Name: Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, özgürce davranan farelerde amigdala bölgesinde kafaya monte minyatür mikroskop ile in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının sürekli izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Samsung Bilim ve Teknoloji Vakfı'nın (Proje Numarası SSTF-BA1801-10) hibeleri ile desteklendi.

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.

Burada anlattığımız gibi amigdala gibi daha derin beyin bölgelerinde kafaya monte minyatür mikroskopi ile in vivo optik kalsiyum görüntülemede başarılı olmak için ustaca cerrahi teknikleri şarttır. Bu nedenle, bu protokol temel ataşman ve GRIN lens implantasyonunun optimize edilmiş cerrahi süreçleri için bir kılavuz sağlasa da, kritik adımlar için ek optimizasyon süreçleri gerekebilir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, cerrahide amigdala koordinatları, taban plakası ek adımında hava akışı hızı, kalsiyum kaydında görü...

Kalsiyum her yerde bulunan ikinci bir habercidir, hemen hemen her hücresel işlevde çok önemli bir rol oynar8. Nöronlarda, eylem potansiyeli ateşleme ve sinaptik giriş hücre içi serbest [Ca2+]9,10'unhızlıdeğişmesineneden olur. Bu nedenle, kalsiyum geçicilerini izlemek nöronal aktiviteyi izlemek için bir fırsat sağlar. GECI'ler, tanımlanmış hücre popülasyonlarında ve hücre içi bölmelerde[Ca 2+] izlenmesine izin veren güçlü araçlardır11,12. Protein bazlı kalsiyum göstergesinin birçok farklı türü arasında, tek bir GFP molekülü13'edayanan bir Ca2+ probu olan GCaMP, en optimize edilmiş ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan GECI'dir. Birden fazla mühendislik turu sayesinde, GCaMP'nin bir dizi çeşidigeliştirilmiştir 12,14,15,16. Son geliştirilen GCaMPP'lerden birini kullanıyoruz, GCaMP7b, bu protokolde16. GCaMP sensörleri, geliştirme sırasında Ca2+ geçicilerinin görüntülenmesi, belirli bir kortikal tabakada in vivo görüntüleme18, motor görev öğreniminde devre dinamiklerinin ölçümü19ve hipokampus ve amigdala 20,21'deki ilişkisel korku hafızası ile ilgili hücre topluluğu aktivitesinin görüntülenmesi gibi bir dizi model organizmadanöraldevre fonksiyonlarının incelenmesine büyük katkıda bulunmuştur.
GECI'lerin optik görüntülemesinin çeşitli avantajları vardır22. Genetik kodlama, GECI'lerin genetik profil veya belirli anatomik bağlantı kalıpları ile tanımlanan belirli bir hücre alt kümesinde uzun süreli bir süre boyunca saptanmasını sağlar. Optik görüntüleme, canlı hayvanlarda yüzlerce ila binlerce nöronun in vivo kronik eşzamanlı izlenmesini sağlar. Kafa montajlı minyatür floresan mikroskoplar21, 23,24,25ile serbestçe davranan farelerin beynindeki GECI'lerin in vivo görüntüleme ve analizi için birkaç optik görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. GECI'lere dayanan in vivo optik görüntüleme tekniğine, GRIN lense ve kafaya monte minyatür mikroskobun nöral devre aktivitesi ve davranışı arasındaki bağlantıyı incelemek için güçlü bir araç olmasına rağmen, bu teknolojinin amigdalaya uygulanması, GÖRÜNTÜ alma kalitesini ciddi şekilde azaltan hareket yapıtlarına neden olmadan amigdaladaki GECI'leri ifade eden hücrelere GRIN lensin hedef alınmasıyla ilgili çeşitli teknik sorunlar nedeniyle zor olmuştur. Bu protokol, amigdalada başarılı in vivo optik kalsiyum görüntüleme için kritik adımlar olan baseplate eki ve GRIN lens implantasyonunun cerrahi prosedürleri için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol amigdalayı hedeflemesine rağmen, burada açıklanan çoğu prosedür genellikle diğer derin beyin bölgeleri için geçerlidir. Bu protokol belirli bir sisteme (örneğin Inscopix) dayansa da, aynı amaca diğer alternatif sistemlerle kolayca ulaşılabilir.

<table><tbody><tr><td>26G iğne</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Cerrahisi</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>AAV2 / 1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>ısmarlama</td><td></td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Akrilik-Diş çimentosu (Orto-jet Akrilik Pembe)</td> <td>Lang</td><td>1334-pembe</td><td>Cerrahi & Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Hava akışı manipülatörü</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Amoksisilin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Taban Plakası</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Taban plakası kapağı</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Davranışsal aparat (oda)</td><td>Coulbourn Enstrüman</td><td>Test Kafesi</td><td>Davranış testi</td></tr><tr><td>Davranışsal aparat (yazılım)</td><td>Coulbourn Enstrüman</td><td>Donma Çerçevesi</td><td>Davranış testi</td></tr><tr><td>Karbon kafes</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Veri işleme yazılımı</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Veri İşleme</td><td>Yazılımı Taban Plakası Ek & Davranış testi</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Cerrahi Matkap</td></tr><tr><td></td><td>Seyang</td><td>maratonu-4</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Matkap frez</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Cam iğne</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probu)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Hamilton Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Ameliyat</td></tr><tr><td>Kafa plakası</td><td>Neurotar</td><td>Model 5</td><td>Ameliyat</td></tr><tr><td>Altıgen anahtar</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Dizüstü bilgisayar</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Cerrahi & Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Lens tutucu, Stereotaksik çubuk (INSCOPIX proview implant kiti)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Mikroskop tutucu</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Taban Plakası</td></tr><tr><td>Eki Mikroskobu, DAQ yazılımı, donanım</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Taban Plakası Eklentisi & Davranış testi</td></tr><tr><td>Mobil ev kafesi</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr><tr><td>Moterize kol</td><td>Neurostar</td><td>Özelleştirilmiş</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Moterize kol yazılımı</td><td>Neurostar</td><td>Özelleştirilmiş</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>NI kurulu</td><td>Ulusal enstrüman</td><td></td><td>Davranış testi</td></tr><tr><td>Çıkarılabilir epoksi bağ</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Cerrahisi</td></tr><tr><td>Reçine çimentosu (Süper bağ)</td><td>Güneş medikal,</td><td>Süper bağ C& B</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Kafatası vidası</td><td>Çalmak</td><td>51457</td><td>Ameliyat</td></tr><tr><td>Stereotaksik elektrot tutucu</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Ameliyat</td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve</td><td>Çalmak</td><td>51600</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Stereotaksik manipülatör</td><td>Çalmak</td><td>51600</td><td>Taban Plakası Eki</td></tr></tbody></table>

Özgürce davranan farenin amigdalasında kafaya monte minyatür mikroskop ile başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesi, nöronal aktiviteyi davranışa bağlamak için temel yaklaşımlardan biridir. Bu amaçla, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), minyatürleştirilmiş bir floresan mikroskobu ve gradyan refraktif indeks (GRIN) lensi kullanarak nöronlardaki kalsiyum geçicilerini tespit eden bir in vivo görüntüleme tekniği geliştirilmiş ve birçok beyinyapısına 1, 2,3,4,5,6başarıyla uygulanmıştır. Bu görüntüleme tekniği özellikle güçlüdür, çünkü genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının birkaç haftaya kadar uzun süreli kronik eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Yararlı olmasına rağmen, bu görüntüleme tekniği, duygusal işlem ve ilişkilendirilebilir korku hafızası için gerekli bir beyin yapısı olan amigdala gibi beynin derinliklerine yer alan beyin yapılarına kolayca uygulanmamıştır7. Görüntüleme tekniğinin amigdalaya uygulanmasını zorlaştırıcı birkaç faktör vardır. Örneğin, hareket eserleri genellikle daha derin beyin bölgelerinde yapılan görüntüleme sırasında daha sık ortaya çıkar, çünkü beynin derinliklerine yerleştirilen bir kafaya monte mikroskop nispeten kararsızdır. Diğer bir sorun ise lateral ventrikülün implante grin lense yakın konumlandırılması ve solunum sırasındaki hareketinin kolayca düzeltilemeyen son derece düzensiz hareket yapıtlarına neden olmasıdır, bu da kararlı bir görüntüleme görünümü oluşturmayı zorlaştırır. Ayrıca, amigdaladaki hücreler genellikle dinlenme veya uyuşturulma durumunda sessiz olduğundan, daha sonraki görüntüleme için temelleme prosedürü sırasında amigdalada GECI'yi ifade eden hedef hücreleri bulmak ve odaklamak zordur. Bu protokol, bu kadar derin bir beyin bölgesinde başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme için kafa montajlı minyatür mikroskop ile amigdaladaki GECI'yi ifade eden hücrelerin nasıl verimli bir şekilde hedeflenerek hedeflendirılacağına dair yararlı bir kılavuz sağlar. Bu protokolün belirli bir sisteme (örneğin, Inscopix) dayandığı, ancak bununla sınırlı olmadığı belirtilmiştir.

GRIN lens implantasyonunun doğrulanması Taban plakasını çimentolama ile beyne kronik olarak takmadan önce, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması gerekir. Başarılı lens implantasyonu olan hayvanlarda, hem GCaMP ekspresyasyon hücreleri hem de kan damarları, mikroskopun objektif lensi ile implante grin lens arasındaki mesafe ile belirlenen bir odak düzlemi aralığında açıkça gözlenmiştir (Şekil 2A ve B). Buna karşılık, hedef dışı implanta...

In vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme, özgürce davranan hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan paha biçilmez bir araçtır. Ancak bu tekniği amigdalaya uygulamak zor olmuştur. Bu protokol, farelerde minyatürleştirilmiş bir mikroskopla amigdala hücrelerini başarıyla hedeflemek için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Amigdalanın in vivo kalsiyum görüntülemesi için minyatür mikroskopi kullanılırken birçok zorluk ortaya çıkabilir. Bu protokol, başarılı in vivo kalsiyum görüntülemesi elde etmek için zaman kazandıran kılavuzlar sağlar. İn vivo kalsiyum görüntüleme, genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının birkaç haftaya kadar bir süre boyunca sürekli eşzamanlı görüntülenmesine izin verir, bu daha önce mümkün olmayan bir süreçtir.AAV enjeksiyonu için, anestezi uygulanmış fare stereotaksik bir çerçeveye sabitlenmişken, bregma ve lambda'nın yüksekliğini pim ile hizalayın ve kraniyotomi için açıkta kalan ve dezenfekte edilmiş kafatasındaki belirli yeri belirleyin. Dakikada 18.000 devir matkap hızıyla dikkatlice 1.6 milimetre kraniotomi yapmak için 0.6 milimetre uç ile donatılmış bir matkap kullanın ve kafatasını steril PBS ile yıkayın. Bregma ile açıkta kalan beyin yüzeyi arasındaki dorsoventral farkı, A mesafesini hesaplamak için bir bregmaya dayalı lens implantasyonunun dorsoventral koordinatı olan 4.2 milimetreden çıkarın ve üç mikrolitre mineral yağ ve 0.7 mikrolitre yükleyin AAV çözeltisinin mililitresi başına 10 ila 13. viral genomlar.Pipetin çerçeveye sabitlenmesini sağlamak için pimi stereotaksik prob tutucusundan çıkarın ve pipeti hazırlanan enjeksiyon bölgesinin üzerine yerleştirin. Kanama tamamen durduğunda, cam pipet ucunu dorsoventral bregma koordinatından beyin dokusuna 4,3 milimetre sokun ve pipeti yavaşça çıkarmadan önce tüm virüs hacmini iletmek için bir enjeksiyon pompası kullanın. Virüsün tamamı enjekte edildiğinde, iki kafatası vidasının implantasyonuna izin vermek için kafatasını gösterildiği gibi iki kez daha delin ve kafatası fraksiyonlarını PBS ile yıkayın.Ardından, %70 etanol ile sterilize edilmiş vidaları mümkün olduğunca derine implante edin ve stereotaksik çerçeveye motorlu bir ameliyat kolu takın. Gerekli donanımı, kontrol yazılımının kurulu olduğu bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve 26 gauge iğneyi stereotaktik çerçeveye sağlam bir şekilde sabitlemek için bir kanül tutucu kullanın. İğne yerleştirme bölgesinin koordinatlarını hesapladıktan sonra, iğne ucunu beynin açıkta kalan yüzeyine yerleştirmek için stereotaksik manipülatörü kullanın ve beyin dokusunu iki ila üç damla PBS ile nemlendirin.Uygun dorsoventral ve lateral amigdala koordinatlarını yazılıma girin ve iğneyi indirmek için GoTo'ya tıklayın. İğne tamamen durduğunda, başlangıç konumu kutusuna 45 milimetre girin ve iğneyi kaldırmak için GoTo'ya tıklayın. İğne hareket etmeyi bıraktığında, PBS'yi beyin yüzeyinden çıkarın ve iğneyi ve kanül tutucuyu stereotaksik çerçeveden çıkarın.Lens tutucuyu stereotaksik çubuğa takın ve GRIN lensini lens tutucuya sabitleyin. Lensi %70 etanol ile sterilize edin ve stereotaksik çubuğu stereotaksik çerçeveye takın. GRIN merceğinin ucunu beyin yüzeyinde belirlenen bölgeye yerleştirin ve lens implantasyonu için dorsoventral koordinatı belirlemek için A'nın mutlak değerini beyin yüzeyinin dorsoventral koordinatından çıkarın.Beyin dokusunu iki ila üç damla PBS ile nemlendirin ve indirme derinliğini 1.000 mikrometreye ve yükseltme yüksekliğini 300 mikrometreye ayarlamak için motorlu kolu kullanın. GRIN lensi hedef bölgeye ulaştığında, PBS'yi çıkarın ve GRIN lensinin, vidalarının ve vidalı yan duvarlarının etrafına reçine diş çimentosu dikkatlice uygulayın. Diş çimentosu sertleştiğinde, lens tutucuyu lensten çıkarın ve kafatası yüzeyine akrilik çimento uygulayın.Ardından, lens tutucuyu çubuğun ucuna yatay yönde bantlanmış bir kafa plakasıyla değiştirin. Lens, kafa plakasının iç halkasının sağ kenarına yerleştirilene kadar kafa plakasını 1.000 mikrometre indirmeden önce, kafa plakası lens manşetinin üst kısmına yerleştirilene kadar çubuğu yavaşça indirin. Kafa plakasını çimento katmanlarına tutturmak için akrilik çimento kullanın ve implante edilmiş GRIN lens yüzeyini tozdan korumak için parafin film kullanın, ardından filmi lens yüzeyine sabitlemek için parafin film üzerine çıkarılabilir epoksi bağ uygulayın ve hayvanı kafesine geri koyun tam yaslanana kadar izleme ile.GRIN lens implantasyonunun kalitesini değerlendirmek için, anestezi uygulanmış farenin altına, bir mobil ev kafes sisteminin baş çubuğuna bir karbon kafes yerleştirin ve kafesin sürtünme olmadan serbestçe hareket etmesi için hava akışını açın. İmplante edilmiş GRIN merceğinin yüzeyi yazılım içindeki görüntü alanında görünene kadar mikroskobu indirmeden önce minyatür bir mikroskobu çerçeveye dikey olarak hizalamak için bir mikroskop tutucu ve bir stereotaksik manipülatör kullanın. İmplante edilmiş GRIN merceğinin merkezini görüş alanının merkeziyle hizalayın ve implante edilmiş GRIN mercek yüzeyinin görüntüsünü yakalayın, ardından GCaMP eksprese eden hücrelerin görünümü için görüntüyü gözlemlerken mikroskobun objektif merceğini yavaşça kaldırın.Başarılı bir lens implantasyonuna sahip hayvanlarda, hem GCaMP eksprese eden hücreler hem de kan damarları tek bir odak düzlemi aralığında net bir şekilde gözlemlenebilir. Buna karşılık, hedef dışı implantasyonu olan hayvanlarda, kan damarları bir miktar zorlukla gözlemlenebilmesine rağmen, odak düzlemi aralığında GCaMP eksprese eden hücrelerin net bir görüntüsü gözlenmez. Görüş alanı dışında kalan bir lens söz konusu olduğunda, ne kan damarları ne de GCaMP eksprese eden hücreler görselleştirilemez ve implante edilen GRIN lensi üzerinde parlak bir kenar gözlemlenebilir.Başarılı bir GRIN lens implantasyonu olan hayvanlarda, yaklaşık 50 ila 150 olası spontan aktif hücre, tipik olarak, ton olmadan bile lateral amigdaladaki görüş alanı içinde önemli bir floresan değişikliği gösterir. Ton sunumu üzerine, delta F görüntü analizi ile belirlendiği gibi, yalnızca birkaç hücre GCaMP sinyalinde tona özgü bir değişiklik gösterir. Aynı analiz, kontrol olarak GFP eksprese eden AAV enjekte edilen fareler üzerinde gerçekleştirildiğinde, GFP eksprese eden hücreler odak düzlemi aralığında tespit edilir ve hiçbir hücre tonlu veya tonsuz önemli bir floresan değişikliği göstermez.GCaMP ekspresyonunun ve GRIN lens hedeflemesinin histolojik doğrulaması, GRIN lens etrafındaki beyin dokusu iltihabına bağlı doku hasarı belirtisi göstermez. İğnenin veya merceğin hızı tutarlı değilse, hareket artefaktlarına ve düşük görüntü kalitesine neden olabilir. Motorlu bir ameliyat kolu kullanmak yardımcı olabilir.Taban plakası takma adımı sırasında mobil evde bakım sistemi hazır değilse, taban plakası takma sırasında fareyi uyuşturmak için düşük konsantrasyonda izofluran gazı kullanılabilir.

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal...

Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Thapa, R., et. al., Derin Beyin için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Gradyan İndeksli Lens İmplantasyonu In Vivo Kalsiyum Görüntüleme.  J. Vis. Uzm. (2021)Video, transdüksiyonlu bir farede bir miniskop kullanarak nöronal aktiviteyi davranışla ilişkilendiren gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir.

Bir farenin gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemesi Bir miniskop kullanarak medial prefrontal korteks

Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Bu protokol, bir koku tüyünde gezinen farelerde hipokampal CA1'deki beyin-davranış ilişkisini araştırır. Hipokampusun görüntülenmesine erişmek için ameliyat, davranışsal eğitim, beynin miniskop GCaMP6f kaydı ve işlenmesi ve ROI nöral aktivitesinden fare pozisyonunun kodunu çözmek için davranışsal veriler dahil olmak üzere adım adım bir protokol sunuyoruz.

Bir koku bulutunda gezinen farelerin hipokampusunda kalsiyum sinyallerini kaydeden miniskop

Bu protokol, sosyal durum manipülasyonu (sosyal izolasyon ve sosyal birleşme) sırasında serbest davranan farelerde minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak hipotalamik nöronların in vivo kalsiyum görüntülemesini detaylandırır. Bu yöntem, sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğu temsil eden hipotalamik aktivitenin tek nöron çözünürlükte görüntülenmesini sağlar ve sosyal homeostazın mekanik çalışmalarını mümkün kılar.

In Vivo'da Farelerde Sosyal Davranışları Anlamak İçin Hipotalamus'ta Minyatürize Mikroskopla Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin, özgürce davranan farelerde amigdala bölgesinde kafaya monte minyatür mikroskop ile in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının sürekli izlenmesini sağlar.

Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet