Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili
15 Eylül 2020
Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.
Bu protokol önemlidir çünkü aktif ökaryotik translasyonun tek molekül analizi için mevcut hücresiz translasyon sistemlerinin kullanılmasını sağlar. Bu tekniğin ana avantajları, toplu translasyon özelliklerini koruması, tek molekül çözünürlüğü sağlaması ve diğer toplu translasyon tahlillerinden uyarlanmasının nispeten basit olmasıdır. Bu yöntem, toplu koşullar altında verimli büyük harfe bağımlı çeviriyi etkinleştirmek için doğrulanmış herhangi bir hücresiz çeviri sistemine uygulanabilir.
Prosedürü göstermek, bir araştırma görevlisi olan Hongyun Wang ve Xiaohui Qu laboratuvarından kıdemli bir araştırma bilimcisi olan Anthony Gaba olacak. Tek moleküllü bir deney yapmadan en az üç saat önce, deneyin aşırı akustik bozulmasını önlemek için mikroskop inkübatörünü açın ve hava akışını düşük bir hıza düşürün. Ardından inkübatör sıcaklığını, hücresiz çeviri sistemi için özel olan en uygun sıcaklığa ayarlayın.
Deneyden en az bir saat önce, lazer kutusunun arkasındaki lazer güç düğmesine basın, lazer güvenlik anahtarını çevirin ve lazeri açmak için başlat düğmesine basın. Mikroskobu açın ve görüntüleme modunu, objektifi ve filtre setini seçin. EMCCD kamerayı, sahne denetleyicisini, şırınga pompasını ve bilgisayarı açın ve kamerayı, lazeri, motorlu sahneyi ve şırınga pompası yazılımını açın.
Lazer kontrol yazılımında, lazer yoğunluğunu ayarlamak için bağlan'a tıklayın, deklanşör kutusunun işaretini kaldırın ve yoğunluk kaydırma çubuğunu lazer kontrolü açılır penceresinde sürüklemek için kontrole tıklayın. Lazeri istenen açıya ayarlamak için penetrasyon derinliğini girin ve görüntüleme yapılmadığında lazeri kapalı modda tutmak için deklanşör kutusunun kapalı olduğunu onaylayın. Kamera soğuduğunda ve belirlenen çalışma sıcaklığına sabitlendiğinde, kamera yazılımında çekim modu için kinetik seçin ve pozlama süresini, kinetik seri uzunluğunu ve elektron çarpma kazanç değeri parametrelerini girin.
Dizini seçin ve veri görüntü dosyasını kaydetmek için dosya adları atayın. Şırınga pompasını mütevazı ila hızlı bir akış hızına ayarlayın ve bir mikrofüj tüpüne 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyin. Şırınga pompası boru ucunu etanol çözeltisine yerleştirin ve şırınga pompasını çekme ve dağıtım modları arasında değiştirmek için şırınga pompası yazılımını kullanın, boruyu üç kez etanol ile ve üç kez RNaz içermeyen suyla yıkayın.
Son suyla yıkamadan sonra, borunun içindeki artık suyu çıkarmak için boru ucunu temiz bir mendil üzerine sürün ve borunun ucunu temiz bir mikrofüj tüpüne yerleştirin. Üç asal uçlu biyotinile mRNA immobilizasyonu için, akış odasını, lamel tarafı aşağı bakacak şekilde mikroskop numune tutucusuna yerleştirin ve odayı bantla sabitleyin. Kullanılmayan akış kanalı giriş ve çıkışlarını kapatmak için bandı kullanın ve akış kanalına mililitre streptavidin çözeltisi başına 200 mikrogram hacminin 1,5 katını ekleyin.
Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, yıkama başına üç kat daha fazla T50 yıkama tamponu ve katlanmış laboratuvar dokusu ile kanalı üç kez yıkayın ve silin. Son yıkamadan sonra, mikroskop objektifine bir damla daldırma yağı damlatın ve tutucuyu ve hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, objektif üzerindeki daldırma yağı lamel ile temas edene kadar objektifi lamel üzerine yaklaştırın ve numune aşamasını, akış kanalının konumu doğrudan objektif merceğinin üzerinde olacak şekilde hareket ettirin.
Mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında, odak sekmesini seçin ve odak aramaya tıklayın ve başlatın. Odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulacaktır. Kamera yazılımında canlı modu seçin.
Lazer kontrol yazılımında lazer deklanşörünü açın ve lazer yoğunluk seviyesini ayarlayın. Objektif konumunu ayarlamak için ince adım kontrolünü kullanarak gerçek zamanlı floresan görüntüsünü canlı modda ve mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında gözlemleyin. Kamera yazılımında, akış kanalı algılama yüzeyinin çeşitli alanlarındaki floresan arka plan seviyesini değerlendirmek için sahneyi hareket ettirin.
Floresan düşükse, canlı modu durdurun ve lazer kontrol yazılımındaki lazer deklanşörünü kapatın ve akış kanalındaki yıkama tamponunu biyotinile mRNA çözeltisinin hacminin iki katı ile değiştirin. 15 dakika sonra, yıkama başına üç kat daha fazla translasyon uyumlu tampon hacmiyle kanalı üç kez yıkayın. Tek molekül tespiti için, mRNA olmadan ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde optimize edilmiş bir floresan etiketli antikor konsantrasyonu ile desteklenmiş taze çözülmüş translasyon karışımının hacminin üç katını birleştirin ve karışımı tüpün dibinde toplamak için tüpü kısaca döndürün.
Translasyon karışımını 700 mikrolitrelik bir mikrofüj tüpü kapağının içine aktarın ve şırınga pompasını geri çekme moduna ayarlayın. Pompa borusu ucunu çeviri karışımına yerleştirin ve şırınga çekme işlemini başlatın. Çeviri karışımı pompa borusuna tamamen girdiğinde, çekme işlemini durdurun, şırınga pompası ayarlarını dağıtım moduna getirin ve akışı çeviri karışımı dağıtımı için en uygun hıza ayarlayın.
Translasyon karışımının gerektiği gibi borunun sonuna ulaşmasını sağlamak için şırıngayı başlatın ve durdurun ve kabarcıkları önlemeye dikkat ederek pompa borusu ucunu akış kanalının girişine yerleştirin. Bağlantıyı stabilize etmek ve mikroskop odağını ve görüntüleme alanı floresansını değerlendirmek için özel yapım metal braketi mikroskop numune tutucu plakasına vidalayın. Film alma parametrelerinin doğru olduğunu ve dosyaları kaydetmek için uygun dosya adının ve dizinin girildiğini onaylayın.
Akış kanalı algılama yüzeyinin ortasındaki bir alanın görüntülenmesine izin vermek için sahneyi hareket ettirin. Ve sürekli AF sekmesi altında, başlat düğmelerini tıklayın. Bir odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulacaktır.
Ortam ışığını azalttıktan sonra lazer deklanşörü açın ve kayda başlamak için sinyal al düğmesine tıklayın. Beş saniye sonra, çeviri karışımını akış kanalına iletmek için çalıştır komutunu girin. Ardından verileri, kare süresi başına 0,5 ila iki saniye çözünürlükte iki saate kadar kaydedin.
Cy3 ANTI-FLAG bağlama olaylarını analiz etmek için, seçilen Cy3 alfa bayrak noktalarının floresan yoğunlukları tüm film için kare kare hesaplandı ve bir yoğunluk yörüngesi oluşturacak şekilde bağlandı. Ham yörüngeler gürültülü görünebilir ve arka plan gürültüsünü azaltmak için doğrusal olmayan bir ileri/geri filtresiyle iyileştirme gerektirebilir. Yörüngeleri sayısallaştırmak için adım algılama algoritmaları kullanılarak daha fazla iyileştirme elde edilebilir.
Yeni ortaya çıkan bir polipeptitte antikor bağlanması, floresanda anlık bir artışa neden olurken, antikor polipeptit ayrışması anlık bir floresan azalmasına neden olur. Lusiferaz bayrağı mRNA'sı için bekleme süresi histogramı, günlük normal bir dağılıma uyar ve saniyede 2.5 artı veya eksi 0.1 amino asitlik bir peptit sentez hızı verir. İlk varış zamanı histogramı, tek mRNA translasyon aktivitesindeki yüksek heterojenlik derecesini gösteren kaydırılmış bir log normal fonksiyonuna uyar.
Histogramın gösterdiği gibi, tek lusiferaz bayraklı mRNA molekülleri üzerindeki ilk peptit sentezi olayı, translasyon karışımı dağıtımından iki dakika kadar erken ve 20 dakika kadar geç başlayabilir. Lusiferaz bayrağı mRNA ile translasyon ile karşılaştırıldığında, firkete lusiferaz bayrağı mRNA translasyonu ile ilk varış zamanı histogramı daha yavaş antikor bağlanması gösterdi. Bununla birlikte, aynı mRNA'larla hücresiz translasyon reaksiyonlarından toplu lüminesans ölçümlerinin kullanılması, translasyon kinetiğindeki farklılıkları çözmez.
Bu testin tek molekül çözünürlüğü, diğer yaklaşımlarla kolayca elde edilemeyen kap bağımlı translasyonun daha kinetik içgörülerini sağlar. Ökaryotik hücresiz translasyon, küçük varyasyonlara ve deneysel koşullara duyarlıdır. Bu nedenle, çevirideki küçük farklılıkları doğru bir şekilde tespit etmek için bu testi kullanırken ayrıntılara ve tutarlılığa dikkat etmek çok önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre dışı translasyon sistemleri kullanarak tek molekül seviyesinde aktif ökaryotik translasyon analizini sağlar. Toplu translasyon özelliklerini korurken, kapay bağlı translasyon mekanizmalarına ilişkin yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Tek molekül analizleri, detaylı kinetik çalışmalara izin verir.
- Kapaya bağlı translasyon, protein sentezinde kritik bir süreçtir.
- Mevcut yöntemler genellikle tek molekül çözünürlüğünden yoksundur.
- Bu teknik, toplu translasyon analizinden uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Translasyonun tek molekül analizi için bir yöntem geliştirmek.
- Translasyon sırasında başlama ve uzama kinetiklerini karakterize etmek.
- Ökaryotik translasyonu incelemek için hücre dışı sistemler kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan olarak etiketlenmiş antikorlar ile in vitro tek molekül analizi.
- Antikorlar ve yeni sentezlenmiş peptitler arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesi.
- Hücre dışı translasyon sistemlerinin kullanımı.
- Rahatsızlıkları en aza indirgemek için mikroskopik inkübatör kurulumu.
Ana Sonuçlar
- Translasyon başlangıcı ve uzamasının başarılı bir şekilde karakterize edilmesi.
- Tek molekül analizinde toplu translasyon özelliklerinin korunması.
- Yöntemin çeşitli hücre dışı sistemlere uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Kapaya bağlı translasyon mekanizmalarına ilişkin yüksek çözünürlüklü bilgiler.
Sonuçlar
- Bu yöntem, translasyon dinamiğini incelemek için güçlü bir araç sağlar.
- Protein sentezi mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı artırır.
- Yaklaşım uyarlanabilir ve farklı sistemlere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This single-molecule imaging assay enables high-resolution kinetic analysis of cap-dependent translation, addressing a critical gap in mechanistic understanding of eukaryotic protein synthesis. By resolving initiation and elongation rates at the individual mRNA level, it supports target validation and translational control studies in early discovery. The method enhances predictive confidence in de-risking therapeutic hypotheses related to translation dysregulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying translation initiation and elongation kinetics on single mRNAs.
- Operational Value: Provides quantitative readouts for functional target validation in cell-free systems.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving heterogeneity in translation activity across mRNA populations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence trajectories for quantitative comparison of translation conditions.
- Scalability: Compatible with various cell-free translation systems, enabling platform reuse across targets.
- Data Quality: Produces dwell time and first arrival time histograms that distinguish kinetic differences undetectable by bulk assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing mechanistic insights into cap-dependent translation regulation.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translational biomarkers through kinetic profiling of mRNA-specific translation dynamics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by revealing cell-free system sensitivity to experimental variables.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering kinetic resolution that complements bulk biochemical and phenotypic screening approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring real-time translation progression on individual mRNAs.
- Screening: Enables assay readiness through standardized immobilization and imaging of translation complexes.
- Analytics: Delivers single-molecule trajectory analysis, including dwell time and first arrival time measurements, for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant translation kinetics in eukaryotic systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for kinetic profiling across multiple translation systems and mRNA variants.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through resolution of initiation and elongation kinetics.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled cell-free translation and single-molecule imaging.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic assumptions about translation regulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative translation kinetics from single-molecule data.
Implementation Considerations
- Expertise in single-molecule fluorescence microscopy and cell-free translation systems.
- Instrumentation including TIRF-capable microscope, EMCCD camera, laser control, and syringe pump.
- Standardization of mRNA preparation, antibody labeling, and buffer conditions across teams.
- Adaptation considerations for different mRNA constructs and translation systems.
- Practical limitations including sensitivity to experimental conditions and requirement for consistent environmental control.
