İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot
26 Eylül 2020
Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.
Western blotlama, transfer edilen bir zar üzerindeki antijenleri tespit eden ve biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir, ancak tüm prosedürün tamamlanması saatler veya günler alır. İmmüno-güçlendirme teknolojisinin döngüsel boşaltma ve yenileme ile kombinasyonunu kullanarak, bir blok zarınız olduğunda, tüm prosedür hassasiyetten ödün vermeden 20 dakika gibi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Western blotting birçok farklı araştırma alanında ortak olduğundan, araştırmayı hızlandırmak için geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir.
Bu protokolün başarılı kullanımı, immünoreaksiyonu arttırıcı reaktif ve inkübasyon süresi ile antikor seyreltmesinin optimizasyonuna dayanır. PVDF membranlarını oda sıcaklığında çalkalama ile bir saat boyunca uygun engelleme tamponlarında inkübe ederek başlayın. Membranlar inkübe edilirken,% 10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan bir çözelti veya IRE1'i damıtılmış su ile hazırlayın ve iyice girdaplayın, ardından birincil antikoru% 10 IRE1 ile seyreltin, nazikçe ve iyice karıştırın.
PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısaca boşaltın. Membranı, birincil antikorlu konik bir tüpe yerleştirin, tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından ve zarın başlangıçta jel ile temas halinde olan tarafının içe baktığından emin olun. Tüpü sıkıca kapatın.
Tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin ve fırını açın. Membranı altı RPM dönüşü ile en az beş dakika inkübe edin. Dönüşü durdurun ve PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın.
Membranı 50 mililitre PBST içeren bir kaba koyun ve durulayın, ardından antikorun çoğunu çıkaracak kabarcıklar görünmeyene kadar damıtılmış su ile bir kapta durulayın. Membranı 250 mililitre PBST içeren bir salata döndürücüye aktarın. Süzgeç sepetini döndürücüye yerleştirin ve kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun, ardından döndürücüyü etkinleştirin ve 20 ila 30 saniye çalıştırın.
Solüsyonu atın ve döndürücünün içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın. Döndürücüye 250 mililitre PBST ekleyin ve dönüşü tekrarlayın, ardından zarı ikincil antikorlarla inkübe edin ve metin el yazmasında anlatıldığı gibi tekrar yıkayın. Düz bir yüzeye yarı saydam esnek bir film parçası yerleştirin.
Kemilüminesan substratın iki bileşenini beş mililitrelik bir tüpte karıştırın ve karıştırılmış substratın 1,5 mililitresini hemen yarı saydam filme aktarın. PVDF membranını çözeltinin üzerine yerleştirin ve substrat çözeltisinin geri kalanını membranın üzerine aktarın. PVDF membranını karışık substrat ile bir dakika inkübe edin.
PVDF membranını cımbızla alın ve alt tabaka solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. Membranı bir çift saydam film arasına sıkıştırın ve kemilüminesan modunda görüntüleyin. Western blot'un kemilüminesan tespiti için gerekli olan sırasıyla antijen ve antikor miktarları burada gösterilmiştir.
Hem statik hem de CDR inkübasyonlarında IRE solüsyonlarının kullanımı duyarlılığı artırmıştır. Benzer şekilde, minimum anti-6s His tag antikor konsantrasyonu, statik koşullar altında mililitre başına 100 ila 50 nanogramdan ve CDR koşulları altında mililitre başına 100 ila 12.5 nanogramdan düşürüldü. 5 veya 10 dakikalık CDR inkübasyonu, statik inkübasyona kıyasla tespit sınırını önemli ölçüde düşürdü.
Ayrıca, CDR'nin IRE ile kombinasyonu, son derece kısa kuluçka süresi içinde bile Western blot üzerinde üstün hassasiyet ortaya çıkardı. Bu yöntemin floresan algılamalı bir Western blot'a başarılı bir şekilde uygulanması burada gösterilmiştir. Floresan algılama, kemilüminesan algılamanın aksine, antikorları sıyırmadan ve yeniden problamadan aynı leke üzerinde aynı anda birden fazla hedefi tespit etme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir.
Hücre lizatlarındaki his etiketli alkalin fosfataz ve beta-aktin, iki renkli bir florofor kullanılarak aynı anda tespit edildi. IRE ile CDR inkübasyonu sadece algılamayı hızlandırmakla kalmadı, aynı zamanda hassasiyeti de artırdı. İnkübasyon sırasında, zar tüpün duvarına bağlı kalmalıdır.
Tüp yatay olarak döndürülmelidir, böylece çözelti membran yüzeyi üzerinde sürekli olarak yıkanır. Bu protokol, büyük ölçüde Batı lekeleme prosedürlerine bağlı olan araştırma verimliliğimizi önemli ölçüde hızlandırdı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, prosedür için gereken süreyi önemli ölçüde azaltan ultra yüksek hızlı bir western blotting tekniği sunmaktadır. Döngüsel boşaltma ve yenileme (CDR) teknolojisinin bir immünoreaksiyon artırıcı ajanla birlikte kullanılması sayesinde, hassasiyetten ödün vermeden tüm süreç 20 dakika kadar kısa bir sürede tamamlanabilmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomedikal araştırma
- Western blotting teknikleri
- İmmün artırma teknolojisi
Arka Plan
- Western blotting, antijenleri saptamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
- Geleneksel western blotting prosedürleri saatler, hatta günler sürebilir.
- Bu tekniğin hızının artırılması, araştırma verimliliğini geliştirebilir.
- Çalışma, antikor dilüsyonu ve inkübasyon sürelerinin optimize edilmesine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Daha hızlı bir western blotting protokolü geliştirmek.
- Prosedür süresini kısaltırken hassasiyeti korumak.
- Tekniğin çeşitli araştırma alanlarındaki geniş uygulanabilirliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Siklik boşaltma ve yeniden doldurma (CDR) teknolojisinin kullanımı.
- İmmünreaksiyon artırıcı bir ajanın (IRE1) dahil edilmesi.
- PVDF membranların uygun tamponlarda bloklanması.
- Antikor dilüsyonunun ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu.
Temel Sonuçlar
- Western blotting prosedürünün tamamı 20 dakika içinde tamamlanabilir.
- Süreç boyunca yüksek hassasiyet korunur.
- Başarılı optimizasyon, etkili antijen saptamaya yol açar.
- Yöntem, çeşitli araştırma alanlarında yaygın kullanım potansiyeli göstermektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen teknik, western blotting işlemini önemli ölçüde hızlandırmaktadır.
- CDR teknolojisinin immüno-artırıcı ajanlarla kombinasyonu etkilidir.
- Bu ilerleme, araştırmaların sonuçlanmasını hızlandırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Western blotting, hedef doğrulaması ve biyobelirteç analizlerinde temel bir teknik olmaya devam etmektedir; ancak uzun inkübasyon süreleri, yüksek kapasiteli keşif iş akışlarında darboğazlar oluşturmaktadır. Bu ultra yüksek hızlı yöntem, hassasiyeti korurken analiz süresini saatlerden 20 dakikaya indirerek birden fazla örnekte hızlı protein ekspresyon analizine olanak tanır. Bu yaklaşım, veri kalitesinden ödün vermeden analiz kapasitesini artırarak daha hızlı hipotez testi ve öncü madde tanımlama süreçlerini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hızlandırılmış protein deteksiyonu yoluyla terapötik hipotezlerin hızlı bir şekilde sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Blot başına harcanan süreyi azaltarak, erken hedef doğrulama aşamasında daha fazla hedefin paralel olarak taranmasına olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Analiz hassasiyetini koruyarak, güvenilir hedef etkileşimi ve yolak modülasyon değerlendirmelerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonuna uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir protein ekspresyon okumaları sağlar.
- Operasyonel Değer: Hem kemilüminesan hem de floresan deteksiyon ile uyumlu olup, multipleksleme ve esnek okuma seçeneği sunar.
- Ölçeklenebilirlik: Döngüsel boşaltma ve yenileme formatı, otomatik veya yarı otomatik iş akışlarına adaptasyonu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Aynı hızlı saptama yöntemini kullanarak, keşif aşamasından preklinik modellere kadar tutarlı protein analizini kolaylaştırır.
- Biyobelirteç Uyumu: Hastalık mekanizmalarıyla ilgili post-translasyonel modifikasyonların ve protein izoformlarının değerlendirilmesini destekler.
- Risk Azaltma: Hedef biyobelirteçlerin validasyonunu hızlandırarak, preklinik ilerleme kararlarındaki belirsizliği azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hızlı protein kantifikasyonunun tekrarlayan tasarım döngülerini bilgilendirdiği, hedef etkileşim taramasından öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Farklı deneysel koşullar altında protein seviyelerinin hızlı ve tekrarlanabilir ölçümüne olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Koşullar ve örnekler arasında antikor bağlanmasının karşılaştırılmasına izin veren standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar üretir.
- Analitik: Düşük bolluktaki hedef analizlerinde sinyal-gürültü oranını artıran hassas saptama limitleri (örneğin, düşürülmüş antikor konsantrasyon gereksinimleri) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Örnek türleri arasında tutarlı protein izlemesine imkan tanıyarak hastalıkla ilgili sistemlerde biyobelirteç validasyonunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Geniş uyumluluğu sayesinde birden fazla proje ve terapötik alana uygulanabilen, platform kapasiteli bir tekniği temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hızlı ve tekrarlanabilir protein tespiti yoluyla hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: İnkübasyon sürelerini ve antikor tüketimini azaltarak laboratuvar işlem kapasitesini ve reaktif verimliliğini iyileştirir.
- Stratejik Değer: Veri üretim döngülerini hızlandırarak hedef seçiminde daha hızlı devam/durdur kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Yatırım kararları için zamanında hedef doğrulama verileri sunarak riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Siklik boşaltma ve yenileme teknikleri ile immünreaksiyon artırıcı ajan kullanımı konusunda deneyim gerektirir.
- Hibridizasyon fırını, santrifüj (salad spinner) ve kemilüminesans veya floresan okumalar için deteksiyon sistemleri dahil olmak üzere standart western blotting ekipmanına ihtiyaç duyar.
- İmmünreaksiyon artırıcı ajan entegre edilirken antikor dilüsyonu ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu gereklidir.
- Sinyal bütünlüğünü korumak için boşaltma ve döndürme adımları sırasında membranların doğru şekilde taşınmasını sağlamak amacıyla eğitim gerektirir.
- Zaman tasarrufunun birden fazla hedef ve koşul boyunca katlanarak arttığı, sık western blot işlemleri gerçekleştiren laboratuvarlar için en uygundur.
