Name: İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegansta Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta lokalize olmayan titreşimlerle kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, davranışsal nörobilim araştırmalarında sinirsel yanıtları invaziv olmayan şekilde incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne bu çalışmada kullanılan suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu yayın JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) tarafından desteklenmiştir (Hibe no. JP18H02483), Yenilikçi alanlar üzerine "Yumuşak Robot Bilimi" projesi (Hibe no. JP18H05474), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan PRIME (hibe numarası 19gm6110022h001) ve Shimadzu vakfı.

1. Kalsiyum görüntülemeye kadar solucan yetiştiriciliği
<ol><li>Bir kalsiyum görüntüleme deneyinden dört gün önce, iki yetişkin ST12 solucanını, Escherichia coli OP50'nin bir hücre yayıcı kullanılarak kare bir desende (yaklaşık 4 mm x 4 mm) çizgilendiği yeni bir nematod büyüme ortamı (NGM) plakasına (Malzeme Tablosu) aktarın, böylece solucan kalsiyum görüntüleme sırasında bakterilerde çoğu zaman geçirir12.</li>
	<li>Bu NGM plakasını bir inkübatörde 20 °C'de 4 gün boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosu).</li>
</ol>2. Donanım kurulumu
<ol><li>Stimülasyon13 için piezoelektrik bir cihaz, 2x objektif lens, yüksek hızlı bir sCMOS kamera, görüntü bölme optiği, x-y motorlu bir aşama, uyarma için bir LED ışık kaynağı ve bir bilgisayar ile donatılmış bir mikroskop hazırlayın (Şekil 1). sCMOS kameranın temel özellikleri arasında 2560 x 2160 aktif piksel, 6,5 μm boyutunda ve arabirim seçeneği olarak 10 dokunuşlu kamera bağlantısı bulunur. X-Y motorlu kademenin temel özellikleri arasında 110 mm x 75 mm hareket aralığı, 250 mm/s maksimum hız, 2.000 mm/s2 maksimum hızlanma ve 0,25 μm tek yönlü tekrarlanabilirlik bulunur.</li>
	<li>Bilgisayarı ve x-y motorlu kademe kontrolörünü açın.</li>
	<li>Amplifikatörü açın ve Ses ayarlayıcıyı 10'a, Bas ve Tiz ayarlayıcılarını 8'e ayarlayın.</li>
	<li>GCaMP ve TagRFP'yi heyecanlandırmak için LED ışık kaynağının 488 nm ve 560 nm ışıklarını açın. Işık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 nm ve 550 nm göstergelerini %5'e ayarlayın, böylece LED ışığının yoğunluğu görüntüleme için uygundur. NOT: Bu LED yoğunluğunda, kayıt sırasında GCaMP ve TagRFP floresansının fotobeyazlatılması gerçekleşmez.</li>
</ol>3. Kalsiyum görüntüleme için yazılım kurulumu
<ol><li>Windows'ta üç yazılım paketi indirin ve yükleyin: fare makro yazılımı, titreşim özelliğini kontrol etmek için yazılım, izleme yazılımı çalıştırmak için yazılım ve veri analizi yazılımı (Malzeme Tablosu).</li>
	<li>İzleme yazılımı dosyasına çift tıklayın.</li>
	<li>Çalıştır düğmesine basın ve yazılımı stabilize etmek için 5 dakika bekleyin (Şekil 2A).</li>
	<li>Pozlama süresi ve ciltleme hakkında bilgi verin. 2 x 2 gruplama ile 0,033 s pozlama süresi sorunsuz görüntü yakalama sağlar (Şekil 2B). NOT: Bellek yükünü azaltmak için yalnızca alınan her 10. görüntü görüntülenir.</li>
	<li>Görüntü alma için bilgi sağlayın (Şekil 2C). Örneğin, 500 görüntü 10 sn aralıklarla iki kez kaydedildiğinde, Görüntü Toplam kutusuna 1.000, Görüntüler kutusuna 500 ve Aralık kutusuna 10 girin.</li>
	<li>Edinme düğmesini açın (Şekil 2B).</li>
	<li>Görüntü bölme optiklerini ve iki görüntüyü (GCaMP kanalı, 500-525 nm (Şekil 2E); TagRFP kanalı, 584-676 nm (Şekil 2F)) sCMOS kameranın iki yarısına yansıtılır. GCaMP ve TagRFP kanallarının koordinatlarını kalibre edin (Şekil 2G). Yazılım ayarlarını kaydedin.</li>
	<li>Veri dosyasının çıktısını almak için dizini ayarlayın (Şekil 2H).</li>
	<li>Edinme düğmesini kapatın (Şekil 2D).</li>
	<li>Fare makro sistemi yazılımına çift tıklayın (Şekil 3A) ve titreşim özelliklerini ayarlayın (Şekil 3B). Fare imlecinin koordinatlara ve dosyadaki zamanlamaya göre denetlenmesi için Assay.txt dosyasını fare makro sistemiyle okuyun (Şekil 3A). Fare imlecinin koordinatlarını ayarlayın (Şekil 3A'daki macenta kareleri) ve kayda başladıktan sonra uyarılana kadar bekleyin (Şekil 3A'da macenta). Titreşim kontrolü için yazılımdaki frekansı ve genlik değerlerini ayarlayın (Şekil 3B).</li>
</ol>4. Kalsiyum görüntüleme için solucanların hazırlanması
<ol><li>Hem GCaMP hem de TagRFP'yi eksprese eden tek bir solucanı, inkübe edilmiş plakadan, E. coli OP50'nin çizildiği yeni bir taze NGM plakasına aktarın.</li>
	<li>NGM plakasını şeffaf yapışkan bant kullanarak piezoelektrik akustik dönüştürücüye takın (Şekil 4). Plakayı aktüatöre bastırmayın, çünkü bu titreşim frekansını değiştirir.</li>
</ol>5. Spesifik titreşim özelliklerinin kontrolü altında kalsiyum görüntüleme
<ol><li>Edinme düğmesini açın (Şekil 2B).</li>
	<li>Solucanı parlak ışık ve uyarma ışığı (488 nm ve 560 nm) altında bulun.</li>
	<li>Mikroskopinin yakınlaştırma değerini 2,5x olarak ayarlayın. Görüş alanı 1,1 mm x 1,1 mm'dir ve 2,6 μm/piksel çözünürlüğe sahiptir.</li>
	<li>Parlak ışığı kapatın ve solucanın floresan noktasını izlemek için Homing düğmesini (Şekil 2I) açın. Bu yönlendirme düğmesi, solucanın maksimum yoğunluk bölgesini TagRFP görüntüsündeki görüş alanının ortasında tutmak için X-Y aşamasının hareketini başlatır. NOT: Flap-18 promotörü açısından, AVA nöronlarının floresan yoğunluğu en güçlüdür ve diğer nöronlardan gelenler soluktur veya tespit edilmez. Bu nedenle, izleme için düşük büyütme sistemi gerekli değildir ve sahne alanı kayıt boyunca hareket eder.</li>
	<li>Şekil 2E ve 2F'deki yoğunluk çubuklarının değerlerinin yaklaşık 1.000 olduğundan emin olun. Değilse, ışık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 nm ve 550 nm göstergelerine ince ayar yapın.</li>
	<li>Şekil 3A'da açıklanan bir zamanlamaya göre fare imleci denetimine izin vermek için fare makro sistemindeki Çalıştır düğmesine basın. Bu, izleme yazılımını kullanarak kayıt yapmaya başlar ve solucanı izlerken dalga gen yazılımı tarafından uyarılır.</li>
	<li>Çıktı BMP dosyasının uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Masaüstünde bir klasör oluşturun ve CalciumImaging olarak adlandırın.</li>
	<li>CalciumImaging klasörünün içinde bir klasör oluşturun ve çıktı sonuç dosyaları için CIResult olarak adlandırın.</li>
	<li>Windows için veri analiz yazılımında yazılmış DualViewImaging.nb dosyasına çift tıklayın.</li>
	<li>Dosya yolunu CIResult klasörüne ekleyin (örneğin, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Şekil 5).</li>
	<li>Dosya yolunu, BMP dosyasını içeren klasöre ekleyin (örneğin, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Şekil 5), burada XXX, BMP dosyalarını içeren klasör adını gösterir.</li>
	<li>Otomatik bir analiz başlatmak için Shift ve Return tuşlarına aynı anda basın. Bu analiz, TagRFP görüntüsündeki görüş alanının maksimum yoğunluk bölgesinin değerini kullanır (Programdaki ayrıntılı hesaplama prosedürü için Şekil 6'nın göstergesine bakın).</li>
	<li>Aşağıdaki çıktı dosyalarının CIResult klasöründe uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin. XXX-GCaMP.tif (tüm görüntüler için GCaMP yoğunluklarının izlerini gösteren görüntü dosyası) XXX-GCaMP.xls (tüm resimlerdeki GCaMP yoğunluklarını listeleyen e-tablo dosyası) XXX-TagRFP.tif (tüm görüntüler için TagRFP yoğunluklarının izlerini gösteren resim dosyası) XXX-TagRFP.xls (tüm resimlerdeki TagRFP yoğunluklarını listeleyen elektronik tablo dosyası) XXX-Ratio.tif (tüm görüntüler için oran değerinin izlerini gösteren görüntü dosyası) XXX-Ratio.xls (tüm resimlerdeki oran değerini listeleyen e-tablo dosyası)</li>
</ol>

<ol><li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotremology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li>
<li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+force%3A+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li>
<li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li>
<li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li>
<li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88(2013).</li>
<li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%3A+The+International+Journal+of+the+Japan+Society+for+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li>
<li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressional+and+surface+waves+in+sand%3A+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li>
<li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li>
<li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li>
<li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li>
<li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li>
<li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Genel olarak, nöral aktivitenin nicelleştirilmesi, bir probun ve / veya hayvan vücudunun hareketine kısıtlamalar getirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, mekanosensoriyel davranış çalışmaları için, bir probun ve kısıtlamaların invaziv olarak sokulması mekanik uyaranları oluşturur. C. elegans , bu problemleri atlatmak için bir sistem sağlar, çünkü özellikleri şeffaftır ve sadece 302 nörondan oluşan basit, kompakt bir sinir devresine sahiptir. Bu avantajları, nano ölçekli yer değiştirme13'ün</...

Hayvanlar genellikle titreşimler veya akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik uyaranlara maruz kalırlar 1,2. Bu uyaranlar homeostazı, gelişimi ve üremeyi etkilediğinden, hayvanlar onlarla başa çıkmak için davranışlarını değiştirmelidir 3,4,5. Bununla birlikte, bu tür davranış değişikliklerinin altında yatan nöral devreler ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.
Nematoddaki mekanosensoriyel davranış, Caenorhabditis elegans, solucanların genellikle lokalize olmayan titreşimle karşılaştıklarında davranışlarını ileri hareketten geriye doğru kaçış tepkisine değiştirdikleri basit bir davranışsal paradigmadır6. Bu davranışın altında yatan nöral devre öncelikle beş duyusal nöron, dört çift internöron ve çeşitli motor nöron tiplerinden oluşur 7,8. Ek olarak, solucanlar tekrarlanan stimülasyonu içeren aralıklı eğitimden sonra bu tür mekanik uyaranlara alışırlar 9,10,11. Bu nedenle, bu basit davranışsal tepki, hem lokalize olmayan titreşimle uyarılmış davranışın hem de hafızanın altında yatan nöral mekanizmaları araştırmak için ideal bir sistem oluşturur. Lokalize olmayan titreşimlerin etkisi altında serbestçe davranan solucanlarda kalsiyum görüntüleme için bir protokol gösterilmiştir. Daha önce bildirilen sistemlerle karşılaştırıldığında, bu sistem izleme için ek bir kamera gerektirmemesi açısından basittir; ancak, lokalize olmayan titreşimin frekansını, yer değiştirmesini ve süresini değiştirmemize izin verir. AVA internöronlarının aktivasyonu geriye doğru kaçış tepkisini indüklediğinden, bir kalsiyum göstergesi olan GCaMP'yi ve AVA'ya özgü bir promotörün kontrolü altında kalsiyuma duyarlı olmayan bir floresan proteini olan TagRFP'yi birlikte ifade eden solucanlar örnek olarak kullanılmıştır (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Protokol, bir solucan ileriden geriye doğru harekete geçerken AVA nöronlarının aktivasyonunu gösterir. Bu protokol, mekanosensoriyel davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamayı kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>Data anaylsis software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DualViewImaging.nb</td><td>author</td><td></td><td>Elde edilen verilerin analizi için</td></tr><tr><td>Mathematica12</td><td>Wolfram</td><td></td><td>Veri analiz yazılımını çalıştırmak için DualViewImaging</td></tr><tr><td>Escherichia coli ve C. elegans suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>OP50</td><td>C. elegans. için gıda Urasil oksotrof. E. coli B.</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) suşu</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>KG1180</td><td>Işığa duyarsız mutant</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) AVA-spesifik promotör</td><td>yazar</td><td>ST12</td><td>lite-1(ce314) NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nükleer lokalizasyon sinyali) ve TagRFP'nin kontrolü altında NLS-GCaMP5G-NLS (NLS); ve TagRFP'nin kontrolü altında Ekstrakomozomal diziler olarak flp-18 promotörü</td></tr><tr><td><güçlü>Lazer Doppler vibrometresi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lase Doppler vibrometresi</td><td>Polytec Japonya</td><td>IVS-500</td><td>Akustik dönüştürücü tarafından üretilen frekans ve yer değiştirmeyi ölçmek için</td></tr><tr><td><güçlü>Fare makro sistemiAssay.txt</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Yazar</td><td></td> Windows HiMacroEx Vector <td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html'da fare eğrisini geçici ve özel olarak kontrol etmek için komut dosyası</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bir komut dosyasına dayalı fare imlecini kontrol etmek için ücretsiz indirme yazılımı</td></tr> <tr><td><güçlü>Nematod büyüme ortamı plakası< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar saflaştırılmış, toz</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td>için NGM plakalarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Wako</td><td>036-00485</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Wako</td><td>034-03002</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>di-Photassium hidrojenfosfat</td><td>Nakarai tesque</td><td>28727-95</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>LB et suyu, Lennox</td><td>Nakarai tesque</td><td>20066-95</td><td>E. coli OP50</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat susuz</td><td>TGI</td><td>M1890</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Potasyum Dihidrojenfosfat</td><td>Nakarai tesque</td><td>28720-65</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Nakarai tesque</td><td>31320-05</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Petri kapları (60 mm)</td><td>Nunc</td><td>150270</td><td>NGM plakalarının hazırlanması için</td></tr><tr><td><güçlü>Lokalize olmayan titreşim cihazı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>LEPY</td><td>LP-A7USB</td><td>Kontrol edilebilir titreşim ile stimülasyon için</td></tr><tr><td>Akustik dönüştürücü</td><td>MinebeaMitsumi</td><td>LVC25</td><td>Kontrol edilebilir titreşim ile stimülasyon için</td></tr><tr><td>WaveGene Ver. 1.5</td><td>Thrive</td><td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td><td>Titreşim özelliğini kontrol etmek için ücretsiz indirilebilir yazılım</td></tr><tr><td><güçlü>noninvaziv kalsiyum görüntüleme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Kanallı tezgah üstü 3 fazlı fırçasız DC servo kontrolör</td><td>Thorlabs</td><td>BBD202</td><td>MLS203-1 aşamaları için uyumlu kontrolör</td></tr><tr><td>479/585 nm BrightLine çift bantlı bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-479/585-25</td><td>İki kanallı görüntülerin alınması için (GCaMP ve TagRFP)</td></tr><tr><td>505/606 nm BrightLine çift kenarlı standart epi-floresan dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>FF505/606-Di01-25x36</td><td>İki kanallı görüntülerin alınması için (GCaMP ve TagRFP)</td></tr><tr><td>512/25 nm BrightLine tek bantlı bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-512/25-25</td><td>İki kanallı görüntülerin alınması için (GCaMP ve TagRFP)</td></tr><tr><td>630/92 nm BrightLine tek bantlı bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-630/92-25</td><td>İki kanallı görüntülerin alınması için (GCaMP ve TagRFP)</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Dell</td><td>Precision T7600</td><td>Windows7, Intel Xeon CPU ES-2630 ve 8 GB RAM ile</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı xy motorlu sahne Thorlabs</td><td></td><td>MLS203-1</td><td>Hızlı XY tarama aşaması</td></tr><tr><td>Görüntü bölme optiği</td><td>Hamamatsu fotonik</td><td>A12801-01</td><td>W-VIEW GEMINI tarafından oluşturulan iki kanallı görüntülerin (GCaMP ve TagRFP) alınması için Görüntü bölme optiği</td></tr><tr><td>LED ışık kaynağı</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td>470 nm ve 560 nm uyarma ışığı üretmek için</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla</td><td></td></tr><tr><td>x 2 Objektif lens</td><td>Olympus</td><td>MVPLAPO2XC</td><td>Çalışma mesafesi 20 mm ve sayısal açıklık 0.5</td></tr><tr><td><güçlü>Plazmid</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKDK66 plazmit</td><td>yazar</td><td>pKDK66</td><td>Ko-enjeksiyon işaretleyici</td></tr><tr><td>pTAK83 plazmit</td><td>yazarı</td><td>pTAK83</td><td>flp-18 promotörü pTAK144 kontrolü altında TagRFP'nin ekspresyonu için plazmid</td></tr><tr><td></td><td></td><td>pTAK144</td><td>Kontrolü altında NLS-GCaMP5G-NLS'nin ekspresyonu için plazmit&nbsp; flp-18 destekleyici</td></tr><tr><td>izleme yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homingback.vi</td><td>yazar</td><td></td><td>sCMOS kamera ve x-y motorlu sahne LabVIEW geri besleme kontrolü yoluyla bir solucanın floresan noktasını izlemek için SubVi dosyası</td></tr><tr><td></td><td>Ulusal enstrümanlar</td><td></td><td>İzleme yazılımını çalıştırmak için</td></tr><tr><td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td><td>yazarı</td><td></td><td>sCMOS kamera ve xy motorlu tablanın geri besleme kontrolü ile bir solucanın floresan noktasını izlemek için</td></tr></tbody></table>

İyi kontrollü, lokalize olmayan titreşimli serbest davranan caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Titreşimler ve akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik kuvvetler, gelişimden homeostaza kadar çok çeşitli biyolojik süreçleri etkiler. Hayvanlar, davranışlarını değiştirerek bu uyaranlarla baş ederler. Bu tür davranış değişikliğinin altında yatan mekanizmaları anlamak, ilgilenilen davranış sırasında nöral aktivitenin ölçülmesini gerektirir. Burada, spesifik frekans, yer değiştirme ve sürenin lokalize olmayan titreşimi ile serbest davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, akustik bir dönüştürücü kullanarak iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşimin üretilmesine ve uyarılmış kalsiyum tepkilerinin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesine izin verir. İlkenin bir kanıtı olarak, C. elegans'ın titreşime kaçış tepkisi sırasında tek bir internöron olan AVA'nın kalsiyum tepkisi gösterilmiştir. Bu sistem, mekanik uyaranlara davranışsal tepkilerin altında yatan nöral mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Burada, AVA internörona özgü promotörün kontrolü altında hem GCaMP hem de TagRFP'yi eksprese eden bir solucan, serbestçe davranan C. elegans'ta kalsiyum görüntülemenin bir örneği olarak kullanılır. GCaMP ve TagRFP kanal verileri, bazıları Şekil 6'da ve bir film olarak gösterilen bir dizi görüntü olarak elde edilmiştir (Ek Film 1). Lokalize olmayan titreşim sistemimiz tarafından indüklenen Petri plakasının yer değiştirmesi de (Şekil 7) ö...

Burada iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşime sahip serbestçe davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir sistem bildirilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların nano ölçekli yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarını ve C. elegans'ın titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımlarını ölçmelerini sağlar.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Sistemimiz, araştırmacıların ölçeklendirilmemiş yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarına ve tahriş edici maddelerin titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımını ölçmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel bir avantajı olarak, davranışın altında yatan mekanizmalar olan nöral mekanizmaları invaziv olmayan bir şekilde araştırabiliriz. Escherichia coli OP50'nin bir hücre yayıcı kullanılarak kare bir desende çizgilendiği yeni bir nematod büyüme ortamı veya NGM plakası hazırlayın, böylece solucan kalsiyum görüntüleme sırasında çoğu zaman bakterilerde geçirir.Bir kalsiyum görüntüleme deneyinden dört gün önce, iki yetişkin ST12 solucanını plakaya aktarın ve plakayı dört gün boyunca 20 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Stimülasyon için akustik dönüştürücü bir cihaz, 2x objektif lens, yüksek hızlı CMOS kamera, görüntü bölme optikleri ile donatılmış bir mikroskop kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirin. X Y motorlu kademe kontrolöründeki hassas bilgisayarı açın.Ardından amplifikatörü açın ve ses ayarlayıcıyı tabanda 10'a ve tiz ayarlayıcıları sekize ayarlayın. GCaMP'yi heyecanlandırmak ve RFP'yi etiketlemek için LED ışık kaynağının 488 ve 560 nanometre ışıklarını açın. Işık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 ve 550 nanometre göstergelerini% 5'e ayarlayın, böylece LED ışığının yoğunluğu görüntüleme için uygundur.Aşağıdaki yazılım paketlerini ve pencereleri indirin ve yükleyin. Fare makro yazılımı, titreşim kontrolü yazılımı, izleme çalıştırma yazılımı ve veri analizi yazılımı. İzleme yazılımı dosyasına çift tıklayın, ardından pozlama süresini 0,033 saniyeye ayarlayın ve sorunsuz görüntü alımı sağlamak için ikişer ikişer ciltleyin.Çalıştır düğmesine tıklayın ve yazılımı stabilize etmek için beş dakika bekleyin. Görüntü alma için bilgileri girin. Örneğin, aralıksız 500 görüntü kaydetmek için toplam görüntü kutusuna 500, görüntüler kutusuna 500 ve aralıklar kutusuna sıfır girin.Alma düğmesini açtıktan sonra, görüntü bölme optiklerini kullanarak floresan görüntüsünü bölün, GCaMP kanalını yansıtın ve RFP kanalını CMOS kameranın iki yarısına etiketleyin. GCaMP'nin koordinatlarını kalibre edin ve RFP kanallarını etiketleyip ayarları kaydedin. Ardından dizini veri dosyasının çıktısını alacak şekilde ayarlayın ve alımı kapatın.Testi okuyun. fare imlecinin koordinatlara ve o dosyadaki programa göre kontrol edilmesi için fare makro sistemine sahip metin dosyası ve titreşim kontrolü için yazılım dosyasına çift tıklayın. Kaydı başlattıktan sonra uyarılana kadar bekleme süresinde fare imlecinin koordinatlarını ayarlayın, ardından titreşim kontrolü için yazılımdaki frekansı ve genlik değerlerini ayarlayın.Hem GCaMP'yi ifade eden hem de RFP'yi etiketleyen tek bir solucanı, inkübe edilmiş plakadan E coli OP50'nin çizildiği yeni bir NGM plakasına aktarın. NGM plakasını şeffaf yapışkan bant kullanarak akustik dönüştürücüye takın. Kalsiyum görüntüleme için, edinme düğmesini açın ve solucanı 2,5x büyütmede bulun.Görüş alanını piksel başına 2,6 mikron çözünürlüğe sahip 1,1 x 1,1 milimetre olarak ayarlayın. Parlak ışığı kapatın ve solucanın maksimum yoğunluk bölgesini etiket RFP görüntüsündeki görüş alanının ortasında tutmak için X Y aşamasının hareketini başlatan bir solucanın floresan noktasını izlemek için yönlendirme düğmesine tıklayın. Yoğunluk değerlerinin yaklaşık 1000 olduğundan emin olun.Değilse, ışık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 ve 550 nanometre göstergelerine ince ayar yapın. Fare imleci denetimine izin vermek için fare makro sistemindeki çalıştır düğmesine basın ve çıktı BMP dosyasının uygun şekilde oluşturulduğunu doğrulayın. Veri analizi için, masaüstünde bir klasör oluşturun ve buna Kalsiyum Görüntüleme" adını verin, ardından Kalsiyum Görüntüleme klasörünün içinde bir klasör oluşturun ve çıktı sonuç dosyaları için CI sonucu olarak adlandırın.Çift görünümlü görüntülemeye çift tıklayın. Veri analiz yazılımında MB dosyası yazılır ve BMP dosyasının bulunduğu klasördeki CI sonuç klasörüne dosya yollarını ekler. RFP etiketi görüntüsündeki maksimum yoğunluk bölgesinin değerini kullanan otomatik bir analiz başlatmak için shift tuşuna basın ve tuşları aynı anda döndürün.Son olarak, çıktı dosyalarının CI sonuç klasöründe uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin. Temsili analizde, GCaMP ve etiket RFP kanal verileri bir dizi görüntü olarak elde edilmiştir. Lokalize olmayan titreşim sistemi tarafından indüklenen Petri kabının yer değiştirmesi de ölçüldü.Yer değiştirme, titreşim kontrolü için yazılımdaki genlik değerini, ses ayarlayıcıyı ve amplifikatörünü ayarlayarak kontrol edilebilir. Oysa frekans, yazılımdaki frekans değeri ayarlanarak düzenlenebilir. AVA nöronlarının geçici bir kalsiyum yanıtı, 630 Hertz frekansına ve saniyede yaklaşık 4.5 mikrometrelik bir yer değiştirmeye sahip titreşimlerle stimülasyon üzerine gözlendi, bu da Ava nöronun, bir solucanın lokalize olmayan stimülasyona geri tepkisi sırasında aktive edildiğini gösterdi.Prosedürümüzde, sadece tek bir nöronu ölçebiliriz. Bununla birlikte, bu sistem, birden fazla nöronu ve hatta tüm beyni noninvaziv olarak ölçmek için biyometrik bir görüntüleme yöntemiyle de birleştirilebilir.

calcium-imaging-freely-behaving-caenorhabditis-elegans-with-well

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, genetik olarak kodlanmış floresan raportör proteinleri kullanarak Caenorhabditis elegans gibi davranan bireysel nöronlarda kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum seviyelerini nöronal aktivite ve yumurtlama sırasındaki davranış değişiklikleri ile ilişkilendirmek için solucan hareketinin görüntülenmesinde ve nöronlardan gelen raportör floresan oranlarının ölçülmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Caenorhabditis elegans'ta Yumurtlama Davranışını Düzenleyen Bireysel Nöronlarda Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans'ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta lokalize olmayan titreşimlerle kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, davranışsal nörobilim araştırmalarında sinirsel yanıtları invaziv olmayan şekilde incelemeyi sağlar.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet