Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Bu serbest yüzen teknik, fare beyin dokusu örneklerinde azaltılmış immünohistokimya gerçekleştirmek için kullanılabilir. Serbest yüzdürme tekniği çeşitli avantajlar sağlar. Daha kalın doku kesitlerinin elde edilmesi, büyük ölçekli çalışmaların gerçekleştirilmesi, alikot başına 30 ila 40 dilim kullanılması ve numunelerin uzun süreli saklanması.

Bu tekniği ilk kez deniyorsanız, yöntemle ilgili deneyim kazanmak için deneyiniz için kritik olmayan bölümleri monte etme alıştırması yapmanızı öneririz. Kesitlemeden en az bir ila iki saat önce, kriyostattaki ilgili numuneleri uygun doku kesme sıcaklığında iklimlendirin. Dokular hazır olduğunda.

20 ila 50 mikron kalınlığında kesitler elde etmek için kriyostatı kullanın ve bölümleri altı veya 12 oyuklu bir plakanın PBS dolgulu oyuklarında ayrı eklere yerleştirin. Tüm bölümler elde edildiğinde, her bir bölüm oyuğunu, tüp başına bir ila 1,5 mililitre depolama çözeltisi içeren iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarmadan önce, numuneleri üç beş dakikalık yıkama boyunca yıkama başına yaklaşık altı mililitre ile örtün. Daha sonra numuneleri lekelenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Doku kesiti boyama için, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltmadan önce numuneleri 10 ila 20 dakika oda sıcaklığına dengeleyin. Depolama çözeltisinin tamamı boşaltıldığında, ekleri, oda sıcaklığında düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama başına taze TBS ile beş dakika boyunca üç yıkama için oyuk başına yaklaşık altı mililitre TBS içeren yeni kuyucuklara taşıyın. Son yıkamadan sonra, çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa yedi mililitre taze hazırlanmış bloke edici geçirgenleştirici solüsyon ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, ilgilenilen birincil antikor çözeltisinin bir mililitresini, her bir ek için iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve her bir parçadaki tüm bölümleri uygun iki mililitrelik tüpe aktarın. Ardından tüpleri dönen bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için dakikada yaklaşık yedi devir ekleyin.

Ertesi sabah, her bir tüpten gelen bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki ayrı kuyucuk eklerine boşaltın ve bölümleri yıkama başına 30 saniye boyunca iki kez ve yıkama başına taze TBS'de 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kesit gruplarını, tüp başına bir mililitre uygun ikincil antikor çözeltisi içeren ayrı ayrı iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri, ışıktan korunmuş, düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bölümleri yeni bir altı oyuklu plakadaki eklere boşaltın ve numuneleri ışıktan korunarak yıkama başına 30 saniye ve 15 dakika boyunca taze TBS'de iki kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, bölümleri dörtte üçü TBS ile doldurulmuş bir cam dikdörtgen histolojik odaya boşaltın ve TBS'ye bir cam slayt batırın. İstenirse ince bir boya fırçası ve büyüteç lambası kullanarak, bölümleri slayta doğru dikkatlice ikna edin ve kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olarak slaytın üzerine bir bölüme hafifçe vurun. Tüm bölümler bir kızağa yakalandığında, slaytların oda sıcaklığında, ışıktan korunarak, bölümler opak olana kadar yaklaşık 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin ve bölümlere uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın.

Ortamın üzerine bir kapak fişi yerleştirmek için cımbız kullanın ve fazla ortamı çıkarmak için kapak mendilini sıkıca bastırmak için bir parça filtre kağıdı kullanın. Kesitler daha sonra uygun bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir veya dört santigrat dereceye ayarlanmış karanlık bir slayt kutusunda saklanabilir. Bu temsili görüntülerde görüldüğü gibi, glial fibriller asidik protein ekspresyonunu incelemek için fare beyin dokusu kesitleri üzerinde serbest yüzer yöntem kullanılarak floresan immünohistokimyasal analiz yapılabilir.

Bu yaklaşım aynı zamanda, düşük eksprese eden transgenik fare beyin örneğinde veya kresil menekşe gibi floresan olmayan histokimyasal boyama protokollerinde GFP gibi düşük ekspresyonlu proteinleri ortaya çıkarmak için de uygundur. Diğer periferik dokular da bu düşük seviyeli GFP eksprese eden karaciğer dokusu örnekleri için gözlemlendiği gibi herhangi bir modifikasyon gerekmeksizin bu tekniğin kullanımına uygundur. Serbest yüzdürme tekniği ile hatırlanması gereken en önemli şey, özellikle transferler sırasında ve numuneler çalkalayıcılar veya döndürücüler üzerindeyken bölümlere karşı nazik olmaktır.

İmmünofloresan boyamaya ek olarak, bu yöntem hematoksilen ve eozin ve kresil menekşe gibi diğer histokimyasal boyalar veya kromojen immünohistokimyası için kolayca değiştirilebilir.