Name: Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin, epigenetik silme ve biyomekanik ipuçlarını birleştirerek memeli fibroblastlarından viral vektör kullanmadan pluripotent hücreler üretmeyi. Bu yöntem, rejeneratif tıp ve hücre tedavisi için güvenli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Carraresi Vakfı ve MiND FoodS Hub ID: 1176436 tarafından finanse edildi. Tüm yazarlar COST Action CA16119 In vitro 3-D toplam hücre rehberliği ve zindeliği (CellFit) üyesidir.

Tüm çalışmalar Milano Üniversitesi Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. İnsan hücrelerinin sağlıklı yetişkin bireylerden izole edilmesi, Milano'daki Ospedale Maggiore Policlinico Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmamızdaki tüm yöntemler onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Cilt fibroblast izolasyonu
NOT: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, fare, domuz ve insan dahil olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlara uygulanabilir. Murin hücreleri 7 haftalık erkek farelerden izole edildi ve yerel mezbahada domuz derisi dokusu toplandı. İnsan hücreleri, yazılı bilgilendirilmiş onamdan sonra yetişkin hastalardan izole edildi.
<ol><li>% 0.1 domuz jelatin çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>0.1 g domuz jelatini tartın ve 100 mL suda çözün. Jelatin çözeltisini kullanmadan önce otoklavlama yaparak sterilize edin.</li>
		<li>Hazırlanan çözeltinin 1,5 mL'si ilave edilerek 35 mm Petri kabını %0,1 domuz jelatini ile kaplayın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaklaşık 2-5 cm uzunluğundaki memeli (fare, domuz ve insan) cilt biyopsilerini kesin ve% 2 antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Saline (PBS) yerleştirin. Kullanana kadar + 4 °C'de saklayın. NOT: Biyopsi koleksiyonları mutabakat dahilinde ve Etik Kurul onayından sonra, belirlenen kılavuzlara uygun olarak yapılmalıdır.</li>
	<li>Toplanan biyopsileri,% 2 antibiyotik antimikotik çözelti içeren taze steril PBS'de üç kez kapsamlı bir şekilde yıkayın.</li>
	<li>Son yıkamadan biyopsileri toplayın ve steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Onları yaklaşık 2mm3 boyutunda parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın.</li>
	<li>2 saatlik inkübasyonun sonunda, 35 mm Petri kabından (adım 1.1.2'de tanımlanmıştır) fazla jelatin çözeltisini çıkarın ve steril bir cerrahi cımbız kullanarak, önceden kaplanmış her kültür kabına derhal 5-6 cilt parçası yerleştirin.</li>
	<li>Her birinin üzerine 100 μL fibroblast izolasyon ortamı damlacıkları (Tablo 1) ekleyerek parçaları ıslatın. % 5 CO 2 inkübatöründe 37 °C'de kültür. NOT: Ortamın buharlaşmasını önlemek için, 35 mm'lik Petri kabını steril su içeren 100 mm veya daha büyük bir Petri kabı içine yerleştirin. Her iki Petri kabını da kapattığınızdan emin olun.</li>
	<li>24 saatlik kültürden sonra, 35 mm kültür Petri kabındaki ortamın miktarını kontrol edin. Gerekirse, parçaları ıslak tutmak için 500 μL fibroblast izolasyon ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ortamı dikkatlice çıkarın ve pipet kullanarak en az 2 günde bir kültürde bir yenileyin.</li>
	<li>Fibroblastlar 35 mm'lik Petri kabına (adım 1.5'te tanımlanmıştır) yerleştirilen cilt parçalarından büyümeye başladığında ve bir hücre tek katmanı oluşturmaya başladığında (genellikle 6 gün). 2 mL fibroblast izolasyon ortamında steril bir cerrahi cımbız ve kültür kullanarak cilt parçalarını çıkarın.</li>
	<li>Hücre tek katmanını 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde% 80 birleşene kadar kültürlemeye devam edin ve her gün ortamı yenileyin.</li>
</ol>2. Fibroblast primer hücre hattı kültürü
<ol><li>Fibroblastlar% 80 birleşime ulaştığında, fibroblast izolasyon ortamını dikkatlice çıkarın ve% 1 antibiyotik antimikotik çözelti içeren 3 mL PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre ayrılması için, kültür kabına 600 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Hücreler kültür kabından ayrılmaya başladığında tripsini nötralize etmek için 5.4 mL fibroblast kültür ortamı ekleyin (Tablo 1).</li>
	<li>Tekrarlanan ve nazik pipetleme ile hücreleri yerinden çıkarın. Yeni kültür tabaklarındaki (jelatinsiz) tabak hücreleri, geçiş oranını 1: 2 ile 1: 4 arasında tutar (büyüme hızına bağlı olarak). NOT: Santrifüjleme gerekli değildir.</li>
	<li>Hücreleri kültürde tutun ve her 2 günde bir,% 80 akıcılığa ulaşana ve onları geçene kadar ortamı değiştirin. NOT: Güçlü büyümeyi sürdürmek için fibroblastları haftada iki kez yayın.</li>
</ol>3. 5-aza-CR'ye fibroblast maruziyeti
<ol><li>Taze 1 mM 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>2.44 mg 5-aza-CR ağırlığında ve 10 mL DMEM yüksek glikozda çözün. Vorteks yaparak tozu yeniden askıya alın. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile sterilize edin. NOT: 5-aza-CR stok çözeltisi kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.</li>
		<li>1 mL fibroblast kültür ortamında 1 μL 5-aza-CR stok çözeltisini (3.1.1.) seyrelterek 5-aza-CR çalışma çözeltisi hazırlayın. NOT: 5-aza-CR çalışma çözeltisinin konsantrasyonu 1 μM 1,2,3,8,9'dur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha önce tarif edildiği gibi hücreleri tripsinize edin (2.1.-2.3.) ve hücreleri tekrar tekrar ve nazikçe pipetleyerek yerinden çıkarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu toplayın ve konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında optik mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş 30 μL fibroblast kültür ortamında 4 x 104 hücre elde etmek için hücreleri yeniden askıya almak için gereken ortamın hacmini hesaplayın (bkz. adım 3.1.2.). NOT: Kullanılacak formül, belirli oda tipine bağlıdır. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş fibroblast kültür ortamı ile yeniden askıya alın (bkz. adım 3.1.2.). Kullanılacak fibroblast kültür ortamının hacmi için bkz. adım 3.4. NOT: Negatif bir kontrol olarak, 5-aza-CR olmadan fibroblast kültür ortamında aynı konsantrasyondaki hücreleri askıya alın ve PTFE tozunda hücre kapsüllemesi ile devam edin (adım 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. PTFE mikrobiyoreaktörlerde fibroblast kapsüllemesi
<ol><li>Bir yatak üretmek için 35 mm'lik bir Petri kabını politetrafloroetilen (PTFE) tozu ile doldurun (Şekil 1A). NOT: Sıvı mermerin yapışmasını önlemek için 35 mm bakteriyoloji Petri tabakları kullanın. İnce bir hidrofobik ve gözenekli kabuk elde etmek için, ortalama parçacık boyutu 1 μm olan ve maksimum 2.0 NPIRI öğütme ile üretilen bir PTFE tozu kullanın. Bu, gaz geçirgen sıvı mermerlerin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, yarı saydam kaplama, hücre toplama işlemlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini kolaylaştırır Daha büyük parçacık boyutu, yüksek buharlaşmaya, küresel şeklin deformitesine ve kaybına ve mikro-biyoreaktörlerin erken çözünmesine neden olabilecek yüksek polidispersiteye yol açar.</li>
	<li>4 x 104 hücre içeren 30 μL tek damlacığı (bkz. adım 3.4.- 3.5.) toz yatağına dağıtın (Şekil 1B).</li>
	<li>PFTE tozunun sıvı mermer mikro-biyoreaktör oluşturmak üzere sıvı damlasının yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün (Şekil 1C).</li>
	<li>Mermerin çapını yerleştirmek için kenardan kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü alın (Şekil 1D,E). Stabilize etmek için sıvı mermer mikro-biyoreaktörü temiz bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1F). NOT: Ucun içindeki mermeri kavramak üzere bir sürtünme oluşturmak için, pipet uçlarını sıvı mermer çapından yaklaşık biraz daha az bir çapla kesin.</li>
	<li>Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü Petri kabından 96 kuyucuklu bir plakaya (bir mermer / kuyu) aktarın (Şekil 1G).</li>
	<li>Kuyunun kenarından yavaşça 100 μL ortam ekleyin. Mikro-biyoreaktör ortamın üzerinde yüzmeye başlar (Şekil 1H). NOT: Mikro-biyoreaktör, PTFE hidrofobikliğinin bozulması nedeniyle doğrudan sıvı temasında kırılır. Alternatif bir yaklaşım olarak, sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri ayrı ayrı 35 mm'lik bir bakteriyoloji kültür kabına yerleştirilebilir. Bu durumda, sıvı mermerin buharlaşmasını önlemek için, mikro-biyoreaktörü içeren 35 mm'lik Petri kabı, daha önce steril su ile aliquoted edilmiş 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO 2 inkübatör 1,2,3,8,9'da inkübe edin. NOT: 1 μm'lik PTFE partikül boyutu, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında optimum gaz alışverişi sağlayabilir.</li>
	<li>18 saat boyunca 5-aza-CR inkübasyonundan sonra, kenarda kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörü toplayın (bkz. adım 4.5).</li>
	<li>Mikro-biyoreaktörü yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1D-F).</li>
	<li>Sıvı mermeri delmek ve kırmak için bir iğne kullanın.</li>
	<li>Oluşan sferoidleri 200 μL pipet ucuyla, kenardan kesilmiş, stereomikroskop altında geri kazanın (Şekil 1I,J). NOT: PTFE'de kapsüllenmiş epigenetik olarak silinmiş hücreler 3D küresel bir yapı oluşturur (her sıvı mermerde bir agrega).</li>
	<li>5-aza-CR'ye yanıt olarak pluripotent durumun kazanımını değerlendirmek için, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun, OCT4, NANOG, REX1 ve SOX2'nin başlangıcını kalitatif PCR ile kontrol edin (Tablo 2).</li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi protokolün ikinci adımına geçin.</li>
</ol>5. Epigenetik olarak silinmiş hücrelerin PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kültür
<ol><li>Taze ESC kültür ortamı hazırlayın (Tablo 1).</li>
	<li>Organoidleri, 5-aza-CR artıklarını yıkamak için ESC ortamı içeren bir Petri kabına aktarın (bkz. adım 5.1.-5.2.).</li>
	<li>PTFE toz yatağı içeren yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabı hazırlayın (ayrıca bkz. adım 4.1.).</li>
	<li>30 μL ESC kültür ortamındaki bir damlacıkta, kenardan kesilmiş 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak toz yatağına tek bir organoid dağıtın (bkz. adım 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Yeni bir sıvı mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak alın, kenardan kesin ve yeni oluşturulan mikro-biyoreaktörü 96 delikli bir plaka kuyusuna (bir mermer/kuyu) yerleştirin (bkz. adım 4.3.-4.6).</li>
	<li>Mikro-biyoreaktörleri yüzdürmek için, mermeri yavaşça yıkamak için kuyunun kenarından 100 μL ortam ekleyin (bkz. not 4.7.).</li>
	<li>Kültür sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde gerektiği kadar bekletilir. 5.3.-5.7'de açıklanan prosedürü izleyerek ortamı her gün değiştirin. NOT: Bu yazıda 28 gün boyunca organoid kültürü ile elde edilen sonuçlar sunulmuştur. Ancak ihtiyaç duyulması halinde daha uzun kültür süresi yapılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333(2015).</li>
<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
<li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017(2016).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li>
<li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
<li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-azacytidine+and+its+2%27-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li>
<li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2%27-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).</li>
<li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li>
<li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).</li>
<li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+extracellular+forces+that+determine+cell+fate+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance.</a> Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).</li>
<li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li>
<li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine+and+5-aza-2%5Bprime%5D-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation%3A+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li>
<li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li>
<li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li>
<li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083(2015).</li>
<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).</li>
<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).</li>
<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Son yıllarda, birkaç çalışma, ölümcül olarak farklılaşmış bir hücreyi daha az kararlı ve daha yüksek izin veren bir duruma geri döndürmek için stratejilerin geliştirilmesine odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol, yetişkin olgun terminal olarak farklılaşmış hücrelerden başlayarak pluripotent hücrelerin üretilmesine ve uzun süreli bakımına izin verir. Yöntem, kimyasal epigenetik silme yoluyla elde edilen yüksek izin verilen bir durumun indüklenmesini ve ardından bir 3D kültür sistemi kullanılarak sağlanan bakımını içere...

Son on yıllarda, hücre bağlılığı ve farklılaşmasına doğru tek yönlü ilerleme kavramı tamamen gözden geçirildi. Hücre spesifikasyonunun tersine çevrilebileceği ve ölümcül olarak farklılaşmış bir hücrenin, farklı yöntemler kullanılarak daha az kararlı ve daha yüksek izin verilen bir duruma itilebileceği gösterilmiştir.
Önerilen çeşitli yöntemler arasında, en umut verici yöntemlerden biri, hücreleri kimyasal olarak indüklenen pluripotens olarak adlandırılan bir şeye indüklemek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımda kullanılan küçük moleküller, yetişkin bir olgun hücrenin epigenetik imzasını etkileşime sokabilir ve değiştirebilir, herhangi bir transgenik ve / veya viral vektöre ihtiyaç duymaz, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Son zamanlarda yapılan çok sayıda çalışma, hipermetillenmiş genlerin11,12,13,14,15 reaktivasyonunu indükleyen spesifik biyokimyasal ve biyolojik uyaranlar sağlayarak hücreleri bir fenotipten diğerine geçirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Bu demetilasyon olayları, ölümcül olarak farklılaşmış hücrelerin ilkel bir progenitöre, multipotent veya yüksek plastisiteye / pluripotent bir hücreye dönüştürülmesine izin verir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Buna paralel olarak, birçok çalışma son zamanlarda mekanosensing ile ilgili ipuçlarının anlaşılmasına ve daha spesifik olarak, hücre plastisitesini ve / veya farklılaşmasını doğrudan etkilemek için mekanik kuvvetlerin kullanılması olasılığına odaklanmaktadır16,17,18,19. Gerçekten de, hücre dışı matrisin (ECM) hücre kaderinin kontrolünde önemli bir rol oynadığı açıkça gösterilmiştir. Özellikle, ECM tarafından üretilen biyomekanik ve biyofiziksel sinyaller, moleküler mekanizmaları ve sinyal yollarını doğrudan düzenleyerek hücre davranışını ve işlevlerini etkiler20,21. Bu son veriler, in vivo hücre mikro ortamını daha yakından taklit eden, hücre davranışını yönlendiren mekanik ve fiziksel uyaranları kopyalayan yeni 3D kültür sistemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.
Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren iki aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. İlk adımda, hücreler demetilasyon molekülü 5-aza-sitidin (5-aza-CR) ile inkübe edilir. Bu ajan, doğrudan on-onbir translokasyon 2 (TET2) aracılı etki8,10 ve DNA metiltransferazların (DNMT) 22,23'ün dolaylı inhibisyonunun birleşik bir etkisi ile önemli bir küresel DNA demetilasyonunu indükleyebilir. Bu adım, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun daha sonra yeniden aktivasyonu ile epigenetik blokların uzaklaştırılmasını ve dolayısıyla bundan böyle "epigenetik olarak silinmiş hücreler" olarak adlandırılacak olan yüksek plastisiteli hücrelerin 1,2,3,8,10 üretilmesini indükler. İkinci adımda, hücreler bir 3B kültür sisteminde kapsüllenir. Bu amaçla, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bileşik politetrafloroetilen (PTFE; 1 μm parçacık boyutuna sahip), geleneksel 2D kültür sistemlerinin kullanımıyla elde edilemeyen hücresel bir mikro ortamın oluşturulmasına izin veren mikro-biyoreaktör olarak kullanılır10. PTFE toz parçacıkları, hücrelerin yeniden askıya alındığı sıvı damlasının yüzeyine yapışır ve sıvı çekirdeği destek yüzeyinden izole ederken, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında gaz değişimine izin verir24. Bu şekilde elde edilen ve "Sıvı Mermer" olarak da bilinen "PTFE mikro-biyoreaktör", hücreleri birbirleriyle serbestçe etkileşime girmeye teşvik eder, 3D hücre yeniden düzenlenmesini teşvik eder25,26,27 ve biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları10 olsa da, elde edilen yüksek plastisite durumunu genişletir ve istikrarlı bir şekilde korur.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>ESC ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni 5-Azasitidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, fibroblast epigenetik silme için</td></tr><tr><td>Adenozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>ESC ortamı için nükleosit karışımının bileşeni</td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100 kez;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Fibroblast ve ESC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>CFX96 Gerçek Zamanlı PCR</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>NA</td><td>Kantitatif PCR için</td></tr> termal <tr><td>döngüleyici Sitidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>ESC ortamı için nükleosit karışımının bileşeni</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Fibroblast izolasyonu ve kültür ortamı için</td></tr><tr><td>DMEM, düşük glikoz, piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31885023</td><td>ESC ortamı</td></tr><tr><td>Dulbecco' için s Fosfat Tamponlu Tuzlu Salamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; biyopsi ve hücre yıkama ve çözelti hazırlama için</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Mikro Saflaştırma Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>mRNA estraction</td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinant Fare LIF Proteini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>ESC ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Fibroblast ve ESC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) Rekombinant İnsan Proteini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>ESC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Bulaşık kaplama için</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR Sistemi 2700</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>NA</td><td>Kalitatif PCR</td></tr><tr><td>Global DNA Metilasyonu ELISA için termal döngüleyici Kit</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>Metilasyon çalışması</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>Kalitatif PCR</td></tr><tr><td>Guanozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>ESC ortamı için nükleosit karışımının bileşeni</td></tr><tr><td>Ham'ın F-10 Besin Karışımı</td><td>Thermo Fisher ESC</td><td>ortamı için</td>Bilimsel <td>31550031</td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>10828028</td><td>ESC ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>KOVA ızgaralı cam slayt 10</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>Leica MZ APO Stereo Mikroskop</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Organoid gözlem için</td></tr><tr><td>L-Glutamin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Fibroblast ve ESC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>ESC ortamı</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 & mikro'nun bileşeni; m gözenek filtreleri</td> Çözelti <td>sterilizasyonu için</td><td>Millipore SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Ters Transkriptaz, RNase H Eksi, Nokta Mutant</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>mRNA ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>ELISA plaka okuma için</td><td>Multiskan FC Mikroplaka Fotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Ters Faz Kontrast Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Hücre için gözlem</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Termal Döngüleyici 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Ters transkripsiyon için termal döngüleyici</td></tr><tr><td>Poli (tetrafloroetilen) 1 & mu; m parçacık boyutu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>Mikro-biyoreaktör oluşturmak için</td></tr><tr><td>PureLink Genomik DNA Mini Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K182001</td><td>Genomik DNA estraksiyonu</td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Hücreleri-CT Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>Kantitatif PCR</td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>ESC ortamı için nükleosit karışımının bileşeni</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 100X20 mm, Standart</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td>Fibroblast izolasyonu için</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 35X10 mm, Standart</td><td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>Fibroblast izolasyonu için</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 35X10 mm, Süspansiyon</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Sıvı mermer kültürü için bakteriyoloji petri kabı</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Plakası 96 Kuyu, Standart, F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>Sıvı mermer kültürü için</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Fibroblast ayrışması için</td></tr><tr><td>Tüp 15ml, 120x17mm, PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>Hücre süspansiyonu santrifüjlemesi için</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>ESC ortamı için nükleosit karışımının bileşeni</td></tr></tbody></table>

memeli pluripotent hücreleri Üretmek için epigenetik modifikasyonu ve biyomekanik İpuçlarını birleştiren İki adımlı bir strateji

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Hücre fenotipi, her tekniğe özgü avantajlar ve sınırlamalar ile farklı yöntemlerle tersine çevrilebilir veya değiştirilebilir. Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren yeni bir strateji açıklıyoruz. İki ana adım gereklidir. İlk adımda, yetişkin olgun (ölümcül olarak farklılaşmış) hücreler, onları pluripotent bir duruma sokmak için epigenetik silgi 5-aza-sitidine maruz bırakılır. Protokolün bu kısmı, hücre kaderini ve farklılaşmasını kontrol eden epigenetik mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir ve hücre farklılaşmış durumunu silmek ve daha sonra geçici bir yüksek plastisite penceresine sürmek için epigenetik değiştiricinin kullanılmasını içerir.
İkinci adımda, silinen hücreler, elde edilen yüksek plastisiteyi genişletmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için 3D hücre yeniden düzenlemesini teşvik etmek için Sıvı Mermerler olarak da bilinen politetrafloroetilen (PTFE) mikro-biyoreaktörlerde kapsüllenir. PTFE, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bir bileşiktir ve kullanımı, geleneksel 2D kültür sistemlerinde elde edilemeyen hücresel bir mikro çevrenin oluşturulmasına izin verir. Bu sistem, biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları olsa da, pluripotensinin korunmasını teşvik eder ve artırır.
Burada açıklanan teknik prosedürler, yetişkin somatik hücrelerde yüksek plastisite durumunun indüksiyonuna ve korunmasına izin veren basit stratejilerdir. Protokol, test edilen tüm memeli türlerinde yüksek plastisiteli hücrelerin türetilmesine izin verdi. Gen transfeksiyonu kullanımını içermediğinden ve viral vektörlerden arındırılmış olduğundan, translasyonel tıp uygulamaları için dikkate değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil edebilir. Ayrıca, mikro-biyoreaktör sistemi, in vitro olarak yüksek plastisiteli hücrelerin, yani ESC'ler, iPSC'ler, epigenetik olarak silinmiş hücreler ve MSC'ler gibi uzun vadeli kültürüne izin veren belirli bir mikro ortamı yeniden yaratarak kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerleme sağlar.

Mevcut protokol, yetişkin somatik hücrelerden memeli pluripotent hücreleri üretmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için gerçekleştirilecek tüm adımları açıklamaktadır. Bu yöntem, fare, domuz ve insan olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlarla başarılı olmuştur. Burada bildirilen temsili sonuçlar, menşe türlerinin sırasıyla tüm hücre hatlarından elde edilir.
Morfolojik analizler, demetilasyon ajanı 5-aza-CR ile 18 saatlik inkübasyondan sonra, PTFE mikro-biyoreaktörlerd...

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Bu videoda ilk kez gösterilen protokol, yetişkin terminal olarak farklılaşmış hücrelerde pluripotentliği indüklemek ve sürdürmek için kimyasal epigenetik silmenin kullanımını biyomekanik ipuçlarıyla birleştirir. Bu protokolün temel gücü, transgenik veya viral vektörler gerektirmemesidir. Ayrıca, sağlam, yüksek oranda tekrarlanabilir ve esnektir.Bu teknik, gen transfeksiyonunun kullanılmasını gerektirmez ve bu nedenle, yüksek plastisiteli hücrelerin uzun süreli kültürünü desteklerken, translasyonel tıp ve hücre tedavisi için kayda değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil eder. Prosedürü göstermek, yardımcı doçent Georgia Pennarossa ve laboratuvarımdan doktora öğrencisi Teresina De Iorio olacak. Taze bir milimolar 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.2.44 miligram 5-aza-CR ağırlığında ve yüksek glikozlu 10 mililitre DMEM'de çözün. Tozu girdaplayarak yeniden süspanse edin ve çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir filtre ile sterilize edin. Stok çözeltisinin bir mikrolitresini bir mililitre fibroblast kültür ortamında seyrelterek 5-aza-CR çalışma çözeltisi hazırlayın.Hücreleri metin el yazmasında anlatıldığı gibi tripsinize edin ve nazik pipetleme ile yerinden çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu toplayın ve konik bir tüpe aktarın. Optik mikroskop altında bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve bir mikromolar 5-aza-CR ile desteklenmiş 30 mikrolitre fibroblast kültür ortamında 40.000 hücre elde etmek için peleti yeniden süspanse edin. Bir yatak oluşturmak için 35 milimetrelik bir Petri kabını PTFE tozu ile doldurun ve 30 mikrolitre hücreyi toz yatağına dağıtın.PTFE tozunun sıvı bir mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak üzere sıvı damlasının yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için Petri kabını dairesel hareketlerle yavaşça döndürün. Mermerin çapına uyacak şekilde kesilmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikrobiyoreaktörünü alın. Mikrobiyoreaktörü stabilize etmek için temiz bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin.Ardından, mikrobiyoreaktörü Petri kabından 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kuyu kenarından yavaşça 100 mikrolitre ortam ekleyin. Mikrobiyoreaktör ortamın üzerinde yüzmelidir.Sıvı mermer mikrobiyoreaktörünü %5'lik bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikrobiyoreaktörü toplayın ve 35 milimetrelik yeni bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin. Sıvı mermeri delmek ve kırmak için bir iğne kullanın.Oluşan sferoidleri, stereomikroskop altında kenarından kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile kurtarın. 5-aza-CR kalıntılarını yıkamak için, organoidleri ESC ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. PTFE toz yatağını içeren yeni bir 35 milimetrelik Petri kabı hazırlayın ve 200 mikrolitrelik kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 30 mikrolitrelik bir ESC kültür ortamı damlacığı içinde tek bir organoidi tozun üzerine dağıtın.Yeni bir sıvı mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak için çanağı dairesel hareketlerle yavaşça döndürün ve 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Mermeri yavaşça yıkamak için kuyu kenarından 100 mikrolitre ortam ekleyin. Sıvı mermer mikrobiyoreaktörlerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.Morfolojik analizler, demetilasyon ajanı 5-aza-CR ile 18 saatlik bir inkübasyondan sonra, PTFE mikrobiyoreaktörlerde kapsüllenmiş üç memeli türünden elde edilen fibroblastların toplandığını ve tek tip bir boyut geometrisine sahip 3D küresel yapılar oluşturduğunu göstermektedir. 3D koşullar altında, kapsüllenmiş hücrelerin% 86.31'i fenotiplerini önemli ölçüde değiştirdi. Buna karşılık, 2D standart koşullarda kültürlenen post-5-aza-CR hücreleri, granüle çekirdeklerle boyut olarak önemli ölçüde daha küçüktü ve tek katmanlı bir dağılımı korudu.Morfolojik değişikliklere, hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde pluripotentlik ile ilişkili gen ekspresyonunun başlangıcı eşlik etti. Tedavi edilmemiş fibroblastlarda bulunmayan POU sınıf beş homeobox one, NANOG homeobox, ZFP42 çinko parmak proteini ve cinsiyet belirleyici bölge Ybox2 için transkripsiyon gözlendi. 10-11 translokasyon 2 epitel hücre adezyon molekülü ve kaderin 1 genlerinin önemli bir yukarı regülasyonu, 2D standart plastik kaplarda kültürlenen hücrelere kıyasla 3D post-5-aza-CR hücrelerinde de gözlenmiştir.Paralel olarak, fibroblasta özgü belirteç Thy1 hücre yüzeyi antijeninin aşağı regülasyonu, hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde tespit edildi. ELISA ile hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde metilasyon seviyelerinde önemli bir azalma doğrulandı. DNA metilasyon seviyeleri, 3D post-5-aza-CR hücrelerinde, 2D koşullarda kültürlenen hücrelere kıyasla anlamlı derecede düşüktü.Ayrıca, 3D post-5-aza-CR hücreleri, edinilen 3D küresel yapıyı, pluripotentlik ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini ve düşük DNA metilasyon seviyelerini 28 gün boyunca korudu ve bu noktada kültür tutuklandı. Mikrobiyoreaktörler ayrıca progenitör hücre kültürleri için en uygun koşulları sağlamak ve terminal farklılaşma verimliliğini artırmak için de kullanılabilir.

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Memeli hücreleri kimyasal indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için içine bir mühendislik Böl-TET2 enzim (elma şarabı) tanıtmak için detaylı protokolleri mevcuttur.

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Hücreleri confluency ulaşmak, pasajlandı veya geçişli olmalıdır. Bu video yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de alt kültüre için bir prosedür gösterecektir.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Öğrenin, epigenetik silme ve biyomekanik ipuçlarını birleştirerek memeli fibroblastlarından viral vektör kullanmadan pluripotent hücreler üretmeyi. Bu yöntem, rejeneratif tıp ve hücre tedavisi için güvenli bir alternatif sunar.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji (Video) | JoVE Journal

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Daha fazla video keşfet