Avustralya Senkrotron'da Seri Kristalografi Ölçümleri için Lipidico Enjeksiyon Protokolü

Bu protokol, bilim adamlarına, yüksek viskoziteli malzemelere gömülü protein kristallerinin yanı sıra, şu anda mevcut kurulumları kullanarak karakterize edilmesi zor olan diğer yumuşak malzemeleri karakterize etme fırsatı sağlar. Bu yöntem kullanılarak numuneler cam şırıngalarda hazırlanır, doğrudan enjektöre monte edilir, bu da enjektör sisteminin kullanımını kolaylaştırır ve numune israfını en aza indirir. Kristalleri yüksek viskoziteli bir ortamda hazırlamak için, önce yumuşak bir kristal topak oluşturmak için kristal çözeltiyi düşük hızda santrifüjleyin.

Fazla ortamı çıkardıktan sonra, 100 mikrolitrelik bir cam şırınganın ucuna bir kuplör sabitleyin ve 28 mikrolitre kristal çözeltiyi şırınga haznesine yükleyin. Pistonu yavaşça şırınganın üst kısmına yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça kuplör ucunun ucuna itin. Kabarcıkları çıkarmak için, bir conta oluşturmak için körelmiş kuplör iğne noktasının üst kısmına çok hafif bir basınç uygulamak için eldivenli bir parmak kullanın ve şırınga içinde bir basınç birikimi oluşturmak için çözeltiyi iğne ucundan uzaklaştırmak için pistonu geri çekin, ardından basıncı hızlı bir şekilde serbest bırakmak ve şırınga içindeki kabarcıkları patlatmak için parmağınızı çıkarın.

Alternatif olarak, şırıngayı bir elinizde, iğne yukarı bakacak ve piston iki parmağınız arasında sıkışmış olacak şekilde tutun ve şırıngayı tutan kolu bir yönde iki ila üç kez hızlı bir şekilde döndürün. Ortaya çıkan merkezkaç kuvveti, şırıngadaki herhangi bir hava kabarcığını dışarı çıkmaya zorlayacaktır. Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, 42 mikrolitre yüksek vakumlu silikon gresi doğrudan ikinci bir 100 mikrolitrelik şırınganın üstüne eklemek için ince bir spatula kullanın ve hava kabarcıklarını gidermek ve şırınganın ucunda hava boşluğu olmadığından emin olmak için pistonu sonuna kadar bastırın.

Her iki şırıngadan tüm kabarcıklar çıkarıldığında, her iki şırıngayı da uçlarından tutarak, şırıngaları kuplör ile takın. Numuneleri birlikte karıştırmak için, malzemeler iyice karışana ve homojen görünene kadar hem kristal solüsyonu hem de silikon gres şırınga pistonlarını 50 ila 100 kez hafifçe sırayla bastırın. Ardından kristalleri optik mikroskop altında görselleştirin.

Silikon gresindeki kristal konsantrasyonunu belirlemek için, optik mikroskop görüntülerini kullanarak belirli bir alandaki kristal sayısını sayın. Kristal konsantrasyonunu azaltmak için, şırınga kurulumundan önce kristal hazırlığını daha yüksek hacimde silikon gres kullanarak tekrarlayın veya kristal peletini kristalizasyon tamponunda seyreltin. Kristal konsantrasyonunu artırmak için, viskoziteyi 10 pascal saniyenin altına düşürmemeye dikkat ederek kristal hazırlığını daha küçük bir hacimde silikon gres kullanarak tekrarlayın.

Uygun kristal konsantrasyonu elde edildiğinde, tüm numuneyi tek bir şırıngaya taşıyın ve kuplörü, şırınganın tabanına çok sıkı bir şekilde vidalanmış 108 mikron iç çaplı bir enjeksiyon iğnesi ile değiştirin. Enjektörü kurmak için, aletleri ve hedef arama modunu ve negatif limit anahtarını seçin ve hedef aramayı başlatın ve 100 mikrolitrelik bir şırınganın vidanın altına sığması için vida yeterince geri çekilene kadar yazılımın çalışmasına izin verin. Şırıngayı enjektöre monte etmek için boş bir şırınganın iğnesini şırınga tutucusundaki yarıktan geçirin ve şırıngayı brakete doğru hizalayın.

Halkayı şırınganın her iki yanındaki kancalara takarak şırınganın orta kısmına bir O-ring sarın ve şırınganın üst kısmındaki kancaların etrafına ikinci bir O-ring geçirin. İkinci O-ringin bir parçasının cam şırınganın üzerine yerleştirildiğinden emin olun. Numune şırıngasını hazırlamak için şırıngayı doldurun, enjektör kapağını numune şırınga piston kafasına yerleştirin ve şırıngayı enjektöre yükleyin.

Tahrik vidasını kapağın üst kısmına getirin. Enjektör kontrol yazılımında hız modunu seçin ve hız modunu etkinleştirin. Ayar değerini dakikada 3.000 devir olarak ayarlayın ve ayar değerini uygula'ya tıklayın.

Vida, şırınga piston kafasındaki kapağa yaklaştığında, ayar değerini sıfıra değiştirin. Temas kurulduktan sonra, önceden ayarlanmış değeri etkinleştirmek için ayar değerini uygula'ya tıklayın ve vidayı anında durdurun. Ardından, sıkıca yerinde tutulduğundan emin olmak için kapağı hafifçe hareket ettirin.

Enjektörü çalıştırmak için ayar değerini dakikada 100 devir olarak değiştirin ve numuneyi ekstrüzyona başlarken gözlemlemek için ucu görsel olarak inceleyin. Kulübeyi kapattıktan sonra, yavaş ama kararlı bir malzeme akışı gözlenene kadar ayar değerini 10'luk düşüşlerle azaltın. Numune akışı iyi akmıyorsa, akış düzleşene kadar ayar değerini dakikada 10 devirlik artışlarla artırın.

Akış stabilize olmazsa, numuneyi yönlendirmeye yardımcı olması için numune akışının altına bir polistiren numune tutucu yerleştirin. Alternatif olarak, Avustralya senkrotronunun kafesinde bulunan hava çıkış borusuna bağlanabilen numune tutucuya bir Venturi emme hunisi yerleştirin. Akışın akış hızını belirlemek için Lipidico cihaz akış hesaplayıcısını kullanın.

Enjektör için en uygun numune çalışma hızının belirlenmesi, akış stabilitesi için çok önemlidir. Yavaş bir akış hızı, enjektörden çıkan silikon gresin genleşmesine neden olurken, daha hızlı bir akış hızı daha ince bir akış üretir. Viskoz ortam akışının kıvrılması düzenli olarak gözlenmiştir.

Yüksek yüklü numunelerde bu sorunun üstesinden gelmek için, zayıf bir elektrostatik kuvvet uygulamak için bir polistiren yakalayıcı kullanılabilir. Bu analizde, silikon gresi içinde süspanse edilmiş 26 mikrolitre lizozim kristali içeren bir cam şırınga kullanılmıştır. 38 dakika içinde yeterli miktarda veri toplandı ve lizozim yapısındaki disülfid bağlarını çevreleyen elektron yoğunluğu haritasının oluşturulmasını sağladı.

Viskozitenin düzeltilmesi gerekip gerekmediğini belirlemek için numunenin kristal konsantrasyonunu değerlendirmek için cam slayt üzerinde küçük bir hacimde numune kullanmayı unutmayın. Enjektörün çok yönlülüğü, diğer yüksek viskoziteli malzemelerin x-ray karakterizasyonuna olanak tanır. Örneğin, pil araştırmalarını kullanan iyonik sıvı yapıları veya süt ürünleri kullanan kolloidal malzemeler.