Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon
6 Ekim 2020
Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.
Gen transfeksiyonu, nörobiyoloji çalışmaları için hayati bir yaklaşımdır. Elektroporasyon tekniğimiz, organotipik hipokampus dilim kültüründe ilgilenilen gen internöronlarını saptanabilir bir yan etki olmaksızın transfekte etmemizi sağlar. Bu protokol, diğer tek hücre protokollerine kıyasla çok daha yüksek bir transfeksiyon verimliliğine sahiptir, ancak yine de nispeten ucuz ve gerçekleştirilmesi kolaydır.
Bu teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik işlevlerini anlamakla ilgilenen araştırmacılar için faydalı olacaktır. Elektroporasyon için dilim kültürleri hazırlamak için, ilgilenilen kültür eklerini 900 mikrolitre kültür ortamı ile yüklenmiş ayrı üç santimetrelik petri kaplarına aktarın ve kültürleri bir masa üstü karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, taze kültür eklerini 3,5 santimetrelik bir petri kabında uç başına bir mililitre dilim kültür ortamı ile en az 30 dakika önceden inkübe edin ve elektroporasyon teçhizatının hatlarını beş dakika boyunca %10 ağartıcı ile sterilize edin.
Perfüzyonun sonunda, 0.001 milimolar tetrodotoksin içeren filtre ile sterilize edilmiş ACSF ile perfüze etmeden önce hatları iyonize otoklavlanmış su ile en az 30 dakika durulayın. Elektroporatör darbesini eksi beş voltluk bir genliğe, bir kare darbeye, 500 milisaniyelik bir trene, 50 hertz'lik bir frekansa ve 500 mikrosaniyelik bir darbe genişliğine ayarlayın. Bir cam pipeti beş mikrolitre plazmid içeren iç solüsyonla doldurun ve sıkışan kabarcıkları çıkarmak için ucu birkaç kez hafifçe vurun ve hafifçe vurun.
Ucun hasar görmediğini doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve pipet ucunu elektroda güvenli bir şekilde takın. Uç ACSF ile temas ettiğinde, elektroporatörün pipet direnci okumasını kaydedin. Bir dilim kültürünü izole etmek için, kültür ekleme zarını keskin bir bıçakla kesin ve dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarmak için keskin açılı forsepsler kullanın.
Ardından kültür konumunu bir dilim ankraj ile sabitleyin. İlgilenilen hücrelerin elektroporasyonu için, pipete ağızdan pozitif basınç uygulayın ve pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yere hareket ettirmek için üç boyutlu düğme kontrollerini kullanın. Kültürü mikroskopla görüntüleyerek, hücre yüzeyinde bir çukur oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak hedef hücreye uç ile yaklaşın.
Çukurun görüntülenmesi üzerine, pipet ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşması için ağızdan hızlı bir şekilde hafif negatif basınç uygulayın. Membran pipete hafifçe girecektir. Hoparlörlerden gelen tondaki artışla gösterildiği gibi, pipetin ilk direncinde yaklaşık 2,5 katlık bir artış gözlemlenmelidir.
Çukurun reform yapması için hızlı bir şekilde pozitif basınç uygulayın. Ardından, az önce gösterildiği gibi duraklamadan hemen en az iki basınç döngüsü daha tamamlayın. Son basınç darbesinden sonra, negatif basıncı bir saniye basılı tutun.
Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepeye ulaştığında, elektroporatörü hızlı bir şekilde darbelemek için ayak pedalını kullanın. Elektroporasyondan sonra, pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 mikron uzağa nazikçe geri çekin ve bir sonraki hücreye yaklaşmadan önce direncin temel okumaya benzer olduğunu doğrulayarak pozitif basıncı yeniden uygulayın. İlgilenilen tüm hücreler elektroporasyona tabi tutulduğunda, dilim kültürünü hazırlanan taze kültür eklerinden birine aktarın ve eki üç güne kadar 35 santigrat derecede yerleştirin.
Bu temsili deneyde, EGFP, yedi, 14 ve 21 günlük in vitro dilim kültür yaşları boyunca hipokampal CA1 alanındaki beş ila 20 piramidal nörona transfekte edildi. Parvalbumin ve veziküler glutamat tip 3 internöronları da hipokampal CA1 alanı içinde başarılı bir şekilde elektropore edilebilir. İlginç bir şekilde, transfeksiyon, in vitro dilim kültür yaşından önemli ölçüde etkilenmez ve CA1 piramidal nöronlarında gözlenen transfeksiyon etkinliği ile farklılık göstermez.
Nöronlar çok kırılgandır. Hücrelere yaklaşırken ve basınç döngüsüne girerken ve pipet ucunu ciddi hasara neden olacak şekilde geri çekerken son derece dikkatli ve nazik olmalısınız. Elektroporasyondan sonra hücreler, elektrofizyoloji ve görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli deneysel analizlere tabi tutulabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, organotipik hipokampal kesit kültürlerindeki hem eksitatör hem de inhibitör nöronlarda gen iletimini sağlayan tek hücreli elektroporasyon için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, gen ekspresyonu üzerinde hassas kontrol sağlayarak, çeşitli gelişimsel aşamalardaki hem hücreye özgü mekanizmaların hem de hücreler arası etkileşimlerin araştırılmasını kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gen Transfeksiyonu
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Gen transfeksiyonu, nörobiyolojik araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
- Elektroporasyon, minimum yan etki ile yüksek bir transfeksiyon verimliliği sunar.
- Bu yöntem, diğer tekniklere kıyasla nispeten basit ve düşük maliyetlidir.
- Nöronlardaki moleküler ve fizyolojik fonksiyonların anlaşılması, nörobiyoloji için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Nöronal popülasyonlarda gen transfeksiyonu için etkili bir yöntem geliştirmek.
- Hem eksitatör hem de inhibitör nöronlardaki spesifik moleküler fonksiyonları ve mekanizmaları incelemek.
- Kesit kültürlerinin farklı yaşlarındaki transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Organotipik hipokampal kesit kültürlerinde elektroporasyon gerçekleştirildi.
- Temel biyolojik modeller olarak piramidal nöronlar ve internöronlar kullanıldı.
- Transfeksiyon, çeşitli yaşlardaki kesitlerde (in vitro 7, 14 ve 21 gün) değerlendirildi.
- Detaylı adımlar; hazırlık, pipetleme teknikleri ve direnç değişimlerinin izlenmesini içermektedir.
- İşlem sırasındaki hücre hasarları, dikkatli manipülasyonlarla minimize edildi.
Ana Sonuçlar
- Kesit kültürü yaşları arasında anlamlı bir fark olmaksızın, hedeflenen nöronlarda yüksek gen transfeksiyon verimliliği elde edilmiştir.
- Elektroporasyon, hücre canlılığını olumsuz etkilememiş ve transfeksiyon sonrası hücresel bütünlüğü korumuştur.
- Bu yöntem, fizyolojik yanıtlar ve nöronlar arasındaki potansiyel etkileşim mekanizmaları üzerine ayrıntılı çalışmalar yapılmasını sağlamıştır.
- Pars ve veziküler glutamat tip 3 internöronların başarılı bir şekilde transfekte edildiği de gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nörobiyolojideki araştırma kapasitelerini artıran, nöronal kültürlerde gen transfeksiyonu için sağlam bir protokol sunmaktadır.
- Yöntem, nöronal mekanizmalar ve hücreler arası fonksiyonlar üzerine yapılacak ileri araştırmalar için temel oluşturmaktadır.
- Bu süreçlerin anlaşılması, nöronal plastisiteye dair içgörüler ve potansiyel terapötik uygulamalar için hayati önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Alaka düzeyi
Organotipik hipokampal dilim kültürlerinde tek hücreli elektroporasyon, eksitatör ve inhibitör nöronlarda hassas gen iletimini mümkün kılarak nörobilim keşiflerinde hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Bu yöntem, gelişimsel aşamalar boyunca yüksek transfeksiyon verimliliği (~80%) sağlayarak, yolak sorgulama için tutarlı fenotipik tarama ve analiz geliştirmeye olanak tanır. Bu yaklaşım, hastalıkla ilişkili nöronal sistemlerde tekrarlanabilir ve kantitatif gen ekspresyon çalışmalarını mümkün kılarak, erken hedef hipotez testlerindeki biyolojik belirsizliği azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hipokampal eksitatör ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Gen ekspresyonunu sağlam mikrodevrelerdeki fizyolojik okumalarla ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Tespit edilebilir yan etkiler olmaksızın yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayarak deneysel değişkenliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Dilim kültür yaşları genelinde (in vitro 7–21 gün) çalışarak hedef etkileşiminin zaman seyri çalışmalarına imkan tanır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt akışlı elektrofizyoloji ve görüntüleme analizleri için valide edilmiş nöronal sistemler hazırlar.
- Bilimsel Değer: Gen fonksiyonu ve protein etkileşimleri hakkında kantitatif, tek hücre çözünürlüğünde veriler sunar.
- Operasyonel Değer: Standart elektrofizyoloji ekipmanlarını kullanarak mevcut iş akışlarına ölçeklenebilir entegrasyon sağlar.
- Operasyonel Değer: Uzatılmış kültür süreleri boyunca transfeksiyon verimliliğini koruyarak boylamsal tarama kampanyalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Patofizyolojik bağlamlarda hedef mekanizmaları incelemek için hastalıkla ilgili hipokampal devreler sağlar.
- Bilimsel Değer: Transsinaptik protein etkileşimlerinin ve hücre-otonom mekanizmaların değerlendirilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Transfeksiyondan sonra nöronal sağlığı koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Primer nöronal kültürlerde güvenilir ve tekrarlanabilir gen iletimi aracılığıyla, riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncül bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur ve bileşik taraması öncesinde mekanistik risk azaltma işlemini mümkün kılar.
- Keşif Biyolojisi: Hipokampal nöronal popülasyonlarda hipotez testlerini ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir transfeksiyon ve kantitatif çıktılara sahip, analize hazır sistemler sunar.
- Analitikler: Gen ekspresyonunu fonksiyonel fenotiplerle ilişkilendirmek için direnç tabanlı izlemeye ve elektrofizyolojik okumalara olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Organotipik kesitlerde stabil transfeksiyon aracılığıyla gen fonksiyonu çalışmalarını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Mevcut elektrofizyoloji altyapısından yararlanarak, yöntemi nöronal hedef doğrulama için yeniden kullanılabilir bir platform olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Primer nöronlarda yüksek verimli ve düşük toksisiteye sahip gen iletimi yoluyla hedef doğrulamasında öngörücü güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Tutarlı puls parametreleri ve basınç döngüsü protokolü sayesinde standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Nöronal hedef etkileşimindeki mekanistik belirsizlikleri azaltarak daha iyi git/gitme kararları verilmesi.
- Portföy Etkisi: Farklı nöronal sınıflar ve gelişimsel evreler genelinde gen fonksiyonunun güvenilir değerlendirmesi yoluyla riskten arındırılmış önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Tek hücre hedeflemesi için elektrofizyoloji ve mikropipet manipülasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Cam elektrotlara, elektroporatöre ve nöronal sağlık için tetrodotoksin içeren steril ACSF'ye bağımlıdır.
- Basınç-darbe sekanslarının standartlaştırılmasını ve kullanıcılar arasında direnç izlemini gerektirir.
- Adaptasyon hususları arasında, farklı nöron tipleri veya gen boyutları için plazmid konsantrasyonunun ve darbe genişliğinin ayarlanması yer alır.
- Pratik sınırlama: Nöronal kırılganlık, basınç döngüleri sırasında membran yırtılmasını önlemek için titiz bir teknik uygulanmasını zorunlu kılar.
