Name: Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Öğrenin fare hipokampal organotipik dilim kültürlerinde tek hücreli elektroporasyon yöntemiyle uyarıcı ve inhibitör nöronlara gen aktarımını. Bu protokol yüksek verimlilikle hücre özerk mekanizmaları ve sinaptik etkileşimleri incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri (R01NS085215 ila K.F., T32 GM107000 ve F30MH122146 ila A.C. ) tarafından desteklendi. Yazarlar, Bayan Naoe Watanabe'ye yetenekli teknik yardım için teşekkür ediyorlar.

Tüm hayvan protokolleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelendi ve onaylandı. Dilim kültürü hazırlama, plazmid hazırlama ve elektroporasyon da daha önce yayınlanan yöntemlerimizde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ek bilgi için başvurulabilir10.
1. Dilim kültürü hazırlığı
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi fare organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlayın11, her iki cinsiyetin doğum sonrası 6 ila 7 günlük farelerini kullanarak.<ol>
<li>Diseksiyon ortamını (mM olarak): 238 sakkarozdan oluşan organotipik dilim kültürü için hazırlayın, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4ve deiyonize suda 11 glikoz, daha sonra% 5 CO2/ 95% O2 ile 7.4 pH'a gaz.</li>
		<li>Organotipik dilim kültür medyasını hazırlayın: %78,8 (v/v) Minimum Esansiyel Orta Kartal, %20 (v/v) at serumu, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glikoz, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insülin (1 μg/mL) ve 0,06 mM askorbik asit, pH 7,3'e ayarlanmıştır. Omometre kullanarak omuzolariteyi 310-330 osmol'e ayarlayın.</li>
		<li>Hipokampiyi iki spatula kullanarak tüm beyinden ayırın ve bir doku helikopteri kullanarak dilimleyin (400 μm). İki ton sesi kullanarak dilimleri ayırın ve kesici uçların altındaki kültür ortamı (950 μL) ile dolu 6 kuyu plakasında 30 mm hücre kültürü kesici uçlarına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organotipik dilim kültürlerini bir doku kültürü inkübatöründe (%35°C, %5 CO2)saklayın ve dilim kültürü ortamını iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>2. Plazmid hazırlığı
<ol><li>Plazmidi ilgi genine hazırlayın.<ol>
<li>Bir pCAG vektörüne yeşil floresan protein (EGFP) geninin alt sıvısı.</li>
		<li>pCAG-EGFP plazmidini endotoksin içermeyen bir arıtma kiti ile arındırın ve 140 mM K-metansülfonat içeren dietil pirokarbonat arıtılmış sudan oluşan bir iç çözeltide çözün, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2ve 10 mM HEPES, KOH ile pH 7,3'e ayarlanmıştır (plazmid konsantrasyonu: 0,1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cam pipet hazırlama
<ol><li>Bir mikropipette çekme üzerine borosilikat cam pipetleri (4,5 – 8 MΩ) çekin (Şekil 1A). NOT: Tüm hücreli yama kelepçe kayıtları için kullanılan cam pipetler elektroporasyon için idealdir.</li>
	<li>Sterilize etmek için cam pipetleri 200°C'de geceleyin pişirin.</li>
	<li>Elektrik direncini yaklaşık olarak görmek için pipet ucunun boyutunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.<ol>
<li>İsteğe bağlı:Pipeti elektroporasyon elektroduna bağlayarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve 11 glikoz deiyonize suda, % 5 CO2 /95O2 ile 7.4 pH'a gazlanır. Elektroporatördeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın. NOT: Pipet ucu ne kadar keskinse, elektrik direnci o kadar büyük olacaktır. Pipet direnci 10 MΩ'nin altında olmalıdır. Yüksek pipet direncine sahip cam pipetler (Şekil 1B) genellikle tekrarlanan elektroporasyon sırasında ucu tıkanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elektroporasyon teçhizatı kurulumu
<ol><li>Elektroporatörü, bir mikromanipülatör ve peristaltik pompa ile değişen bir masaya monte edilmiş dik bir mikroskopla donatılmış standart bir tam hücre elektrofizyoloji makinesine takın.</li>
	<li>Elektroporatörün başlığını bir mikromanipülatöre takın ve bir çift hoparlörü elektroporatöre bağlayın. Elektroporatörü, hazır olduğunda nabız göndermek için kullanılabilecek bir ayak pedalı ile bağlayın. NOT: Hoparlörler açıldığında bir ton yayar, bu da elektrot üzerindeki elektrik direncinin bir göstergesidir. Bu, dikkatleri prosedürden uzaklaştırmadan dirençteki göreceli değişiklikleri belirlemeyi mümkün kılar.</li>
</ol>5. Elektroporasyon hazırlığı
<ol><li>Dilim kültürü kesici uçlarını 6 kuyu tabağından 900 μL kültür ortamı ile yüklenmiş 3 cm Petri tabaklarına aktarın ve elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar bir masa üstü CO2 inkübatörde saklayın.<ol>
<li>Taze kültür eklemelerini, elektrik çarpmasından sonra kültür dilimlerine 3,5 cm Petri kabında en az 30 dakika boyunca dilim kültür ortamı (1 mL) ile ön kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Makineyi temizleyin ve elektroporasyona hazırlayın.<ol>
<li>Gün için deneye başlamadan önce boruyu ve hazneyi sterilize etmek için hatları 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ile perfuse edin.</li>
		<li>Tamamen durulamak için hatları deiyonize otoklavlı suyla en az 30 dakika boyunca perfuse edin.</li>
		<li>Hatları 0.001 mM tetrodotoxin (TTX) içeren filtre sterilize edilmiş aCSF ile destekleyin. NOT: TTX, internöronların aşırı heyecanlanması nedeniyle hücresel toksisiteyi ve ölümü en aza indirir10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporatörun darbe parametrelerini ayarlayın: –5 V genliği, kare darbe, 500 ms tren, 50 Hz frekans ve 500 μs darbe genişliği.</li>
	<li>Cam pipeti 5 μL plazmid içeren iç çözelti ile doldurun.<ol>
<li>Kıstırılan hava kabarcıklarını pipet ucundan hafifçe dokunarak ve ucuna birden fazla kez dokunarak çıkarın.</li>
		<li>Ucu diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek veya pipet direncini kontrol etmek için 3.3.1 adımını tekrarlayarak hasara karşı kontrol edin. NOT: Uç hasarlıysa, cam pipet atılmalıdır ve bu adım daha önce 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipet ucunu elektrota güvenli bir şekilde takın ve hoparlörleri açın. Uç aCSF ortamıyla temas ettiğinde elektroporatörnün okumasını (pipet direnci) kaydedin.</li>
	<li>Keskin bir bıçak kullanarak kültürün ekleme zarını kesin ve bir dilim kültürünü izole edin. Keskin açılı empepiler kullanarak dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarın ve konumunu bir dilim ankrajı ile sabitleyin.<ol>
<li>Dilim kültürünü, nöronal sağlıktaki değişiklikler veya işlev12gibi yan etkileri önlemek için bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatörün dışında tutmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. İlgi çekici elektroporat hücreleri
<ol><li>Pipete ağızla veya boruya bağlı 1 mL şırıngar (0,2 - 0,5 mL basınç) kullanarak pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>Pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yerde manevra yapmak için mikromanipülatör 3 boyutlu düğme kontrollerini kullanın.</li>
	<li>Bir hedef hücre seçin ve mikroskopta görünür olan hücre yüzeyinde bir gamze oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak ona yaklaşın.</li>
	<li>Basınç döngüleri gerçekleştirin.<ol>
<li>Boru ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşur, böylece membran pipet ucuna biraz yukarı çıkar. Hoparlörlerden gelen tonda bir artış dinleyerek pipet direncinde bir artış (~2,5 kat başlangıç direnci) gözlemleyin. Gamzenin yeniden şekillenebilmesi için pozitif basıncı hızlı bir şekilde yeniden uygulayın.</li>
		<li>Duraklatmadan en az iki basınç döngüsünü daha hemen tamamlayın, ardından 1 sn boyunca negatif basınç tutun. NOT: Döngüler arasında duraklamak, çok fazla basınç uygulamak veya negatif basıncı çok uzun süre tutmak önemli hücre hasarına neden olabilir ve muhtemelen elektroporasyon sırasında hücrenin ölmesine neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepe noktasına ulaştığında ayak pedalını kullanarak elektroporatöre hızlı bir şekilde darbe yapın ve bu da en yüksek elektrik direncini gösterir. Nabzı göndermeden önce 1 s'den fazla tepe direncinde beklemeyin. NOT: Bu protokolü kullanırken hedef dışı elektroporasyon gözlemlemedik10. Sadece basınç döngüleri sırasında cam pipetle temas eden hücreler transkröme edildi. Pipetin diğer nöronların yakınında konumlandırılması gen transfeksiyonla sonuç vermez.</li>
	<li>Pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 μm geri çek.</li>
	<li>Direncin 5.5.<ol>
<li>Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artmış (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile belirtilen potansiyel tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak çıkarın. NOT: Görünür bir tıkanıklık yoksa ve direnç hala önemli ölçüde daha yüksekse, pipeti atın ve yeni bir tane kullanın. Ortalama olarak, kullanıcı dikkatli olursa 20 elektroporasyon olayı için bir pipet kullanılabilir10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporasyondan sonra, dilim kültürünü taze bir kültür kesici ucuna aktarın ve 3 güne kadar inkübatörde 35 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>7. Organotipik hipokampal dilim kültürlerinin sabitlenmesi, lekelenmesi ve görüntülenmesi
<ol><li>Elektroporlu organotipik dilim kültürlerini transeksiyondan 2 – 3 gün sonra% 4 paraformaldehit ve% 4 sakkaroz ile 0.01 M fosfat tamponlu salin (1x PBS) oda sıcaklığında 1.5 saat sabitleyin.</li>
	<li>2 saat boyunca 0,1 M fosfat tamponunda (1x PB) %30 sakkarozda sabitleyici ve kuluçka dilimlerini çıkarın.</li>
	<li>Dilimleri bir slayt camına yerleştirin ve slayt camını ezilmiş kuru buzun üzerine koyarak dondurun. Dilimleri oda sıcaklığında çözün ve 1x PBS ile dolu 6 kuyu plakasına aktarın.</li>
	<li>Dilimleri GDB tamponunda fare anti-GFP ve tavşan anti-RFP antikorları (%0,1 jelatin, %0,3 Triton X-100, 450 mM NaCl ve %32 1x PB, pH 7,4) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca lekeleyin.</li>
	<li>Her yıkama için oda sıcaklığında üç kez 1x PBS ile dilimleri yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca GDB tamponunda anti-fare Alexa 488 konjuge ikincil antikor ve anti-tavşan Alexa 594 konjuge ikincil antikor ile dilimleri kuluçkaya yatırın. Dapi (4 μg/mL) ile dilimleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS'de kuluçkaya yatır.</li>
	<li>1x PBS'li dilimleri oda sıcaklığında üç kez yıkayın ve her yıkamada 3 dakika yıkayın.</li>
	<li>Montaj ortamını kullanarak dilimleri cam slaytlara monte edin ve floresan görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).</li>
<li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li>
<li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li>
<li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li>
<li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWiegert%2C+JS+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2017 (2), 094904(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604(2017).</li>
<li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603(2012).</li>
<li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+on+microchips%3A+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817(2015).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Burada hem uyarıcı hem de inhibitör nöronları yüksek verimlilik ve hassasiyetle transfect eden bir elektroporasyon yöntemini tarif ediyoruz. Optimize edilmiş elektroporasyon protokolümüz, yüksek verimli gen transfeksiyonunu elde etmek için üç yenilikçi atılım gerçekleştirmektedir. İlk modifikasyonumuz pipet boyutunu daha önce yayınlananprotokollerekıyasla artırmaktı 3,5,6. Bu değişiklik, pipet tıkanmadan birçok nörona elektropor...

Moleküler biyolojide, bir araştırmacının en önemli hususlarından biri, işlevini ortaya çıkarmak için bir hücreye veya hücre popülasyonuna ilgi çekici bir genin nasıl teslimılacağıdır. Farklı teslimat yöntemleri biyolojik (örneğin, viral bir vektör), kimyasal (örneğin, kalsiyum fosfat veya lipit) veya fiziksel (örneğin, elektroporasyon, mikroenjeksiyon veya biyoliztik) olarak kategorize edilebilir1,2. Biyolojik yöntemler oldukça verimlidir ve hücre tipine özgü olabilir, ancak spesifik genetik araçların geliştirilmesi ile sınırlıdır. Kimyasal yaklaşımlar çok güçlü in vitrodur, ancak transeksiyonlar genellikle rastgeledir; ayrıca, bu yaklaşımlar çoğunlukla yalnızca birincil hücreler için ayrılmıştır. Fiziksel yaklaşımlar arasında biyolistik teknik açıdan en basit ve en kolay olanıdır, ancak yine nispeten düşük verimlilikte rastgele transfeksiyon sonuçları üretir. Genetik araçlar geliştirmeye gerek kalmadan belirli hücrelere transfer gerektiren uygulamalar için, tek hücreli elektroporasyon3,4'e bakıyoruz.
Elektroporasyon sadece alan elektroporasyonunu ifade etmek için kullanılırken, son yirmi yıl içinde, özgüllüğü ve verimliliği artırmak için çoklu in vitro ve in vivo tek hücreli elektroporasyon protokolleri geliştirilmiştir5,6,7, elektroporasyonun genleri tek tek hücrelere aktarmak için kullanılabileceğini ve bu nedenle son derece hassas olabileceğini göstermiştir. Ancak, prosedürler teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir. Gerçekten de, daha yeni makaleler mekanize elektroporasyon makinelerinin fizibilitesini araştırdı8,9, bu tür robotikleri kurmakla ilgilenen araştırmacılar için bu engellerin birkaçını ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Ancak daha basit araçlar arayanlar için, elektroporasyon, yani hücre ölümü, transfeksiyon yetmezliği ve pipet tıkanması ile ilgili sorunlar bir endişe olmaya devam ediyor.
Son zamanlarda daha büyük uçlu cam pipetler kullanan bir elektroporasyon yöntemi geliştirdik, daha hafif elektriksel darbe parametreleri ve eksistik nöronlarda önceki yöntemlere göre çok daha yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayan ve ilk kez fare organotipik dilim kültürünün hipokampal CA1 bölgesindeki somatostatin ekspresyon inhibitör internöronlar da dahil olmak üzere inhibitör internöronlardaki genleri dönüştürmemizi sağlayan benzersiz bir basınç döngüsü adımı10. Ancak bu elektroporasyon yönteminin farklı inhibitör internöron tiplerinde ve nöronal gelişim evrelerinde güvenilirliği ele alınmamıştır. Burada, bu elektroporasyon tekniğinin genleri hem uyarıcı nöronlara hem de farklı internöron sınıflarına aktarabildiğini gösterdik. Daha da önemlisi, test edilen in vitro (DIV) dilim kültürü yaşı ne olursa olsun transfeksiyon verimliliği yüksekti. Bu yerleşik ve kullanıcı dostu teknik, in vitro fare beyin dokusu bağlamında farklı hücre tipleri için tek hücreli elektroporasyon kullanmak isteyen herhangi bir araştırmacıya şiddetle tavsiye edilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Plazmid hazırlama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plazmid Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > organotipik dilim kültürü hazırlama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6 Kuyu Plakaları</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forseps</td><td>FST</td> <td># 5/45</td><td>Organotipik dilim kültürü hazırlama için açılı diseksiyon forseps</td></tr><tr><td>Şişe Filtre Ünitesi</td><td>Kırlangıç</td><td>SCHVU02RE</td><td>Kültür ortamının filtrasyonu ve depolanması</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td>BD C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Doku Doğrayıcı</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>10180</td><td>Organotipik dilim kültürü hazırlama için doku kıyıcı</td></tr><tr><td>Millicell Hücre Kültürü Uç, 30 mm</td><td>Kırlangıç</td><td>PIHP03050</td><td>Organotipik dilim kültürü ekleri</td></tr><tr><td>Ozmometre</td><td>Hassas Sistemler</td><td>OSMETTE II</td><td></td></tr><tr><td>PTFE kaplı spatulalar</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-06369-11</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Steril Vakum Filtrasyon Sistemi</td><td>Milipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>aCSF'nin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> filtrasyonu ve depolanması<tr><td><güçlü>Elektrot hazırlama< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Camlar</td><td>Warner Instruments</td><td>640796</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyici Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman</td><td>P-1000</td><td>Çektirme</td></tr><tr><td>Fırını Bağlayıcı</td><td></td><td>BD (E2)</td><td></td></tr> <tr><td>Çektirme Filament</td><td>Sutter Enstrüman</td><td>FB330B</td><td>Çektirme</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tek hücreli elektroporasyon ve floresan görüntüleme #1</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 mm Falcon Petri Kapları</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Airtable</td><td>TMC</td><td>63-7512E</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Q Görüntüleme</td><td>Retiga-2000DC</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>Elektroporasyon Sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axoporator 800A</td><td>Elektroporatör</td></tr><tr><td>Floresan Aydınlatma Sistemi</td><td>Önceki</td><td>Lümen 200</td><td></td></tr><tr><td>Manipülatör</td><td>Sutter Aleti</td><td>MPC-385</td><td>Manipülatör</td></tr><tr><td>Metamorf yazılım</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Görüntü elde</td></tr><tr><td>etme Peristaltik Pompa</td><td>Rainin</td><td>Dynamax, RP-2</td><td>Perfüzyon pompası</td></tr><tr><td>Kaydırma Masası</td><td>Luigs & Neuman</td><td>240 XY</td><td></td></tr><tr><td>Hoparlör</td><td>Bilinmiyor</td><td></td><td>Elektroporatöre bağlı hoparlörler</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ30</td><td></td></tr><tr><td>Masa Üstü İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr><tr><td>Dik Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan görüntüleme #2</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepsi Bir Arada Floresan Mikroskobu</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr></tbody></table>

fare hipokampal uyarıcı ve sınıfa Özgü inhibitör nöronların farklı organotipik dilim kültürü boyunca tek hücreli elektroporasyon

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Elektroporasyon, işlevlerini anlamak için belirli genleri hücrelere aktarmak için kritik bir yöntem olarak kendini belirlemiştir. Burada, fare organotipik hipokampal dilim kültüründe uyarıcı ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda in vitro gen transfeksiyonunun verimliliğini (~%80) en üst düzeye çıkaran tek hücreli bir elektroporasyon tekniğini açıklıyoruz. Büyük cam elektrotlar, tetrodotoksin içeren yapay beyin omurilik sıvısı ve hafif elektriksel darbeler kullanarak, kültürlü hipokampal CA1 piramidal nöronlarına ve inhibitör internöronlara ilgi çekici bir gen sunduk. Ayrıca, elektroporasyon, transfeksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma olmadan 21 güne kadar kültürlü hipokampal dilimlerde gerçekleştirilebilir ve farklı dilim kültürü gelişim aşamalarının incelenmesine olanak sağlar. Çeşitli hücre tiplerinde genlerin moleküler fonksiyonlarını incelemeye olan ilgi artarken, yöntemimiz fare beyin dokusunda mevcut elektrofizyoloji ekipmanı ve teknikleri ile gerçekleştirilebilen in vitro gen transfeksiyonunda güvenilir ve basit bir yaklaşım göstermektedir.

Tek hücreli elektroporasyonumuz genleri görsel olarak tanımlanmış uyarıcı ve inhibitör nöronlara tam olarak ulaştırabilir. Üç farklı nöronal hücre tiplerini üç farklı zaman noktasında elektropore ettik. Nöronları ifade eden parvalbumin (Pv) veya veziküler glutamat tip 3 (VGT3), sırasıyla Pv/TdTomato ve VGT3/TdTomato hatları olarak adlandırılan TdTomato (kırmızı floresan proteinin bir çeşidi) muhabir hattı (Jax #007905) ile Pv cre (JAX #008069) veya VGT3cre (JAX #018147) çizgileri aşılarak görselleştirildi.<sup...

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Gen transfeksiyonu, nörobiyoloji çalışmaları için hayati bir yaklaşımdır. Elektroporasyon tekniğimiz, organotipik hipokampus dilim kültüründe ilgilenilen gen internöronlarını saptanabilir bir yan etki olmaksızın transfekte etmemizi sağlar. Bu protokol, diğer tek hücre protokollerine kıyasla çok daha yüksek bir transfeksiyon verimliliğine sahiptir, ancak yine de nispeten ucuz ve gerçekleştirilmesi kolaydır.Bu teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik işlevlerini anlamakla ilgilenen araştırmacılar için faydalı olacaktır. Elektroporasyon için dilim kültürleri hazırlamak için, ilgilenilen kültür eklerini 900 mikrolitre kültür ortamı ile yüklenmiş ayrı üç santimetrelik petri kaplarına aktarın ve kültürleri bir masa üstü karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, taze kültür eklerini 3,5 santimetrelik bir petri kabında uç başına bir mililitre dilim kültür ortamı ile en az 30 dakika önceden inkübe edin ve elektroporasyon teçhizatının hatlarını beş dakika boyunca %10 ağartıcı ile sterilize edin.Perfüzyonun sonunda, 0.001 milimolar tetrodotoksin içeren filtre ile sterilize edilmiş ACSF ile

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon...

Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Video, transfekte edilmiş bir fare hipokampal beyin dilimindeki sinaptik etkileşimleri ve nöronal tepkileri incelemek için bir protokol göstermektedir. Aksiyon potansiyellerini tetiklemek için uzun menzilli duyusal nöronların aydınlatılmasını ve elde edilen uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilen nöronda kaydedilmesini içerir.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

Çift kayıtlar, tek tek nöronlar arasındaki sinapsların hassas elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonunu sağlayan, sinaptik olarak bağlı iki nörondan eşzamanlı tam hücre yama kelepçe kayıtlarıdır. Burada, elektrofizyoloji için donatılmış herhangi bir laboratuvarda organotipik hipokampal dilim kültürlerinde bu tekniği oluşturmak için ayrıntılı metodolojiyi ve gereksinimleri açıklıyoruz.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Öğrenin fare hipokampal organotipik dilim kültürlerinde tek hücreli elektroporasyon yöntemiyle uyarıcı ve inhibitör nöronlara gen aktarımını. Bu protokol yüksek verimlilikle hücre özerk mekanizmaları ve sinaptik etkileşimleri incelemeyi sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet