İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

iPSC'den üretilen BMEC'ler, kan beyin bariyeri işlevini ve işlev bozukluğunu incelemek için yeni deneysel modeller sağlar. Bu protokolü, BMEC'lerin genişleme ve kriyoprezervasyondan sonra bariyer özelliklerini koruyup korumadığını incelemek için kullandık. Bu teknik, hastalığın patofizyolojisinde kan-beyin bariyeri bozulmasının rol oynadığı bozuklukları olan hastalardan hastalığa özgü BMEC'lerin oluşturulmasını sağlar.

İnsan iPSC'lerinden BMEC farklılaşmasını indüklemek için, hücreleri uygun hacimde enzimatik EDTA ile 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe etmeden önce birleşik iPSC kültürünü DPBS ile bir kez yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde edildiğinde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, sayım için 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş uygun bir kök hücre ortamı hacminde yeniden süspanse edin. Hücreleri santimetreküp konsantrasyon başına 1.56 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin ve iki mililitre hücreyi altı kuyucuklu düz bir tabanın ayrı kuyularına ekin.

Hücre kültürü inkübatöründe 24 saat sonra, her bir oyuktaki süpernatanı E6 ortamı ile değiştirin ve plakayı dört gün daha inkübatöre geri koyun. iPSC'den türetilmiş BMEC'leri saflaştırmak için, alt kültür plakalarını oyuk başına uygun hacimde taze hazırlanmış bir kollajen IV ve fibronektin çözeltisi ile kaplayın ve plakaları 37 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Farklılaşmanın altıncı gününde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri B27, bazik fibroblast büyüme faktörü ve retinoik asit ile desteklenmiş uygun hacimde taze insan endotel serumu içermeyen ortamda yeniden süspanse edin.

TEER analizi için, farklılaşmış hücreleri, kollajen ve fibronektin kaplı 12-transwell filtrelenmiş bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin. Akış taşıyıcı aktivite analizi için, hücreleri bir kollajen ve fibronektin kaplı 24 oyuklu düz tabanlı plakanın her bir oyuğuna yerleştirin. 24 saatlik alt kültürden sonra, her bir oyuktaki süpernatanı, yalnızca B27 takviyesi ile takviye edilmiş taze insan endotelyal serumsuz ortamla değiştirin.

TEER kullanarak BMEC'lerin kan beyin bariyeri özelliklerini ölçmek için, TEER cihazını gece boyunca şarj edin ve cihazı ve çubuk elektrotlarını güvenlik başlığına yerleştirmeden önce %70 etanol ile hafifçe silin. Gücü açın ve ohm metreyi üreticinin teknik özelliklerine göre kalibre edin. Elektrotları prize takın ve bir kez %70 etanol ile ve bir kez DPBS ile durulayın.

Elektrotun kısa ucunu ekin atipik odasına ve uzun ucunu boş bir kuyunun bazolateral odasına yerleştirin. Negatif kontrol yanıtını ölçtükten sonra, elektrotları gösterildiği gibi hızlı bir şekilde durulayın ve ilk deneysel kuyuyu ölçün. Tüm ölçümler kaydedildikten sonra, çubuk elektrotlarını tekrar durulayın, elektrotları nazikçe silin ve güvenlik başlığında kurumaya bırakın.

Hücrelerin akış taşıyıcı aktivitesini değerlendirmek için, kültürün sekizinci gününde uygun sayıda kuyucuğu 10 mikromolar akış taşıyıcı inhibitör çözeltisi ile tedavi edin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücrelere inkübatörde bir saat boyunca 10 mikromolar akış taşıyıcı substrat çözeltisi uygulayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri oyuk başına% 5 Triton-X ile desteklenmiş 500 mikrolitre DPBS ile parçalamadan önce her bir kuyucuğu kuyu başına 500 mikrolitre DPBS ile iki kez yıkayın.

Beş dakika sonra, 485 nanometre uyarma ve 530 nanometre emisyonda parçalanmış hücrelerin floresansını ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Taşıyıcı tahlilinde kullanılmayan kuyucuklar için, hücre çekirdeği miktar tayini başına %4 paraformaldehit ile sabitlemeden önce hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. E6 ortamında bir günlük kültürden sonra, hücre morfolojisi iPSC'lerinkine benzer.

Dördüncü günde, hücreler iPSC'lerden gözle görülür şekilde farklıdır ve kuyunun çoğunu kaplar. İnsan endotelyal serumsuz ortamda iki günlük kültür, hücrelerde uzun ve parke taşı görünümüne neden olur. Sekizinci günde, tek tek hücreler çoğunlukla büyük bir parke taşı deseni oluşturur.

iPSC'den türetilmiş BMEC'lerin anjiyojenik potansiyelini göstermek için bir filizlenme testi yapılabilir. Bu, üç günlük büyüme faktörü tedavisinden sonra tüp benzeri yapıların gelişmesine yol açar. Bu protokol kullanılarak üretilen iPSC'den türetilmiş BMEC'ler, beyin, akciğer, karaciğer ve böbrekteki endotel hücrelerinde eksprese edilen sıkı bağlantı proteinlerinin yanı sıra kan beyin bariyerinde eksprese edilen vasküler endotel belirteçlerini birlikte eksprese etti.

Gözlendiği gibi, alt kültür ve ortam değişiminden 48 saat sonra iPSC'den türetilen BMEC'ler, sıçan primer astrositleri ile birlikte kültürlenen iPSC'den türetilmiş BMEC'ler için açıklanan aralıkta TEER değerlerini gösterir. Bu aşamada akış taşıyıcı aktivitesi de gözlendi. Kriyoprezervasyondan sonra, TEER ölçümleri yeni türetilmiş BMEC'lere kıyasla daha düşüktür.

Western blot analizi, okkludin gibi sıkı bağlantı belirteçlerinin azalmış seviyelerini ortaya çıkarırken, immünositokimya, sıkı bağlantı proteinlerinin çilli ve/veya yıpranmış modellerini gösterir. Çok yüksek veya çok düşük bir iPSC yoğunluğu, farklılaşma verimliliğini etkileyecek ve uygun kan beyin bariyeri özelliklerinin gelişimini etkileyecektir. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri fonksiyonunun fizyolojisini ve patofizyolojisini modellemek için bireyselleştirilmiş BMEC'ler kullanılarak bariyer özelliklerinin, hücresel sinyallemenin ve taşıyıcı aktivitenin araştırılmasını sağlar.