Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar
25 Ağustos 2020
Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.
Bu serbest yüzen teknik, fare beyin dokusu örneklerinde azaltılmış immünohistokimya gerçekleştirmek için kullanılabilir. Serbest yüzdürme tekniği çeşitli avantajlar sağlar. Daha kalın doku kesitlerinin elde edilmesi, büyük ölçekli çalışmaların gerçekleştirilmesi, alikot başına 30 ila 40 dilim kullanılması ve numunelerin uzun süreli saklanması.
Bu tekniği ilk kez deniyorsanız, yöntemle ilgili deneyim kazanmak için deneyiniz için kritik olmayan bölümleri monte etme alıştırması yapmanızı öneririz. Kesitlemeden en az bir ila iki saat önce, kriyostattaki ilgili numuneleri uygun doku kesme sıcaklığında iklimlendirin. Dokular hazır olduğunda.
20 ila 50 mikron kalınlığında kesitler elde etmek için kriyostatı kullanın ve bölümleri altı veya 12 oyuklu bir plakanın PBS dolgulu oyuklarında ayrı eklere yerleştirin. Tüm bölümler elde edildiğinde, her bir bölüm oyuğunu, tüp başına bir ila 1,5 mililitre depolama çözeltisi içeren iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarmadan önce, numuneleri üç beş dakikalık yıkama boyunca yıkama başına yaklaşık altı mililitre ile örtün. Daha sonra numuneleri lekelenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Doku kesiti boyama için, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltmadan önce numuneleri 10 ila 20 dakika oda sıcaklığına dengeleyin. Depolama çözeltisinin tamamı boşaltıldığında, ekleri, oda sıcaklığında düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama başına taze TBS ile beş dakika boyunca üç yıkama için oyuk başına yaklaşık altı mililitre TBS içeren yeni kuyucuklara taşıyın. Son yıkamadan sonra, çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa yedi mililitre taze hazırlanmış bloke edici geçirgenleştirici solüsyon ekleyin.
İnkübasyonun sonunda, ilgilenilen birincil antikor çözeltisinin bir mililitresini, her bir ek için iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve her bir parçadaki tüm bölümleri uygun iki mililitrelik tüpe aktarın. Ardından tüpleri dönen bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için dakikada yaklaşık yedi devir ekleyin.
Ertesi sabah, her bir tüpten gelen bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki ayrı kuyucuk eklerine boşaltın ve bölümleri yıkama başına 30 saniye boyunca iki kez ve yıkama başına taze TBS'de 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kesit gruplarını, tüp başına bir mililitre uygun ikincil antikor çözeltisi içeren ayrı ayrı iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri, ışıktan korunmuş, düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltın ve numuneleri ışıktan korunarak yıkama başına 30 saniye ve 15 dakika boyunca taze TBS'de iki kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, bölümleri dörtte üçü TBS ile doldurulmuş bir cam dikdörtgen histolojik odaya boşaltın ve TBS'ye bir cam slayt batırın. İstenirse ince bir boya fırçası ve büyüteç lambası kullanarak, bölümleri slayta doğru dikkatlice ikna edin ve kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olarak slaytın üzerine bir bölüme hafifçe vurun. Tüm bölümler bir kızağa yakalandığında, slaytların oda sıcaklığında, ışıktan korunarak, bölümler opak olana kadar yaklaşık 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin ve bölümlere uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın.
Ortamın üzerine bir kapak fişi yerleştirmek için cımbız kullanın ve fazla ortamı çıkarmak için kapak mendilini sıkıca bastırmak için bir parça filtre kağıdı kullanın. Kesitler daha sonra uygun bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir veya dört santigrat dereceye ayarlanmış karanlık bir slayt kutusunda saklanabilir. Bu temsili görüntülerde görüldüğü gibi, glial fibriller asidik protein ekspresyonunu incelemek için fare beyin dokusu kesitleri üzerinde serbest yüzer yöntem kullanılarak floresan immünohistokimyasal analiz yapılabilir.
Bu yaklaşım aynı zamanda, düşük eksprese eden transgenik fare beyin örneğinde veya kresil menekşe gibi floresan olmayan histokimyasal boyama protokollerinde GFP gibi düşük ekspresyonlu proteinleri ortaya çıkarmak için de uygundur. Diğer periferik dokular da bu düşük seviyeli GFP eksprese eden karaciğer dokusu örnekleri için gözlemlendiği gibi herhangi bir modifikasyon gerekmeksizin bu tekniğin kullanımına uygundur. Serbest yüzdürme tekniği ile hatırlanması gereken en önemli şey, özellikle transferler sırasında ve numuneler çalkalayıcılar veya döndürücüler üzerindeyken bölümlere karşı nazik olmaktır.
İmmünofloresan boyamaya ek olarak, bu yöntem hematoksilen ve eozin ve kresil menekşe gibi diğer histokimyasal boyalar veya kromojen immünohistokimyası için kolayca değiştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Serbest yüzdürme tekniği, biyolojik yapıların, hücre tiplerinin ve protein ekspresyonunun görselleştirilmesine olanak tanıyan, tespit edilmiş doku kesitlerinde immünohistokimya gerçekleştirmek için kullanılır. Bu yöntem özellikle beyin, kalp ve karaciğer gibi çeşitli dokuların incelenmesinde etkilidir; daha kalın doku kesitleri sağlayabilmesi ve büyük ölçekli çalışmalar için uygun olması gibi avantajlar sunar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Histoloji
- İmmünohistokimya
- Doku analizi
Arka Plan
- Serbest yüzdürme tekniğinin avantajları arasında daha kolay uygulama ve örneklerin uzun süreli saklanabilme olasılığı yer almaktadır.
- Bu yöntem, herhangi bir modifikasyon gerektirmeden birden fazla biyolojik doku üzerinde uygulanabilir.
- Yöntem, çeşitli örnek türlerinde düşük ekspresyona sahip proteinlerin tespitini artırır.
Kullanılan Yöntemler
- İmmünohistokimyasal boyama
- Fare beyin dokusu örnekleri
- Floresan mikroskopi
Temel Sonuçlar
- Bu teknik, glial fibriler asidik protein ekspresyonunun tanımlanmasına olanak tanır.
- GFP transgenik fare örneklerinde olduğu gibi, düşük protein ekspresyonu durumlarında etkili olduğunu kanıtlamıştır.
- Bu teknik kullanılarak hematoksilen ve eozin gibi diğer boyama yöntemleri de uygulanabilir.
Sonuçlar
- Çalışma, doku boyama ve analizi için serbest yüzer tekniğinin çok yönlülüğünü vurgulamaktadır.
- Deneyler sırasında bütünlüğü korumak adına, araştırmacıların örneklere nazik davranması hayati önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Serbest yüzer immünohistokimya tekniği, kalın doku kesitlerinin geniş ölçekli çalışmalar için verimli bir şekilde işlenmesine olanak tanıyarak nörobilim ve periferik doku araştırmalarında hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Antikor penetrasyonunu iyileştirerek ve alikot başına 30-40 kesitin toplu olarak işlenmesine izin vererek, keşif iş akışlarındaki tekrarlanabilirliği ve verimliliği artırır. Bu yaklaşım, nöral projeksiyonların 3B rekonstrüksiyonunun hedef güvenilirliği ve portföy önceliklendirmesi hakkında bilgi sağladığı beyin gibi karmaşık dokularda protein ekspresyon paternlerini incelemek için özellikle değerlidir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kalın doku kesitlerinde protein ekspresyonunun ve lokalizasyonunun görselleştirilmesini sağlayarak, fonksiyonel hedef doğrulamasını ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Alikot başına çok sayıda kesitin işlenmesini kolaylaştırarak, büyük ölçekli biyobelirteç tarama kampanyalarındaki iş yükünü azaltır.
- Öngörücü Değer: Slayta monte edilen yöntemlere kıyasla antikor penetrasyonunu iyileştirerek, transgenik modellerdeki GFP gibi düşük bolluktaki hedeflerin saptanmasındaki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hematoksilin ve eosin, krezil viyole ve kromojen immünohistokimya dahil olmak üzere çok sayıda histokimyasal boyama ile uyumlu olup esnek assay geliştirmeye olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kesitler boyama sırasında çözelti içinde askıda kalır; bu da reaktifle tekdüze teması sağlar ve tekrarlar arasındaki değişkenliği minimize eder.
- Ölçeklenebilirlik: -80°C'de uzun süreli saklamayı destekleyerek keşif süreçlerinde toplu işlemeye ve retrospektif analize imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Protokol modifikasyonuna gerek duyulmaksızın hem merkezi sinir sistemi hem de periferik dokular (örn. karaciğer, kalp) için uygulanabilir olup, çapraz hedef doğrulamayı destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Aksonal ve dendritik projeksiyonların 3D rekonstrüksiyonuna olanak tanıyarak, hedef etkileşimi ve yolak analizi için yapısal bağlam sağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Preklinik hedef seçiminde "devam/dur" kararlarına temel teşkil eden kantitatif ve mekansal olarak çözünür protein ekspresyon verileri üretir.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Serbest yüzdürme yöntemi, özellikle nörobilim ve sistemik toksisite değerlendirmelerinde, erken hedef hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Sabitlenmiş dokulardaki protein ekspresyon modellerinin hipotez odaklı sorgulamasını destekleyerek hedef biyolojisine dair mekanistik içgörüler sağlar.
- Tarama: Otomatik görüntüleme ve görüntü tabanlı tarama platformlarına uygun, tekrarlanabilir, kantitatif floresan veya kromojenik okumalar üretir.
- Analitik: Hedef modülasyonunu değerlendirmek için deneysel koşullar arasında nicelendirilebilen ve karşılaştırılabilen, mekansal olarak çözümlenmiş ekspresyon verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Farklı türler ve doku tipleri boyunca özdeş boyama protokolleri uygulayarak, keşif aşaması ile preklinik modeller arasında tutarlılık sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve terapötik alanda uygulanabilen, histolojik analizler için standartlaştırılmış ve uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İmmünohistokimyada tespit hassasiyetini ve özgünlüğünü artırarak hedef doğrulama çalışmalarındaki yanlış negatifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Doku işleme ve boyama prosedürlerini standardize ederek laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği artırır ve teknik değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Histoloji tabanlı taramalarda işlem kapasitesini artırır, örnek başına maliyeti düşürür ve hedef risk azaltma döngülerini hızlandırır.
- Portföy Etkisi: Biyolojik makuliyet ve güvenlik marjları hakkında bilgi veren güvenilir, çok parametreli doku okumaları sağlayarak veri odaklı hedef önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Histoloji, doku kesit alma ve immünofloresan veya kromojenik saptama yöntemlerinde uzmanlık gerektirir.
- Kriyostat, mikrotom, orbital sarsıcılar, döner karıştırıcılar ve floresan veya parlak alan mikroskoplarına erişime bağlıdır.
- Non-spesifik bağlanmayı en aza indirmek ve boyama tutarlılığını sağlamak için standartlaştırılmış bloklama, permeabilizasyon ve yıkama tamponları gereklidir.
- Her hedef ve doku tipi için, özellikle düşük bolluktaki proteinler için antikor konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu gerekir.
- Transfer ve inkübasyon basamakları sırasında mekanik hasarı önlemek için serbest yüzen kesitlerin dikkatli ve nazik bir şekilde taşınmasını gerektirir.
