Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi Kullanarak CALR Geninde Genetik Varyant Tespiti

Bu yöntem, hematolojik durum şüphesi olan hastalarda, özellikle diğer tanı seçeneklerinin sınırlı olduğu veya hematolojik olmayan durumlarla örtüştüğü durumlarda, kalretikülin mutasyonlarını doğru bir şekilde tanımlar. Yüksek çözünürlüklü ayna tekniğinin temel avantajı, kalretikülin geninin sıcak nokta bölgesindeki yaygın somatik genetik varyantların kabul edilebilir tespit sınırında ve uygun maliyette tespit edilmesidir. Bu teknik, miyeloproliferatif bozuklukların, özellikle esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozun hızlı ve noninvaziv tanısını sağlar.

Şu anda bu hastalarda tedavi seçimi üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Ancak, bu gelecekte değişebilir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi qPCR HRM ana karışımını hazırlayarak başlayın, her bir DNA örneğinin ve kontrolünün üç kopyası için yeterli hale getirin.

Tüpü hafifçe vurarak ve ters çevirerek ve iki ila üç saniye boyunca girdap yaparak reaksiyon içeriğini karıştırın, ardından saçılan damlacıkları toplamak için tüpü kısaca döndürün. 19 mikrolitre qPCR HRM ana karışımını 96 Kuyulu Optik Reaksiyon Plakasının her bir oyuğuna aktarın. Negatif kontrollerin, pozitif kontrollerin ve numunelerin bir mikrolitresini, bir mikrolitre steril RNA ve DNA yerine qPCR HRM ana karışımını hazırlamak için kullanılan DNA'nın serbest suyunda şablon kontrolü veya NTC için plakanın uygun kuyularına pipetleyin.

Çalışma sırasında buharlaşmayı önlemek için reaksiyon plakasını optik yapışkan filmle sıkıca kapatın. Daha sonra oda sıcaklığında bir dakika boyunca 780 kez G'de döndürün. Sıvının reaksiyon plakasındaki kuyucukların dibinde olduğunu kontrol edin ve testi çalıştırın.

Kontrolleri ve numuneleri cihaz sistemi yazılımındaki uygun kuyulara atayın ve varsayılan cihaz amplifikasyon protokolünü değiştirin. qPCR'den hemen sonra ayrışma analizini gerçekleştirmek için cihazı metin metninde açıklandığı gibi programlayın. Çalışma sona erdiğinde, amplifikasyon grafiğini gözden geçirin ve doğrulayın.

Enstrüman sistemi yazılımının deney menüsünde amplifikasyon grafiği seçeneğini seçin. Hiçbir veri görüntülenmezse, yeşil analiz düğmesine tıklayın. Çizim türü açılır menüsünden Amplifikasyon Grafiği sekmesinde, döngü numarasının bir fonksiyonu olarak pasif referanstan floresana normalize edilmiş floresan okumaları olarak amplifikasyon verilerini görüntüleyen grafiği seçin, Çizim rengi açılır menüsünde örneği seçin.

Grafik türü açılır menüsünden, doğrusal amplifikasyon grafiği türünü seçin, temel başlangıç ve bitiş döngüsünün doğru ayarlandığını doğrulayın. Bitiş döngüsü, önemli bir floresan sinyalinin algılandığı döngü numarasından birkaç döngü önce ayarlanmalıdır. Grafik türü açılır menüsünden, eşik seçeneğini seçerek grafikte eşik çizgisini gösteren günlük 10 amplifikasyon grafiği türünü seçin ve eşiği ayarlayın.

Eşik çizgisi, qPCR eğrilerinde üstel fazı geçmelidir. Tüm numune ve pozitif kontrol Kuyularının normal amplifikasyon eğrilerine sahip olduğunu ve NTC Kuyularında amplifikasyon olmadığını doğrulayın. Normal bir amplifikasyon grafiği, 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan çiçeklenmede üstel bir artış gösterir.

Türev eriyik eğrilerinde, erime öncesi ve sonrası bölgeleri veya sıcaklık çizgilerini gözden geçirin. Erime öncesi ve sonrası bölgeler, floresan seviyelerinde büyük zirvelerin veya eğimlerin olmadığı düz bir alan içinde olmalıdır. Gerekirse, erime öncesi ve sonrası sıcaklık çizgilerinin başlangıç ve durmasını birbirinden yaklaşık 0,5 santigrat derece olacak şekilde ayarlayın.

Analiz düğmesine tıklanarak parametreler ayarlanmışsa analizi yeniden başlatın. Fark potu sekmesinin çizim ayarları sekmesinde, referans DNA olarak vahşi tip kontrol replikalarından birini seçin ve analiz düğmesine tıklayarak analizi yeniden başlatın. Hizalanmış Eriyik eğrileri sekmesinde, tüm pozitif kontrollerin doğru genotipe sahip olduğunu ve NTC'nin yükseltilemediğini onaylayın.

Kuyu tablosundan, analiz grafiklerinde karşılık gelen erime eğrisini vurgulamak için bir kontrol kuyusu seçin ve çizginin renginin doğru genotipe karşılık geldiğini onaylayın. Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, bilinmeyen örnekler için çizim ekranlarını dikkatlice inceleyin ve bunları kontroller için çizim ekranlarıyla karşılaştırın. Bilinmeyen numune replikalarını içeren Kuyuları seçin ve kontrolleri içeren kuyuları tek tek seçerek erime eğrilerini kontrollerle sıralı bir sırayla hizalayın.

Elde edilen sonuçların tutarlı olduğunu doğrulamak için Fark Grafiği sekmesindeki bilinmeyen örneğin sonucunu analiz edin. Bilinmeyen numune kopyalarını içeren kuyuları seçin ve eriyik eğrilerini kontrollerle sıralı bir sırayla hizalayın, kontrolleri içeren Kuyuları tek tek seçin. qPCR HRM ürünlerini, floresan nükleik asit suşu içeren %4 agaroz prekast jel üzerinde çalıştırın.

Yalnızca bir pozitif negatif NTC çalıştırın ve örnek qPCR HRM replikasyonlarını yapın. Prekast jeli ve kaseti paketten çıkarın, ardından tarağı çıkarın ve jeli üreticinin talimatlarına göre aparata yerleştirin. 10 mikrolitrelik bir numuneyi steril RNA ve DNA içermeyen su ile 20 mikrolitreye seyreltin ve her kuyucuğa 20 mikrolitre seyreltilmiş numune yükleyin.

Üç mikrolitre DNA boyutunda standart çözeltiyi 20 mikrolitreye seyreltin ve işaretleyici kuyucuğuna yükleyin. Boş kuyuları 20 mikrolitre steril RNA ve DNA'nın serbest suyu ile doldurun. Çalıştırılan jelin yüzdesine göre programı hemen seçin ve aparat üzerindeki çalışma süresini 20 dakikaya ayarlayın.

Numuneleri yükledikten sonra bir dakika içinde elektroforezi başlatın. Elektroforez tamamlandığında, mavi ışık veya UV transillüminasyon kullanarak DNA'yı ve jeli görselleştirin. Ve 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan floresanlarda üstel bir artış ve tüm replikalarda ve kontrollerde niceleme döngüsünün çok dar değerleri ile ilgilenilen DNA bölgesinin başarılı bir şekilde amplifiye edilmesi, yüksek çözünürlüklü erime analizi ile genetik varyansın güvenilir bir şekilde tanımlanması için bir ön koşuldur.

HRM analizi, qPCR'den hemen sonra gerçekleştirilir, numunelerin aktif eriyik bölgeleri, kontroller ve NTC, hizalanmış eriyik eğrisi grafiklerini oluşturmak için kullanılır. Erime öncesi ve sonrası bölgelerin doğru şekilde ayarlanması, numunelerdeki genetik varyansın düzgün bir şekilde görselleştirilmesi ve tanımlanması için önemlidir. Hizalanmış eriyik eğrileri ve farklı kaplar burada gösterilmiştir.

Bilinmeyen numuneler, pozitif kontrollerden biri ile sıkıca hizalanır. Yanlış ayarlanmış erime öncesi ve sonrası bölgeler veya sıcaklık çizgileri, genetik varyansın doğru tanımlanmasının daha zor olduğu hizalanmış erime eğrileri ve farklı grafiklerle sonuçlanır. Numunedeki genetik varyant, numunenin bant modeli kontrollerle karşılaştırılarak tanımlanabilir.

Ve HRM ve agaroz jel elektroforezini birleştirerek. Doğru genetik varyant tanımlaması, yalnızca HRM testinde kullanılan kontrollerden biri ile aynı genetik varyantı içeren numuneler için yapılabilir. Nadir kalretikülin genetik varyantları içeren örnekler, HRM sonucu ve elektroforez bant paterni açısından farklılık gösterir.

Bu protokolü denerken, bilinen ve kontrol numunelerinin hizalanmış erime eğrisi grafiği ekranlarını dikkatli bir şekilde karşılaştırmak önemlidir.