Name: İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin, immünreaksiyon arttırıcı teknoloji ve CDR kullanarak 20 dakikada tamamlanan ultra yüksek hızlı batı blot yöntemini. Hassasiyet kaybetmeden antijen tespiti sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Intramural Araştırma Bölümü, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi. S.H., Japonya Kamu-Özel Ortaklığı Öğrenci Yurtdışında Eğitim Programı tarafından desteklendi ve H.N. ve K.Y. Valor ve V Drug Overseas Training Scholarship tarafından desteklendi.

1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın
<ol><li>Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin. NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
	<li>Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın. NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
</ol>2. PVDF membranlarının engellenmesi
<ol><li>Membranları oda sıcaklığında ajitasyon ile 1 saat boyunca uygun engelleme tamponlarında kuluçkaya yatırın. NOT: Birincil antikor ve algılama sistemine bağlı olarak uygun bir blokaj tamponu seçilmelidir. Örneğin, en tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein ve ticari sentetik polimerlerdir. %0,1 Ara20 ile PBS ve/veya TBS en sık kullanılan arabelleklerdir. Bu engelleme adımı 4 °C'de bir gecede yapılabilir.</li>
</ol>3. Primer antikor ile inkübasyon
<ol><li>Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-1 çözeltisi (IRE-1) hazırlayın. Girdap iyi.</li>
	<li>Seyreltilmiş primer antikoru% 10 IRE-1 ile hazırlayın. Hafifçe ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Daha büyük bir membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 50 mL konik santrifüj tüplerine 8 mL antikor çözeltisi ekleyin. Daha küçük bir membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe(Malzeme Tablası)3 mL antikor çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. PVDF zarını eldivenli parmaklarla bu tüpe yerleştirin ve tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından emin olun. PVDF membran bir tüpe yerleştirildiğinde, başlangıçta jel ile içe doğru temas eden zarın "protein tarafı" ile yüzleşin. Kapağı sıkıca kapatın.</li>
	<li>50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin. NOT: Bu inkübasyon için 14 mL tüp kullanıldığında, iç tüpü 50 mL tüpün ortasında tutmak için bir çift plastik halka tutucu kullanarak 50 mL'lik tüpe 14 mL'lik bir tüp yerleştirin.</li>
	<li>Hibridizasyon fırınını açın.</li>
	<li>Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. NOT: Membranın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. Gerçek deneyden önce antikorun seyreltilmesini ve kuluçka süresini kalibre edin.</li>
</ol>4. Membran yıkama
<ol><li>Dönüşü durdurun.</li>
	<li>PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın ve membranı 50 mL PBS-T içeren bir kaba yerleştirin.</li>
	<li>Membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>Zarı kabarmış su ile kabarcık görününe kadar durulayın. Bu antikorun çoğunluğunu çıkarmaktır.</li>
	<li>PVDF membranını kaptan 250 mL PBS-T içeren salata spinner'a aktarın.</li>
	<li>Süzgeç sepetini spinner'a yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.</li>
	<li>Spinner'ı etkinleştirin ve yaklaşık 20-30 s boyunca çalıştırın.</li>
	<li>Çözeltiyi atın ve spinner'ın içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>Spinner'a tekrar 250 mL PBS-T ekleyin.</li>
	<li>4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>5. İkincil antikor ile inkübasyon
<ol><li>Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-2 çözeltisi (IRE-2) hazırlayın. Girdap iyi.</li>
	<li>Seyreltilmiş ikincil antikorun %10 IRE-2 ile hazırlanması. Hafifçe ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Adım 3.3'te belirtildiği gibi antikor çözeltisinin ve tüpün hacmini seçin.</li>
	<li>PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın. 3.4. adımda belirtildiği gibi PVDF membranını tüpe yerleştirin.</li>
	<li>50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.</li>
	<li>Hibridizasyon fırınını açın.</li>
	<li>Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. Zarın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. NOT: Gerçek denemeden önceki kuluçka süresini kalibre edin. İkincil antikor floresan konjuge edildiğinde, inkübasyonu karanlıkta gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Membran yıkama
<ol><li>4.1 ile 4.10 arasında olan adımları izleyin.</li>
</ol>7. Görüntü alımı
<ol><li>Chemiluminescent algılama<ol>
<li>Düz bir yüzeye bir parça yarı nakil esnek film (10 cm x 15 cm) yerleştirin.</li>
		<li>Chemiluminescent substratının 2 bileşenini 5 mL'lik bir tüpte karıştırın.</li>
		<li>Karışık substratın 1,5 mL'sini hemen yarı nakil esnek filme aktarın ve üzerine PVDF zarını yerleştirin. Daha sonra, substrat çözeltisinin geri kalanını zara aktarın.</li>
		<li>PVDF membranı, yarı saydam esnek bir film üzerindeki karışık substrat ile 1 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PVDF membranını cımbızla alın ve substrat çözeltisini kısa bir süre boşaltın.</li>
		<li>Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntüyü chemiluminescent modu altında alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan algılama<ol>
<li>PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın.</li>
		<li>Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntüyü floresan modunda elde edin. NOT: Maksimum hassasiyet sağlamak için 7.1 ve 7.2 adımları görüntüleme makinesine yakın bir yerde yapılmalıdır.</li>
		<li>Arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL PBS-T içeren bir kapta yıkama adımı gerçekleştirin: birincil antikor için 3 kez 10 dakika durulayın ve ikincil antikor için 5 dakika durulayın. NOT: %10 IRE çözeltileri ile seyreltilmiş hem birincil hem de ikincil antikorlar hassasiyet kaybı olmadan 8-10 kata kadar kullanılabilir6. Çözelti 1 aya kadar 4 °C'de tutulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacol+Toxicology+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li>
<li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li>
<li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li>
<li>Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html">http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html</a> (2020).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+but+not+Obsolete%3A+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li>
<li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852(2016).</li>
<li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li>
<li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle doğrudan ilgili rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Batı blotu, ~40 yıl önce7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi2, 9,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknikte birkaç önemli ge...

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır1. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir2. Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.
Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)3denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.
Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık5. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.

<table><tbody><tr><td>14 mL Yuvarlak Alt Yüksek Netlik PP Test Tüpü, Dereceli, Snap Kapaklı</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Yazıcılar için Apollo Şeffaflık Filmi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Her türlü Lazer Yazıcı Şeffaflık Filmi iyidir.</td></tr><tr><td>Azure Görüntüleme Sistemi 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>Her türlü Görüntü Alma Sistemi, kemilüminesan ve/veya floresan tespiti için uygundur.</td></tr><tr><td>Sinyal İmmünoreaksiyon Arttırıcı Çözelti Alabilir</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>KARANFİL Anında Yağsız Kuru Süt</td><td>Karanfil</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-fare IgG, Yaban turpu peroksidaz bağlantılı F (ab ')Koyundan 2 parça</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-tavşan IgG, Yaban turpu peroksidaz bağlantılı F(ab')Eşek</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>parçasından 2 parça Tüpler yatay konumda eşit şekilde döndürüldüğü sürece herhangi bir hibridizasyon fırını iyidir.</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membran, 0.45 & m gözenek boyutu</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Keçi anti-Fare IgG İkincil Antikoru</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Keçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikoru</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Rezerv Kemilüminesan Substrat</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-&szlig; aktin antikoru</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Engelleme Tamponu (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>Floresan algılama için Engelleme Tamponu</td></tr><tr><td>OXO Salata Döndürücü</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>PVDF membranları yırtılmadan kuvvetlice durulandığı sürece herhangi bir salata döndürücü iyidir.</td></tr><tr><td>Parafilm Sızdırmazlık Filmi</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>yarı saydam esnek film</td></tr><tr><td>50 mL Konik Tabanlı Santrifüj Tüpleri için Polietilen Düz Üst Vidalı Kapaklar</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>14 ml'lik tüpü 50 ml'lik tüpün ortasında tutmak için halkalar</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bir makine atölyesinde hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Tavşan anti-6X His tag antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

İmmünreaksiyon arttırıcı teknoloji kullanan ultra yüksek hızlı batı blot

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gösterildi. Hem statik hem de CDR inkü...

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Western blotlama, transfer edilen bir zar üzerindeki antijenleri tespit eden ve biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir, ancak tüm prosedürün tamamlanması saatler veya günler alır. İmmüno-güçlendirme teknolojisinin döngüsel boşaltma ve yenileme ile kombinasyonunu kullanarak, bir blok zarınız olduğunda, tüm prosedür hassasiyetten ödün vermeden 20 dakika gibi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Western blotting birçok farklı araştırma alanında ortak olduğundan, araştırmayı hızlandırmak için geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir.Bu protokolün başarılı kullanımı, immünoreaksiyonu arttırıcı reaktif ve inkübasyon süresi ile antikor seyreltmesinin optimizasyonuna dayanır. PVDF membranlarını oda sıcaklığında çalkalama ile bir saat boyunca uygun engelleme tamponlarında inkübe ederek başlayın. Membranlar inkübe edilirken,% 10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan bir çözelti veya IRE1'i damıtılmış su ile hazırlayın ve iyice girdaplayın, ardından birincil antikoru% 10 IRE1 ile seyreltin, nazikçe ve iyice karıştırın.PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısaca boşaltın. Membranı, birincil antikorlu konik bir tüpe yerleştirin, tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından ve zarın başlangıçta jel ile temas halinde olan tarafının içe baktığından emin olun. Tüpü sıkıca kapatın.Tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin ve fırını açın. Membranı altı RPM dönüşü ile en az beş dakika inkübe edin. Dönüşü durdurun ve PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın.Membranı 50 mililitre PBST içeren bir kaba koyun ve durulayın, ardından antikorun çoğunu çıkaracak kabarcıklar görünmeyene kadar damıtılmış su ile bir kapta durulayın. Membranı 250 mililitre PBST içeren bir salata döndürücüye aktarın. Süzgeç sepetini döndürücüye yerleştirin ve kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun, ardından döndürücüyü etkinleştirin ve 20 ila 30 saniye çalıştırın.Solüsyonu atın ve döndürücünün içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın. Döndürücüye 250 mililitre PBST ekleyin ve dönüşü tekrarlayın, ardından zarı ikincil antikorlarla inkübe edin ve metin el yazmasında anlatıldığı gibi tekrar yıkayın. Düz bir yüzeye yarı saydam esnek bir film parçası yerleştirin.Kemilüminesan substratın iki bileşenini beş mililitrelik bir tüpte karıştırın ve karıştırılmış substratın 1,5 mililitresini hemen yarı saydam filme aktarın. PVDF membranını çözeltinin üzerine yerleştirin ve substrat çözeltisinin geri kalanını membranın üzerine aktarın. PVDF membranını karışık substrat ile bir dakika inkübe edin.PVDF membranını cımbızla alın ve alt tabaka solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. Membranı bir çift saydam film arasına sıkıştırın ve kemilüminesan modunda görüntüleyin. Western blot'un kemilüminesan tespiti için gerekli olan sırasıyla antijen ve antikor miktarları burada gösterilmiştir.Hem statik hem de CDR inkübasyonlarında IRE solüsyonlarının kullanımı duyarlılığı artırmıştır. Benzer şekilde, minimum anti-6s His tag antikor konsantrasyonu, statik koşullar altında mililitre başına 100 ila 50 nanogramdan ve CDR koşulları altında mililitre başına 100 ila 12.5 nanogramdan düşürüldü. 5 veya 10 dakikalık CDR inkübasyonu, statik inkübasyona kıyasla tespit sınırını önemli ölçüde düşürdü.Ayrıca, CDR'nin IRE ile kombinasyonu, son derece kısa kuluçka süresi içinde bile Western blot üzerinde üstün hassasiyet ortaya çıkardı. Bu yöntemin floresan algılamalı bir Western blot'a başarılı bir şekilde uygulanması burada gösterilmiştir. Floresan algılama, kemilüminesan algılamanın aksine, antikorları sıyırmadan ve yeniden problamadan aynı leke üzerinde aynı anda birden fazla hedefi tespit etme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir.Hücre lizatlarındaki his etiketli alkalin fosfataz ve beta-aktin, iki renkli bir florofor kullanılarak aynı anda tespit edildi. IRE ile CDR inkübasyonu sadece algılamayı hızlandırmakla kalmadı, aynı zamanda hassasiyeti de artırdı. İnkübasyon sırasında, zar tüpün duvarına bağlı kalmalıdır.Tüp yatay olarak döndürülmelidir, böylece çözelti membran yüzeyi üzerinde sürekli olarak yıkanır. Bu protokol, büyük ölçüde Batı lekeleme prosedürlerine bağlı olan araştırma verimliliğimizi önemli ölçüde hızlandırdı.

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

(Batı blot) İmmünoblotting antijen-antikor tanıma doğasında özgüllüğü istismar çalışır proteinlerin saptanması ve karakterizasyonu için hızlı ve duyarlı bir testtir. Bu video protein ayırma protokolleri, proteinler membranlar üzerine blot, immunoprobing, kromojenik veya kemilüminesan yüzeyler kullanarak görselleştirme sağlar.

Immüno Analizi

Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Öğrenin, immünreaksiyon arttırıcı teknoloji ve CDR kullanarak 20 dakikada tamamlanan ultra yüksek hızlı batı blot yöntemini. Hassasiyet kaybetmeden antijen tespiti sağlar.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

Daha fazla video keşfet