Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Bu videoda ilk kez gösterilen protokol, yetişkin terminal olarak farklılaşmış hücrelerde pluripotentliği indüklemek ve sürdürmek için kimyasal epigenetik silmenin kullanımını biyomekanik ipuçlarıyla birleştirir. Bu protokolün temel gücü, transgenik veya viral vektörler gerektirmemesidir. Ayrıca, sağlam, yüksek oranda tekrarlanabilir ve esnektir.

Bu teknik, gen transfeksiyonunun kullanılmasını gerektirmez ve bu nedenle, yüksek plastisiteli hücrelerin uzun süreli kültürünü desteklerken, translasyonel tıp ve hücre tedavisi için kayda değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil eder. Prosedürü göstermek, yardımcı doçent Georgia Pennarossa ve laboratuvarımdan doktora öğrencisi Teresina De Iorio olacak. Taze bir milimolar 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.

2.44 miligram 5-aza-CR ağırlığında ve yüksek glikozlu 10 mililitre DMEM'de çözün. Tozu girdaplayarak yeniden süspanse edin ve çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir filtre ile sterilize edin. Stok çözeltisinin bir mikrolitresini bir mililitre fibroblast kültür ortamında seyrelterek 5-aza-CR çalışma çözeltisi hazırlayın.

Hücreleri metin el yazmasında anlatıldığı gibi tripsinize edin ve nazik pipetleme ile yerinden çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu toplayın ve konik bir tüpe aktarın. Optik mikroskop altında bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.

Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve bir mikromolar 5-aza-CR ile desteklenmiş 30 mikrolitre fibroblast kültür ortamında 40.000 hücre elde etmek için peleti yeniden süspanse edin. Bir yatak oluşturmak için 35 milimetrelik bir Petri kabını PTFE tozu ile doldurun ve 30 mikrolitre hücreyi toz yatağına dağıtın.

PTFE tozunun sıvı bir mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak üzere sıvı damlasının yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için Petri kabını dairesel hareketlerle yavaşça döndürün. Mermerin çapına uyacak şekilde kesilmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikrobiyoreaktörünü alın. Mikrobiyoreaktörü stabilize etmek için temiz bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin.

Ardından, mikrobiyoreaktörü Petri kabından 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kuyu kenarından yavaşça 100 mikrolitre ortam ekleyin. Mikrobiyoreaktör ortamın üzerinde yüzmelidir.

Sıvı mermer mikrobiyoreaktörünü %5'lik bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikrobiyoreaktörü toplayın ve 35 milimetrelik yeni bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin. Sıvı mermeri delmek ve kırmak için bir iğne kullanın.

Oluşan sferoidleri, stereomikroskop altında kenarından kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile kurtarın. 5-aza-CR kalıntılarını yıkamak için, organoidleri ESC ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. PTFE toz yatağını içeren yeni bir 35 milimetrelik Petri kabı hazırlayın ve 200 mikrolitrelik kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 30 mikrolitrelik bir ESC kültür ortamı damlacığı içinde tek bir organoidi tozun üzerine dağıtın.

Yeni bir sıvı mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak için çanağı dairesel hareketlerle yavaşça döndürün ve 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Mermeri yavaşça yıkamak için kuyu kenarından 100 mikrolitre ortam ekleyin. Sıvı mermer mikrobiyoreaktörlerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.

Morfolojik analizler, demetilasyon ajanı 5-aza-CR ile 18 saatlik bir inkübasyondan sonra, PTFE mikrobiyoreaktörlerde kapsüllenmiş üç memeli türünden elde edilen fibroblastların toplandığını ve tek tip bir boyut geometrisine sahip 3D küresel yapılar oluşturduğunu göstermektedir. 3D koşullar altında, kapsüllenmiş hücrelerin% 86.31'i fenotiplerini önemli ölçüde değiştirdi. Buna karşılık, 2D standart koşullarda kültürlenen post-5-aza-CR hücreleri, granüle çekirdeklerle boyut olarak önemli ölçüde daha küçüktü ve tek katmanlı bir dağılımı korudu.

Morfolojik değişikliklere, hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde pluripotentlik ile ilişkili gen ekspresyonunun başlangıcı eşlik etti. Tedavi edilmemiş fibroblastlarda bulunmayan POU sınıf beş homeobox one, NANOG homeobox, ZFP42 çinko parmak proteini ve cinsiyet belirleyici bölge Ybox2 için transkripsiyon gözlendi. 10-11 translokasyon 2 epitel hücre adezyon molekülü ve kaderin 1 genlerinin önemli bir yukarı regülasyonu, 2D standart plastik kaplarda kültürlenen hücrelere kıyasla 3D post-5-aza-CR hücrelerinde de gözlenmiştir.

Paralel olarak, fibroblasta özgü belirteç Thy1 hücre yüzeyi antijeninin aşağı regülasyonu, hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde tespit edildi. ELISA ile hem 3D hem de 2D post-5-aza-CR hücrelerinde metilasyon seviyelerinde önemli bir azalma doğrulandı. DNA metilasyon seviyeleri, 3D post-5-aza-CR hücrelerinde, 2D koşullarda kültürlenen hücrelere kıyasla anlamlı derecede düşüktü.

Ayrıca, 3D post-5-aza-CR hücreleri, edinilen 3D küresel yapıyı, pluripotentlik ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini ve düşük DNA metilasyon seviyelerini 28 gün boyunca korudu ve bu noktada kültür tutuklandı. Mikrobiyoreaktörler ayrıca progenitör hücre kültürleri için en uygun koşulları sağlamak ve terminal farklılaşma verimliliğini artırmak için de kullanılabilir.