolojilerinin, hücre tipi bileşimlerinin ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlıyoruz.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Biz, bizim laboratuar çok rutin kullanımı hem de dondurulmuş ve parafin bölümleri için modifiye epidermis içinde immunolocalization için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Doku sindirim ve PCR okuma da dahil olmak üzere bir fare kuyruğu örnek tam genotipleme, bir ve bir buçuk saat Sigma'nın SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti kullanılarak yapılır.

Sigma&#39;nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

Öğrenin, fare beyin dokularında serbest yüzen kesitlerle immünohistokimyasal boyama yöntemini. Kalın kesitler, uzun süreli depolama ve düşük ekspresyonlu proteinlerin tespiti için ideal bir tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Daha fazla video keşfet