Name: Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosanın Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Keşfedin, kistik fibrozis hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa ve Psl ekzopolisakkaridinin görüntülenmesi için doku temizleme ve floresan in situ hibridizasyon yöntemlerini. Bu teknik, bakteriyel davranışları ve antimikrobiyal duyarlılığı anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu araştırma için fon sağlayan Kistik Fibrozis Vakfı'na ve cömert anti-Psl0096 antikor bağışları için MedImmuno'ya teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma için görüntüleme, Toronto Üniversitesi'ndeki CAMiLoD görüntüleme tesisinde gerçekleştirildi.

İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve saklanması için Araştırma Etik Kurulu (REB) onayı gereklidir. Burada sunulan çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.
1. Balgam Toplama
<ol><li>Balgam söktürücü balgamı steril bir toplama kabında saklayın ve fiksasyondan hemen önce en fazla 24 saat 4 °C'de saklayın. NOT: Balgamı fiksasyon olmadan 4 ° C'de çok uzun süre bırakmak, hücresel bozulmaya, özellikle beyaz kan hücrelerinin bozulmasına neden olabilir. Mümkün olan en kısa sürede sabitleme tercih edilir.</li>
	<li>Balgam örneklerini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Balgam örneklerine eşit hacimde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Örneğin, balgam örneği 0.5 mL ise, 0.5 mL %4 PFA ekleyin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.</li>
	<li>Balgamı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Her 2 mL sabit balgama 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek numuneyi yıkayın. NOT: Bu yıkama adımı için santrifüj gerekmez.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın. NOT: Ucu balgamdan uzağa doğrultarak balgamı pipetle emmekten kaçının ve yüzeydeki sıvıyı çok yavaş bir şekilde aspire edin. Yıkama adımı, balgam tıkaçlarının yapısal bütünlüğünü bozmamak için santrifüj içermez.</li>
	<li>1.6-1.7 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Pelet, %0,01 (a/h) sodyum azid ile PBS hacminin 2 katı kadar yeniden süspanse edilir.</li>
	<li>Balgamı 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Balgamın MiPACT (doku temizleme tekniği) işlenmesi
<ol><li>Hidrojel bileşenlerini (%30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid, sertleştirici ve PBS) 72 saat önce anaerobik bir paket içeren kapalı bir kapta gazdan arındırın. NOT: Anaerobik paket ve kapalı kap gereklidir çünkü oksijen akrilamid polimerizasyonunu inhibe eder. Alternatif olarak, bu adım anaerobik bir başlıkta gerçekleştirilerek, kapalı bir kaba vakum uygulanarak veyaN2 gazının akrilamid karışımından köpürtülmesiyle oksijen çıkarılabilir.<ol><li>Kapalı anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olacak şekilde 15 mL'lik bir tüpe 2 mL %30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpte 5 mL PBS'ye 0,5 g sertleştirici ekleyerek konsantre bir %10 (a/h) sertleştirici stoğu yapın. Kapağı tüpün dışında bırakın ve kapalı anaerobik kapta saklayın.</li>
		<li>Anaerobik kabın içinde, kapağı kapalı olarak bir tüpte birkaç mL steril PBS bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>15 mL'lik bir tüpte PBS'de nihai konsantrasyonu %0.2 sertleştirici ve %4 29:1 akrilamid olan 5 mL hidrojel çözeltisi yapın. Ters çevirerek karıştırın ve filtre sterilize edin.</li>
	<li>Balgam örneklerini buzdolabından çıkarın, ardından steril koşullar altında bir neşter ile küçük bölümler halinde (kabaca 5 mm çapında) kesin. NOT: Balgam oldukça akışkansa, bu adım yine de gerçekleştirilebilir, ancak istenen fraksiyonları ayırmak için neşteri kullanmadan önce balgamı cımbızla saklama solüsyonundan çıkarmak daha fazla sabır ve pratik gerektirir.</li>
	<li>Kesilen balgam örneklerini 8 odacıklı bir kapak camı slaytının kuyusuna yerleştirin.</li>
	<li>Balgam içeren kuyucukların her birine adım 2.2'den 300 μL filtre sterilize hidrojel çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>8 odacıklı kapak camını anaerobik paket içeren kapalı bir kabın içine 37 °C'de 3 saat yerleştirin. NOT: Gömülü balgam ile hidrojel polimerize edildikten sonra sert jel kıvamında olmalıdır.</li>
	<li>Katılaşmış hidrojel balgam numunelerini 5 mL %8 sodyum dodesil sülfat (SDS), pH 8 içeren 15 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın ve numunelerin 37 °C'de (çalkalayarak veya çalkalanmadan) 3-14 gün boyunca balgam şeffaf hale gelene kadar temizlenmesine izin verin. NOT: Temizleme süreleri balgam bileşimine bağlıdır ve genellikle çalkalama ile azaltılabilir. Ancak çalkalama hızını numune bütünlüğünü bozacak kadar artırmamaya özen gösterin. DNA açısından zengin örneklerin temizlenmesi, mukus açısından zengin örneklere kıyasla daha uzun sürer.</li>
	<li>%8 SDS çözeltisini bir atık toplama kabına boşaltın. Steril cımbız kullanarak, hidrojel gömülü her numuneyi steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hidrojelleri yıkamak için 50 mL'lik konik tüplerin her birine 10 mL PBS ekleyin ve çözeltiyi boşaltmadan önce 30 dakika ila 1 saat bekletin. Bunu 2 kat daha tekrarlayın. NOT: Bu yıkama adımı santrifüj içermez. Fazla sıvı ve süpernatant bir pipetle dikkatlice çıkarılır.</li>
	<li>Yıkanmış numuneleri 4 °C'de %0,01 (a/h) sodyum azid ve 1x RNaz inhibitörü ile PBS'de saklayın.</li>
</ol>3. Hidrojel floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü
<ol><li>Hidrojel numunelerini steril cımbız kullanarak saklama solüsyonlarından çıkarın ve numuneleri steril bir yüzeye (cam slayt veya Petri kabı gibi) yerleştirin.</li>
	<li>Steril bir neşter kullanarak hidrojelleri ~ 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin.</li>
	<li>Hidrojelin 1 mm'lik bölümlerini steril 1,5 mL'lik tüplerin içine yerleştirin.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL hibridizasyon tamponu (%25 formamid, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], %0.01 SDS, saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) hazırlayın.</li>
	<li>Floresan etiketli PseaerA probunu (150.7 nM12) hibridizasyon tamponuna ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. NOT: Formalin çözeltisi açık alevden uzak tutulmalıdır. Hibridizasyon tamponu önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir13.</li>
	<li>Hidrojelin her ~1 mm'lik bölümüne 200-500 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hidrojel numunesinin tamamının suya daldırıldığından emin olun.</li>
	<li>PseaerA probunun hidrojel numunelerini ~ 18-24 saat, 46 °C'de çalkalamadan karanlıkta bırakarak hibridize olmasına izin verin.</li>
	<li>Hibridizasyon tamponunu bir atık toplama kabına boşaltın.</li>
	<li>1,5 mL'lik tüplerin her birine 1 mL yıkama tamponu ekleyerek numuneleri filtreyle sterilize edilmiş yıkama tamponu (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) [pH 7,2], %0,01 SDS ve saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) ile bir kez durulayın ve ardından çıkarın. NOT: Yıkama tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.</li>
	<li>Tüplere 1 mL taze yıkama tamponu ekleyin, ardından numuneleri karanlıkta 48 °C'de 6 saat çalkalamadan inkübe edin.</li>
</ol>4. Hidrojel ve Psl0096 antikor bağlanması
<ol><li>Yıkama tamponunu 1 mL'lik bir pipetleyici kullanarak steril olarak çıkarın.</li>
	<li>%2 BSA çözeltisinden 1 mL ekleyip çıkararak numuneleri PBS çözeltisinde %2 BSA (a/h) ile durulayın.</li>
	<li>Spesifik olmayan protein bağlanmasını bloke etmek için hidrojel numunelerine 500 μL %2 BSA/PBS çözeltisi ekleyin. Daha sonra numuneleri gece boyunca, karanlıkta, RT'de çalkalamadan inkübe edin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak bloke edici solüsyonu steril olarak çıkarın.</li>
	<li>Antikoru 500 μL taze %2 BSA/PBS içinde 0.112 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyrelterek Psl0096-Texas Red antikor çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>500 μL'lik antikor çözeltisini hidrojel örneklerine ekleyin ve bunları RT'de 6 saat boyunca ışıktan korunarak, çalkalamadan inkübe edin.</li>
</ol>5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol) boyama
<ol><li>Manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişeye 40 g iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı, 30 μL Tween20, 3 μg sodyum azid ve 30 mL PBS ekleyerek kırılma indisi eşleştirme çözeltisini (RIMS) hazırlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika veya tamamen eriyene kadar karıştırın.</li>
	<li>Filtre, 10 mL'lik bir şırınga ve steril 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi 50 mL'lik bir konik tüpe sterilize eder. NOT: Çözelti 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
	<li>Psl0096-Texas Red antikor solüsyonunu steril 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Hidrojel örneklerini 1 mL PBS ekleyip çıkararak durulayın.</li>
	<li>Hidrojel numunelerini 250 μL RIMS çözeltisi ve 10 μg/mL DAPI ile RT'de gece boyunca karanlıkta hafifçe çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Konfokal görüntülemeden önce, numuneleri 0,9 mm veya 1,7 mm perfüzyon odalarına monte edin ve bir cam lamel ile kapatın. NOT: FISH ve/veya immünohistokimyadan sonra ve RIMS'e daldırılmadan önce, balgam mukozasının görüntülenmesi isteniyorsa floresan lektin boyaları uygulanabilir12.</li>
</ol>6. Görüntüleme
<ol><li>25x, 40x, 63x veya 100x büyütmelerde standart teknikleri kullanarak konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
<li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).</li>
<li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).</li>
<li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides%2C+alginate%2C+Pel%2C+and+Psl%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li>
<li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding%2C+clearing%2C+and+rRNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.molecularinstruments.com">www.molecularinstruments.com</a> 1-6 (2019).</li>
<li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li>
<li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum%3A+Time+from+expectoration+to+processing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li>
<li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li>
<li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens%3A+An+immunocytochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li>
<li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li>
<li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290(2005).</li>
<li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li>
<li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234(2019).</li>
</ol>

Bu protokolün amacı, KF hastalarından balgamda P. aeruginosa hücrelerinin in-situ organizasyonuna bir bakış sağlamaktır. Balgam örnekleri, hemen sabitlenemiyorlarsa işlenene kadar 4 °C'de saklanmalıdır. Balgamdaki P. aeruginosa hücre sayılarının, 4 °C'de saklandığında 1 saat, 24 saat veya 48 saatte işlenirse önemli ölçüde değişmediği, ancak 24 veya 48 saat boyunca 25 °C'de bırakılırsa, bakteri büyümesinin bir sonucu olarak bakteri hücre sayılarının önemli ölçüde artacağı gösterilmiştir...

Bu çalışmada, pediatrik kistik fibrozis (KF) hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın in vivo yapısını görselleştirmek için deneyler tasarlanmıştır. P. aeruginosa enfeksiyonları pediatrik KF popülasyonunun% 30-40'ında kronikleşir; Kronik enfeksiyonlar bir kez yerleştikten sonra, ortadan kaldırılması neredeyse imkansızdır1. Erken enfeksiyonu olan hastalardan P. aeruginosa izolatları genellikle antimikrobiyallere daha duyarlıdır, bu nedenle bunlar kronik enfeksiyonun oluşmasını önlemek için anti-psödomonal antibiyotiklerle tedavi edilir2. Ne yazık ki, tüm P. aeruginosa izolatları antibiyotik tedavisini takiben akciğerden etkili bir şekilde temizlenmez. Antibiyotik yetmezliği ile ilişkili kesin mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm hücre yoğunluğu, agregasyonu ve polisakkarit üretimindeki değişikliklerin antibiyotik etkinliğini etkileyebileceğini göstermiştir3. P. aeruginosa üç hücre dışı polisakkarit üretir: Pel, Psl ve aljinat4. P. aeruginosa'nın çoğu suşu, ekzopolisakkaritlerin her birini eksprese etmek için genetik kapasiteye sahiptir, ancak genellikle bir tür polisakkarit ağırlıklı olarak5 eksprese edilir. Ekzopolisakkarit aljinat, KF akciğerindeki kronik enfeksiyonlarla ilişkilidir ve bu da mukoid fenotip 6,7 ile sonuçlanır. Polisakkaritler Pel ve Psl, ilk bağlanmaya ve biyofilm yapısının korunmasına yardımcı olmak ve antibiyotik direnci kazandırmak dahil olmak üzere birçok işleve sahiptir8.
Dokuların in vivo yapılarını görselleştirmeyi amaçlayan yöntemler, çeşitli numune tipleri için geliştirilmiştir 9,10,11. Daha yakın zamanlarda, KF hastalarından balgam içindeki in vivo mikrobiyal toplulukları görselleştirmek için uyarlanmışlardır12. Özellikle balgam içindeki mikrobiyal toplulukların tanımlanması için bir doku temizleme protokolünün optimizasyonu DePas ve ark., 201612 tarafından geliştirilmiştir. Passive CLARITY technique'den sonra microbial iidentification anlamına gelen MiPACT terimi, CF balgam11,12'nin temizlenmesi için icat edildi. Doku temizleme teknikleri için, örnekler önce sabitlenir, daha sonra boyama ve mikroskobik görselleştirme için doğal mimarileri bozulmadan bırakılırken şeffaf hale getirilir11. KF balgam örneklerinin sabitlenmesi ve temizlenmesi, araştırmacıların biyofilm yapısı, bakteriyel hücre yoğunluğu, polimikrobiyal ilişkiler ve patojenler ile konakçı hücreler arasındaki ilişkiler ile ilgili soruları yanıtlamasına olanak tanır. Balgam içinde korunmuş bakterileri doğrudan incelemenin avantajı, konakçıya özgü bir bağlamda analiz edilebilmeleri ve görselleştirilebilmeleridir. Deney için laboratuvarda klinik izolatların in vitro büyümesi çok bilgilendirici olabilse de, bu tür yöntemler KF akciğer ortamını tam olarak yeniden oluşturamaz ve bu da laboratuvar sonuçları ile hasta sonuçları arasında bir kopukluğa neden olur.
Burada sunulan yöntemler, KF hastalarından veya diğer solunum yolu enfeksiyonları olan hastalardan bakterileri görselleştirmek için balgamı sabitlemek ve temizlemek için kullanılabilir. Burada tarif edilen spesifik boyama ve mikroskobik analiz türü, floresan in situ hibridizasyon (FISH), ardından hidrojel içinde anti-Psl-antikor bağlanması ve ardından konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla analizdir. Doku temizliğini takiben diğer immünohistokimya ve mikroskopi yöntemleri de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>29:1 akrilamid bisakrilamid, %30 çözelti</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8 Odacıklı Kapak Camı Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfüzyon odaları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>RNA Rnaz İnhibitörü Sigma</td><td></td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Sipariş Detayları: Ürün: Modifiye DNA Oligo; İsim: PseaerA; Sıra: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Sentez: 50 nmol; Arıtma: HPLC; Gemi durumu: Tam verim (kuru)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Psl0096-Texas kırmızı antikorları, Medimmune tarafından nazikçe sağlanan bir hediyeydi ve sipariş sorguları için şirketle iletişime geçilmelidir.</td></tr><tr><td>VA-044 Sertleştirici</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

kistik fibrozis hastalarının balgamında pseudomonas aeruginosa'nın görüntülenmesi

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde Pseudomonas aeruginosa'nın erken tespiti ve eradikasyonu, kronik enfeksiyon gelişme şansını azaltabilir. Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlarının gelişimi, akciğer fonksiyonlarında azalma ve artmış morbidite ile ilişkilidir. Bu nedenle, pediatrik hastaların yaklaşık %10-40'ında görülen antibiyotik tedavisi ile P. aeruginosa'nın eradike edilememesinin nedenlerinin aydınlatılmasına büyük ilgi vardır. P. aeruginosa'nın konakçı klirensini ve antibiyotik duyarlılığını etkileyebilecek birçok faktörden biri, mekansal organizasyondaki (agregasyon veya biyofilm oluşumu gibi) ve polisakkarit üretimindeki farklılıklardır. Bu nedenle, KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın in situ özelliklerini görselleştirmek istedik. Balgam örneklerine, konakçı hücrelere göre 3 boyutlu yapıları korumak için örnekleri bir hidrojel matrisine gömdükten sonra bir doku temizleme tekniği uygulandı. Doku temizlendikten sonra, görselleştirmeye izin vermek için floresan etiketler ve boyalar eklendi. Bakteri hücrelerinin görselleştirilmesi için floresan in situ hibridizasyon, ekzopolisakkaritin görselleştirilmesi için floresan etiketli anti-Psl-antikorlarının bağlanması ve yapısal içgörü elde etmek için konakçı hücreleri boyamak için DAPI boyama gerçekleştirildi. Bu yöntemler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verdi.

Deneyin genel tasarımı Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Şekil 1 , balgam işleme ve balgam temizleme protokollerinin bir özetini sağlar. Balgam işleme ve temizleme 17 güne kadar sürebilir. Bununla birlikte, protokol durdurulabilir ve numuneler PFA ile fiksasyondan sonra (2. gün) veya doku temizliğinden sonra (temizleme süresine bağlı olarak 5-17. günler) saklanabilir. Şekil 2'de FISH ve antikor bağla...

Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.

Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın Görüntülenmesi

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Bu protokol önemlidir çünkü kistik fibrozis balgam içinde Pseudomonas aeruginosa ve ekzopolisakkarit Psl'nin doğrudan görüntülenmesine izin verir. Bu teknik, P.aeruginosa'nın agregasyon veya biyofilmler gibi mekansal organizasyonunun konakçı klerensini ve antimikrobiyal duyarlılığı nasıl etkilediği hakkındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Balgam söktürücü balgamı, fiksasyondan en fazla 24 saat önce dört santigrat derecede steril bir toplama kabında saklayın.Numuneleri sabitlemeye hazır olduğunuzda, bunları 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın ve eşit hacimde% 4 PFA ekleyin, ardından balgamı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Her iki mililitre sabit balgam için beş mililitre PBS ekleyerek numuneleri yıkayın. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.Pelet% 0.01 sodyum azid ile PBS hacminin iki katı kadar yeniden süspanse edin ve dört santigrat derecede saklayın. Kapalı bir anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olacak şekilde üç mililitrelik bir tüpe bir akrilamid/bisakrilamid çözeltisine iki mililitre %3029 ekleyin, ardından üç mililitrelik bir tüpte iki mililitre PBS'ye 0.5 gram sertleştirici ekleyin. Kapağı tüpün dışında bırakın ve kapalı anaerobik kapta saklayın.Anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olarak tüpte birkaç mililitre steril PBS bırakın. Hidrojel bileşenlerini kapalı kapta anaerobik bir paketle 72 saat boyunca gazdan arındırın. 15 mililitrelik bir tüpte PBS'de nihai konsantrasyonda %0,2 sertleştirici ve %4 akrilamid / bisakrilamid olan 2,5 mililitrelik bir hidrojel çözeltisi yapın ve hidrojeli ters çevirerek karıştırın, ardından çözeltiyi filtreyle sterilize edin.Balgam örneklerini bir neşter ile iki küçük bölüme kesin, ardından her bir örneği sekiz odacıklı kapalı bir cam slayttan oluşan bir kuyuya yerleştirin. Balgam içeren her bir oyuğa 300 mikrolitre filtre sterilize hidrojel çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede üç saat boyunca anaerobik bir paket ile kapalı bir kabın içine yerleştirin. Katılaşmış hidrojel balgam numunelerini, pH sekizde beş mililitre% 8 SDS içeren 15 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın ve numunelerin balgam şeffaf hale gelene kadar 37 santigrat derecede üç ila 14 gün boyunca temizlenmesine izin verin.Her bir hidrojel gömülü numuneyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için steril cımbız kullanın ve hidrojeli yıkamak için 10 mililitre PBS ekleyin. Boşaltmadan önce çözeltiyi 30 ila 60 dakika bekletin, ardından yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Yıkanmış numuneleri %0.01 sodyum azid ve RNaz inhibitörü içeren PBS'de dört santigrat derecede saklayın.Hidrojel numunelerini saklama solüsyonlarından çıkarın ve numuneleri steril bir yüzeye yerleştirin. Hidrojelleri yaklaşık bir milimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için steril bir neşter kullanın ve bölümleri 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. 1.5 mililitrelik bir tüpte bir mililitre hibridizasyon tamponu hazırlayın, ardından floresan etiketli Seer A-probunu ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.Her bölüme 200 ila 500 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve hidrojel numunesinin tamamının suya batırıldığından emin olun. Seer A-probunun hidrojel numuneleri ile 46 santigrat derecede yaklaşık 18 ila 24 saat karanlıkta sallanmadan yerleştirerek hibritleşmesine izin verin, ardından tüplere bir mililitre taze yıkama tamponu ekleyin ve karanlıkta altı saat boyunca 48 santigrat derecede inkübe edin. Spesifik olmayan protein bağlanmasını engellemek için hidrojel numunelerine 500 mikrolitre %2 BSA ve PBS ekleyin, ardından numuneleri gece boyunca karanlıkta inkübe edin.Ertesi gün, antikoru PBS'de 500 mikrolitre taze% 2 BSA içinde mililitre başına 0.112 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyrelterek Psl0096-Texas Red antikor çözeltisini hazırlayın. Antikor çözeltisini hidrojel örneklerine ekleyin ve karanlıkta altı saat inkübe edin. Daha sonra, hidrojel örneklerini 250 mikrolitre RIM çözeltisi ve mililitre başına 10 mikrogram DAPI ile gece boyunca hafifçe çalkalayarak DAPI ile boyayın.Boyamadan sonra, numuneleri 0,9 veya 1,7 milimetre perfüzyon odalarına monte edin ve bir cam lamel ile kapatın. 25, 40, 63 veya 100 kat büyütme ile konfokal lazer tarama mikroskobu gerçekleştirin. Bu protokol, balgam içindeki P.aeruginosa hücrelerinin ve NC2 yapılarının yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerini elde etmek için kullanıldı.Bir balgam örneği içindeki hücrelerin bir toplamı burada gösterilmiştir. Seer A-488 sondasının P.aeruginosa hücrelerine türe özgü bağlanmasından itibaren bireysel çubuk şekilleri yeşil renkte görüldü. Psl0096-Texas Red antikoru, balgam içindeki Pseudomonal ekzopolisakkaritin çoğunlukla P.aeruginosa hücreleri ile örtüştüğünü göstermektedir.Bu yöntem aynı zamanda balgam içindeki Pseudomonal hücrelerin diğer bakteri hücreleri ve konakçı yapılarla ilişkili olarak görselleştirilmesi için de kullanılmıştır. P.aeruginosa hücrelerinden oluşan bir kümenin ökaryotik bir hücre içinde fagositoz olduğu görülürken, civarda diğer küçük kokal hücre kümeleri gözlendi. PSL 0096 antikorunun planktonik P.Aeruginosa'dan üretilen PSL'ye bağlanabileceği de gösterildi.Bu tekniğin temel avantajı, floresan in situ hibridizasyon, antikor boyama ve konfokal mikroskopi ile takip edilen bir doku temizleme yaklaşımı uygulamasıdır. Bu, araştırmacıların, hasta sağlığı sonuçlarıyla ilişkili olarak KF balgamı içindeki P.aeruginosa kolonizasyon yapılarındaki farklılıkları nicel olarak ölçmek için görüntü işleme tekniklerini görselleştirmelerini ve kullanmalarını sağlar.

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Kaynak: Beaudoin, T. ve diğerleri. Balgamın biyofilm gelişimi üzerindeki etkilerini odalı bir örtü cam modeli kullanarak görselleştirmek. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, hastadan kaynaklı kistik fibroz balgamının bakteriyel biyofilm oluşumunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için in vitro bir yöntemi göstermektedir. Oda slaytları, floresan boyama ve konfokal mikroskopi kullanılarak, balgamla yetiştirilen biyofilmlerde kalınlığın arttığını, mimarinin değiştiğini ve daha yüksek canlı biyokütleyi...

Kistik Fibroz Hastalarından Balgam Filtratları Tarafından İndüklenen Bakteriyel Biyofilmlerin Konfokal Görüntülemesi

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

Bu protokol, bir slayt odası modeli kullanılarak konak faktörlerine maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişiminin görselleştirilmesini açıklar. Bu model, biyofilm gelişiminin doğrudan görselleştirilmesinin yanı sıra bilgisayar yazılım programları kullanılarak biyofilm parametrelerinin analizine olanak tanır.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Bu iş akışı, kistik fibrozisli bireylerin akciğerlerinde bakteriyel biyofilm için yerleşik bir ex vivo modeli kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi yapmak için kullanılabilir. Bu modelin kullanımı MBEC (minimal biyofilm eradikasyon konsantrasyonu) testlerinin klinik geçerliliğini artırabilir.

Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Buradaki protokol, slayt yapımı, boyama ve yorumlama olmak üzere üç adımdan oluşan hızlı ve standartlaştırılmış bir mikrobiyolojik hızlı yerinde değerlendirme (M-ROSE) iş akışını göstermektedir. Bu protokol hekimlerin hızlı klinik kararlar almasına yardımcı olacaktır.

Pulmoner Enfeksiyon Hastalıklarında Mikrobiyolojik Hızlı Yerinde Değerlendirme

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Keşfedin, kistik fibrozis hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa ve Psl ekzopolisakkaridinin görüntülenmesi için doku temizleme ve floresan in situ hibridizasyon yöntemlerini. Bu teknik, bakteriyel davranışları ve antimikrobiyal duyarlılığı anlamanıza yardımcı olur.

Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet