Name: In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Keşfedin kama şeklinde beyin dilimi hazırlama tekniğini, presinaptik devre bağlantısını koruyarak in vivo benzeri nöronal devreleri in vitro ortamda çalışmak için. Bu yöntem yüksek çözünürlüklü elektrofizyolojik kayıtlara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından onaylandı.
1. Deneysel preparatlar
NOT: Dilimleme çözeltisi, dilimleme sıcaklığı, dilim kuluçka sıcaklığı ve aparatlar (vb.) dahil olmak üzere dilim hazırlama ile ilgili ayrıntılar bu deneyde yapılan beyin sapı hazırlığı için özeldir. Dilim kuluçka detayları laboratuvar deneyimi başına değiştirilebilir.
<ol><li>Yama bağlama için dahili çözümler hazırlayın.<ol>
<li>(mM' de) 76 Cs-methanesulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2,1 CaCl2,10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosfokreatin, 5 QX-314 ve 0.01 Alexa Flor-48 8 hidraziti içeren voltaj kelepçesi çözeltisi hazırlayın. CsOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.</li>
		<li>(mM) 125 K-glukonat, 5 KCl, 1 MgCl2,0.1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosfokreatin ve 0.01 Alexa Fluor-488 hidraziyonu içeren akım kelepçe çözeltisi hazırlayın. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL sıcak (kaynamaya yakın) suya 4 g agar ekleyerek %4 agar 100 mL hazırlayın. Isıtılmış karıştırın plaka üzerine yerleştirin sıcaklığını korumak ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Yaklaşık 1 cm derinliğe 100 mm plastik Petri kapları dökün ve soğumaya bırakın. İhtiyaç duyulana kadar buzdolabında bekletin.</li>
	<li>Hazırlamak 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) mM içeren: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, ve 10 dekstroz. En az 10 dakika karbogen (%5 CO2 / %95 O2)ile kabarcık, sonra gerekirse 1 M NaOH ile 7,4 için son pH ayarlayın. Deney boyunca karbogen ile sürekli köpürerek çözeltinin oksijenasyonunu ve pH'ını koruyun.</li>
	<li>ACSF'ye 1 mM kynurenic asit ekleyerek 200 mL dilimleme çözeltisi hazırlayın. Kinenik asit eriyene kadar 10 dakika boyunca sonicating su banyosunda sonicate çözeltisi. Sürekli karbogen ve buz üzerinde yer ile kabarcık. DİkKAT: Kinenik asit kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uygun bir bıçağı vibratome monte edin. Buz ile çevreleyerek chill vibratom dilimleme odası.</li>
</ol>2. Stimülasyon için sağlam işitsel sinir kökü ile beyin kaldırma
NOT: Bu deneyler için fareler, C57BL/6J arka plan üzerinde ChAT-IRES-Cre transgenik farelerin tdTomato muhabiri fareler (Ai14) ile geçerek elde edilmiştir. Histoloji ve elektrofizyoloji için kullanılan fareler, farelerde P12 civarında olan işitme sonrası başlangıçlı (P14-P23) idi. Yamuk vücudun ventral çekirdeğinde tdTomato ifade nöronlar (VNTB) daha önce bu fare hattı MOC nöronlar olarak karakterize edilmiştir57.
<ol><li>Ötenazi (örneğin, CO2 boğulma) ve onaylanmış kurumsal prosedürleri kullanarak hayvanın kafasını kesmek.</li>
	<li>Bir jilet kullanarak, burundan boynun arkasına kafatasının orta ucundaki deriyi kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için derisini soy.</li>
	<li>Küçük makas kullanarak, kafatasının tabanından başlayarak (omurilik yakın kaudal uç) ve burun doğru devam orta hat üzerinden kafatasında bir kesi yapmak.</li>
	<li>Lambda sütür de, orta hattan kafatasında kesikler yapmak, her iki tarafta kulak doğru yanal. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını soy.</li>
	<li>Rostral ucundan başlayarak, yavaşça küçük bir laboratuvar spatula veya künt forseps ile kafatası ndan beyin kaldırın. Optik sinir ivedi ve yavaşça geriye doğru beyin çalışmaya devam, ventral yüzey açığa.</li>
	<li>Beyin sapının ventral yüzeyine yakın ince forceps ile çimdikleyerek trigeminal sinirleri kesin. NOT: Vestibulocochlear sinir hemen altında yatıyor ve nihai stimülasyon için bozulmamış olması gerekir gibi dikkatle bunu yapın.</li>
	<li>Soğuk dilimleme çözeltisi ile dolu bir cam Petri kabına hazırlık yerleştirin. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin. Yavaşça carbogen ile kabarcık.</li>
	<li>Yüz sinirini beyin sapına yakın kırpın ve vestibulocochlear siniri ortaya çıkar.</li>
	<li>İnce forseps kullanarak, vestibulocochlear sinir mümkün olduğunca kafatası çıkar ve onu kesmek için sinir çimdik, beyin sapı bağlı sinir kökü bırakarak foramina içine ipuçlarıit. Bunu diğer tarafta tekrarlayın.</li>
	<li>Bir kez her iki sinir kökleri serbest, menineler ve yamuk vücut yakınındaki beyin sapı ventral yüzeyinden vaskülatür kaldırın.</li>
	<li>Kalan kranial sinirleri ve mümkünse kalan omuriliği korumak için dikkat bağlanan bağ dokusunu çimdikleyerek beyni kafatasından tamamen kurtarın.</li>
</ol>3. Blok ve sahnede beyin monte (manyetik disk)
<ol><li>Optik kiazma düzeyinde beyin engelleyerek sahneye düzeltmek için beyin yüzeyini hazırlayın.<ol>
<li>Ventral yüzey yukarı ile, yavaşça beyin aşağıdaki adım sırasında eğim yok, böylece omurilik hareketsiz leştirmek için künt bir araç kullanarak beyin stabilize.</li>
		<li>Optik kiazma düzeyinde, çanak altına aşağı beyin yoluyla ekleyerek beyin engelleme için düzlem oluşturmak için açık forseps kullanın. Uçların beyin kaudalinin dorsal yüzeyinden optik kiazma çıkması için uçları dikeyden yaklaşık 20° bir açıyla yerleştirin.</li>
		<li>Jilet kullanarak forceps boyunca kesin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyni sahnenin yüzeyine yapıştır.<ol>
<li>Beyni desteklemek için %4 agarlık küçük bir blok (~1 cm3)hazırlayın.</li>
		<li>Sahnede tutkal küçük bir damla yerleştirin ve hem beyin ve agar blok aşağı yapıştırılmış olabilir, böylece bir dikdörtgen içine yayıldı.</li>
		<li>Forseps kullanarak, dikkatle beyin kaldırın ve nazikçe bir kağıt havlu kenarı kullanarak aşırı sıvı dab. Tutkal üzerine bloke yüzey yerleştirin, ventral yüzey dilimleme sırasında bıçak doğru olacaktır.</li>
		<li>Agar bloğunu, dilimleme sırasında desteklemek ve uygun beyin konumlandırmasını sağlamak için beynin sırt yüzeyine hafifçe bastırın (yani açı).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dilim beyin kama dilimi oluşturmak için
NOT: Kalın tarafında koklear sinir kökü ve medial olivokoklear (MOC) nöronlar ve ince tarafta trapez cisim (MNTB) medial çekirdeği olan vibratom kullanarak bir beyin dilimi hazırlayın.
<ol><li>Manyetik diski bağlı beyinli bir şekilde sahne tabanına yerleştirin ve bıçağın mendil yüzeyi ile dilimleme odasına yerleştirin.</li>
	<li>Buz soğuk dilimleme çözeltisi ve karbogen ile kabarcık ile oda doldurun.</li>
	<li>Bıçağı çözeltinin içine indirin ve dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için ilgi çeken bölgeye dilimler kesin. Dilimler asimetrik görünüyorsa, simetri elde etmek için sahneyi hafifçe yatırın. NOT: 0.05-0.10 mm/s arasındaki bıçak hızları sağlıklı dilimlerin kesilmesinde etkili olup hayvan yaşına ve beyin bölgesine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.</li>
	<li>Dilimler simetrik olduktan sonra, sahneyi ~15° (sahne tabanında yaklaşık 3 eşmerkezli halkaya karşılık gelen) bir tarafa kaydırın. NOT: Aşamayı dilimde korumak istediğiniz işitsel sinir kökünden uzaklaştırın.</li>
	<li>İşitsel sinir kökü bir tarafta yüzeye yakın olana kadar dikkatlice dilimleme devam, ve yüz sinir diğer tarafta yüzeyinde görülebilir.</li>
	<li>Sahneyi 15° geriye, orijinal konuma kaydırın.</li>
	<li>Bıçağı dokudan uzaklaştırın ve sahne tabanını 90° döndürün, böylece ince tarafın yanal kenarı bıçakla karşı karşıya dır. Bıçağı birkaç yüz mikron indirin ve bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırın. Bıçak lateral kenarına değene kadar bunu tekrarlayın. Bıçağı dilimin ince kenarının istenilen kalınlığına indirin, burada iki yüz mikron daha. NOT: Elde edilen dilim ideal ~ 300 mm kalınlığında yamuk vücut ventral çekirdeği düzeyinde (VNTB) yama sıkma gerçekleşecek tarafında.</li>
	<li>Bıçağı dokudan geri hareket ettirin ve sahne tabanını geri döndürün, böylece ventral yüzey ona bakacak.</li>
	<li>Kama diliminin rostral yüzeyini belirleyen kesimi yapın. Dilimi bir arayüz kağıdına (1 cm2) kaudal yüzeye aktarın. Dilimi kuluçka odasına veya kurtarma için uygun diğer kuluçka cihazlarına taşıyın (35 °C'de 30 dk). NOT: Yüz siniri, dilimin her iki hemisferinde rostral yüzeyde görülmelidir (Bkz. Şekil 1B).</li>
</ol>5. Elektrofizyoloji kurulumu ve kaydı
<ol><li>Kama dilimini kayıt odasına yerleştirin ve bir arp veya sabitleme sistemi yle sabit dilim. 7-10 mL/dk hızla karbogen ile kabarmış sıcak (35 °C) ACSF ile sürekli olarak dokuyu perfüzyon.</li>
	<li>Yama kelepçesi kayıtları için 561 nm emisyon filtresi ile epifloresans kullanarak VNTB'de genetik olarak etiketlenmiş MOC nöronlarını tanımlayın. Yama lanabilir hücre yoksa dilim çevirin.</li>
	<li>DIC optik kullanarak, dilimin kalın tarafında işitsel sinir kökü odaklanmak ve bipolar tungsten uyarıcı elektrot aşağı işitsel sinir kökü ve yavaşça doku yüzeyine taşımak için bir mikromanipülatör kullanın. NOT: Emme elektrotları diğer laboratuvarlarda işitsel sinir stimülasyon deneylerinde kullanılmıştır. Teta cam elektrotlar, ya da optik stimülasyon yöntemleri diğer özel preparatlar için varsa uygulanabilir.</li>
	<li>Yama kıskaç elektrofizyolojisi için hedef bir MOC nöron seçmek için VNTB geri görüş alanı taşıyın.</li>
	<li>Bir kayıt pipetini önerilen deneme için uygun dahili çözümle doldurun.</li>
	<li>Tüm hücre konfigürasyonunda MOC nöronundan yama ve kayıt. Gerekirse membran kapasitansını ve seri direncini dengeler.</li>
	<li>MOC nöron tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın. NOT: Stimülasyon elektrotunu hareket ettirmek gerekebilir.</li>
	<li>MOC (voltaj kıskacı) veya etki potansiyel desenleri (akım kelepçesi) uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokolleri çalıştırın. NOT: Kama dilimi hazırlama gevşek yama kayıtları, farmakoloji, optogenetik, kalsiyum görüntüleme, nörotransmitter uncaging, vb gibi herhangi bir tipik yama-kelepçe araçları ile kullanılabilir.</li>
</ol>6. Beyin sapı çekirdeklerinin histolojik teyidi
NOT: Bu sabit, yeniden kesitli kama dilim, cresyl menekşe boyama ile yapılır. Bu yöntem, dilimde bulunan çekirdeklerin görselleştirilmesine olanak sağlar.
<ol><li>Bir kama dilimi hazırladıktan sonra, bir gecede dilimin fiksatife batırılmış (PBS'de %4'ü PFA). PBS 10 dakika (bir shaker üzerinde oda sıcaklığında) için dilim 3x durulayın, sonra kriyokoruma kıvrak 4 ° C'de bir gecede PBS% 30 sakaroz yerleştirin.</li>
	<li>Dilimi dondurucu bir mikrotom (40-70 mm) üzerine yeniden bölve PBS'de 24 kuyuplakasında seri bölümler toplayın.</li>
	<li>Jelatin kaplı slaytlar üzerine montaj bölümleri ve tamamen kurumasını bekleyin. Slaytları slayt taşımaya yerleştirin.</li>
	<li>Cresyl menekşe solüsyonları hazırlayın<ol>
<li>500 mL dH2O'da 5 g cresyl violet asetat karıştırarak %1 krem menekşe asetat hazırlayın</li>
		<li>İlk olarak 90 mL çözelti A (540 mL buzul asetik asit + 89,46 mL dH2O) ve 10 mL çözelti B (10 mL dH2O'da 136 mg sodyum asetat) hazırlayarak asetat tamponu hazırlayın. A solüsyonu A ve b çözeltisini birleştirerek asetat arabelleği verir.</li>
		<li>Asetat tampon% 0.5 krem menekşe için asetat tampon 1:1 ile% 1 tere mor asetat birleştirin. Kullanmadan önce filtreuygulayın.</li>
		<li>Uygun dH2O hacimleri ile %100 etanol seyrelterek %95 ve %70 etanol hazırlayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terezil menekşe boyama protokolü uygulayın. Slayt taşıyıcısını çözelti tepsileri arasında taşıyın, fazla çözeltiyi tepsiler arasında kağıt havlu üzerinde lekeleyin: ksilen – 5 dk; %95 etanol – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; dH2O – 3 dk; % 0.5 krem menekşe çözeltisi – nükleer boyama koyu mor hale dönene kadar sık sık 8-14 dk izleme; dH2O – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; %95 etanol – 1-2 dk; % 100 etanol - iki kez slaytlar daldırma; ksilen – 5 dk; ksilen: montaj yapılana kadar 25 dk. DİkKAT: Sadece bir duman başlık altında ksilenes kullanın.</li>
	<li>Slaytları teker teker ksilenden çıkarın ve hemen montaj ortamını kullanarak slaytlara kapak fişleri yerleştirin. Montaj ortamının kurumasını bekleyin (bir gecede).</li>
	<li>Görüntü bölümleri.</li>
</ol>7. Canlı, sabitlenmemiş dokuda aksonun anterograd takibi için biyositin etiketleme
<ol><li>Yukarıdaki gibi bir kama dilimi hazırlayın (Adımlar 2-4).</li>
	<li>Dilimi arayüz kağıdına aktarın (~1 cm2). Bir kesme mikroskobu altında, dilimin kalın tarafında CN yerini.</li>
	<li>ACSF'yi dokudan uzaklaştırmak için bir kağıt mendil ini bükerek dilimin çevresindeki alandaki fazla ACSF'yi dikkatlice çıkarın. Bu cn dışında hücrelere alımına yol açabilir dilimin çevre bölgelerine yayılmasını biyositin önler.</li>
	<li>İnce çerkediklerle, küçük bir biyositin kristali seçin ve CN'nin yüzeyine yerleştirin. Nazikçe nöronların temas ve somata içine sonraki alımı teşvik etmek için doku içine kristal basın. Bu durumda T-stellat ve GBC nöronlar içeren CN bölgeleri, ilgi istenilen bölgeyi kapsayacak şekilde bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Dilimi kuluçka odasına yerleştirin. Biyositin alımı ve taşınması için dilimin 35 °C'de 2-4 saat kuluçkaya yatırmasını bekleyin. Kuluçkadan sonra, herhangi bir biyosit inparçacıklarını çıkarmak için acsf dilim durulamak.</li>
	<li>Bir gecede dilimi fiksatife (PBS'de %4 PFA) yerleştirin. PBS 10 dakika için 3x durula.</li>
	<li>4 °C'de veya dilim batana kadar PBS'de %30 sakarozda kriyokoruma dilimi.</li>
	<li>70-100 mm dondurucu bir mikrotom üzerinde enine kesitler üretmek için dokuyu rezeksiyon.</li>
	<li>Bir floresan konjuge streptavidin ile standart immünohistokimyasal yöntemler kullanarak doku süreci. NOT: Presinaptik hücre cisimlerinin, aksonlarin, reseptörlerin veya devre görselleştirmesi için önemli olan diğer sinaptik moleküllerin etiketlenmesinde yardımcı olunması durumunda bölümlere ek immünohistokimya yapılabilir (örn. primer antikor basamakları biyositin sekonder görüntülemesini olumsuz etkilememelidir).</li>
	<li>Dokuyu görüntüle.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada bir kama dilimi olarak tanımlanan dilimleme prosedürü bozulmamış presinaptik nöronal devre korumak için güçlü, ancak nöronal fonksiyonun analizi için beyin dilimi deney erişilebilirliği ile. Devre analizine hazırlık kullanımını en üst düzeye çıkarmak için birkaç ilk adımda büyük özen gerekir. Kamanın boyutları, hem presinaptik çekirdeklerin hem de aksonal projeksiyonlarının hazırlanan kama dilimi içinde yer aldığını doğrulamak için integral olan histolojik inceleme kullanılarak doğrulanmalıdır. Projeksiyonlar kesi...

Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirmek için zor, kolayca erişilebilen beyin bölgelerinde bile. Tek hücreli çözümlü deneylerin teknik zorlukları, beynin derinliklerinde bulunan bazı nöron popülasyonlarında veya canlı hücreleri bulmak için genetik araçlar gerektiren mekansal olarak dağınık popülasyonlarda (örn. optrode kaydı yla eşleştirilmiş kanaloidofinin genetik ekspresyonu) veya site etiketlemesinden sonra post-hoc histokimyasal tanımlamada (örn. nörotransmisyona özgü belirteçlerle) daha da artırılır. Beyin sapı ventral yüzeyine yakın diffüz bulunan olmak, medial olivocochlear (MOC) nöronlar yukarıdaki sınırlamalar muzdarip1, onları in vivo deney için erişim son derece zor hale.
Beyin dilimleri (~ 100-500 μm kalınlığı) uzun beyin devreleri çalışmak için kullanılmıştır, işitsel beyin sapı devredahil, aynı dilim içinde bulunan bağlı nöronların fiziksel ayrımı nedeniyle2,3,4,5,6,7,8,9. Çok daha kalın dilimler (>1 mm) kullanarak deneyler, ikili girdilerin medial superior zeytin10,11dahil olmak üzere üstün olivary kompleksi (SOC) alanlarında nasıl entegre olduğunu anlamak için diğer laboratuvarlarda kullanılmıştır. Bu dilimler, işitsel sinirin aksonlari (AN) dilim içinde bozulmadan kaldı ve cn sinaptik nörotransmitter salınımını başlatmak için elektriksel olarak uyarıldı, ilk derecede işitsel nöronların aktivitesini taklit olarak sese tepki verecekti. Bu kalın dilimlerin en büyük dezavantajlarından biri yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar ("yama") için nöronların görünürlüğüdür. Bu alanda çok sayıda akson yaş 12 ile miyelinated hale olarak Patching giderek daha zor halegelir13,14,15, doku optik yoğun hale ve tipik bir, ince beyin dilimi bile nöronlar gizleme. Amacımız in vivo kayıtların devre bağlantısına daha çok benzeyen, ancak beyin dilimlerinde görsel güdümlü yama-kelepçe elektrofizyolojisinin yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü kayıt yetenekleriyle in vitro preparatlar oluşturmaktır.
Laboratuvarımız, MOC nöronları da dahil olmak üzere işitsel efferent sistemin nöronların fizyolojisini araştırır. Bu kolinerjik nöronlar dış saç hücrelerinin aktivitesini modüle ederek koklea efferent geribildirim sağlamak (OHCs)16,17,18,19,20. Önceki çalışmalar da bu modülasyon koklea21,22,23,24,25,26 ve akustik travma27,28,29,30,31,32,33de kazanım kontrolü bir rol oynadığını göstermiştir . Farelerde, MOC nöronlar diffüz yamuk vücudun ventral çekirdeğinde yer almaktadır (VNTB) işitsel beyin sapı1. Grubumuz epifloresan aydınlatma altında beyin sapı dilimleri MOC nöronlar hedef tdTomato muhabiri fare hattı ile geçti ChAT-IRES-Cre fare hattı kullanmıştır. Biz MOC nöronlar trapez vücudun ipsilateral medial çekirdeğinden afferent inhibitör girdi almak gösterdi (MNTB), hangi heyecanlı, sırayla, küresel gür hücrelerden akson tarafından (GBC) kontralateral koklear çekirdeği (CN)34,35,36,37,38. Ayrıca, MOC nöronlar büyük olasılıkla kontralateral CN39,40,41T-stellat hücrelerinden uyarıcı giriş alırsınız. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MOC nöronlar aynı (kontralateral) kulak tan türetilen hem uyarıcı ve inhibitör girdileri almak göstermektedir. Ancak, presinaptik nöronlar, ve MOC nöronlar üzerinde yakınsama aksonları, oldukça tipik bir koronal dilim hazırlanmasında tam olarak bozulmamış olması için birbirlerine yeterince yakın değildir. Sinaptik girdilerin MOC nöronlarına entegrasyonunun eylem potansiyeli ateşleme kalıplarını nasıl etkilediğini araştırmak için, yeni tanımlanan inhibisyona odaklanarak, bir kulaktan MOC nöronlarına kadar olan çeşitli afferentleri fizyolojik olarak en gerçekçi şekilde uyarabileceğimiz, ancak in vitro beyin dilimi deneylerinin teknik yararları ile birlikte bir hazırlık geliştirdik.
Kama dilimi, MOC nöronlarında devre entegrasyonunun araştırılması için tasarlanmış değiştirilmiş kalın bir dilim hazırlığıdır (Şekil 1A'daşematize). Dilimin kalın tarafında, kama işitsel sinir kopmuş aksonlar içerir (bundan sonra "işitsel sinir kökü" olarak adlandırılır) onlar CN çevre ve sinaps gelen beyin sapı girerken. İşitsel sinir kökü elektriksel nörotransmitter salınımı ve tamamen bozulmamış CN hücrelerinin sinaptik aktivasyon uyandırmak için uyarılmış olabilir42,43,44,45,46. Bu stimülasyon biçimi devre analizi için çeşitli faydaları vardır. İlk olarak, MOC nöronlarına afferent girdi sağlayan T-stellat ve GBC aksonları doğrudan uyarmak yerine, CN'de bol miktarda bulunan içsel devrelerin aktivasyonuna izin vermek için AN'yi uyarıyoruz. Bu devreler beyin boyunca hedeflerine CN nöronların çıkış modüle, MOC nöronlar dahil46,47,48,49,50,51. İkinci olarak, AN'den MOC nöronlarının CN upstream'ine kadar olan afferent devrelerin polisinetik aktivasyonu, işitsel stimülasyon sırasında in vivo olduğu gibi daha doğal aktivasyon zamanlaması na ve plastisitenin bu sinapslarda oluşmasına olanak sağlar. Üçüncü olarak, an aktivitesini taklit etmek için stimülasyon kalıplarımızı değiştirebiliriz. Son olarak, MOC nöronlar için hem uyarıcı ve inhibitör monaural projeksiyonlar kama dilim bozulmamış, ve bunların entegrasyonu yama-kelepçe elektrofizyoloji hassasiyeti ile bir MOC nöron ölçülebilir. Bir bütün olarak, bu aktivasyon şeması tipik bir beyin dilimi hazırlık ile karşılaştırıldığında MOC nöronlar için daha sağlam bir devre sağlar. Bu beyin sapı kama dilimi de lateral superior zeytin, üstün oliyum çekirdeği ve medial üstün zeytin10, 11,52,53,54,55,56dahil olmak üzere ipsilateral MNTB inhibitör girdi almak diğer işitsel alanları araştırmak için kullanılabilir. Bizim özel hazırlık ötesinde, bu dilimleme yöntemi kullanılabilir veya uzun menzilli girdilerin bağlantı bakımı ve tek hücreli çözünürlükte elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri çeşitli nöronların görselleştirme iyileştirilmesi yararları ile diğer sistemleri değerlendirmek için değiştirilebilir.
Bu protokol yaklaşık 15 ° yatırılabilir bir vibratom sahne veya platform kullanımını gerektirir. Burada "sahne" bir içbükey manyetik "sahne tabanı yerleştirilir kavisli bir alt ile metal bir disk olduğu bir ticari olarak kullanılabilir 2 parçalı manyetik sahne kullanın." Daha sonra dilim açısını ayarlamak için aşama kaydırılabilir. Sahne tabanındaki eşmerkezli daireler açıyı tekrarlı olarak tahmin etmek için kullanılır. Sahne ve sahne tabanı dilimleme odasına yerleştirilir, burada manyetik sahne tabanı da döndürülebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Deneysel Hazırlıklar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, toz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td>Vibratom kesiti sırasında beyin dokusunu stabilize etmek için kullanılan %4 agar bloğu</td></tr><tr><td>AlexaFluor Hidrazid 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td>Başarılı MOC nöron yamasını doğrulamak için dahili çözeltide kullanılan florofor</td></tr><tr><td>Analitik Denge</td><td>Genleri Bilimsel (Intramalls)</td><td>AV114</td><td>Tartı kimyasalları</td></tr><tr><td>Çift kenarlı tıraş bıçağı</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td>Vibratom kesme bıçağı</td></tr><tr><td>Kinürenik asit (5g)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375-5G</td><td>Dilimleme ACSF katkı maddesi, yama sıkıştırma için doku sağlığını iyileştirmek amacıyla diseksiyon ve dilimleme sırasında nöron aktivitesini azaltmak için kullanılır</td></tr><tr><td>pH Metre</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>13-620-451</td><td>Çözelti pH test cihazı</td></tr><tr><td>Plastik petri kapları 100mm çap X 20mm</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-556-002</td><td>%4 Agar Hazırlık</td></tr><tr><td>Karıştırma Ocak</td><td>Gözü Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>11-500-150</td><td>%4 Agar için</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ısıtma <tr><td>hazırlama<güçlü>Diseksiyon ve Dilimleme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Biyosit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261-250MG</td><td>Aksonal izleme için kullanılan kimyasal (Streptavidin 488 ile konjuge edilmiş)</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Amscope</td><td>SM-1BN</td><td>Beynin çıkarılması sırasında hassas diseksiyon için</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td>İnce forseps diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Ekonomi cımbız #3</td><td>WPI</td><td>501976</td><td>Forseps diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Cam Petri Kabı 150mm çap x 15mm H</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>08-747E</td><td>Diseksiyon çanağı</td></tr><tr><td>Arayüz kağıdı (203 X 254mm PCTE Membran 10um)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1220823</td><td>Dilim inkübasyonu/biyosit uygulaması</td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratom</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Kama dilimi kesitleme için vibratom</td></tr><tr><td>Mayonez makas</td><td>Roboz</td><td>RS-6872</td><td>Diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Tek kenarlı karbon çelik bıçaklar</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-640</td><td>Diseksiyon için tıraş bıçağı</td></tr><tr><td>Numune diski,</td><td>Leica</td><td>14048142068</td> yönlendirme <td>Tekrarlanabilir eğme için özel vibratom aşaması</td></tr><tr><td>Spoonula</td><td>FisherSci</td><td>14-375-10</td><td>Diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>Newegg</td><td>15187</td><td>Dokuyu vibratom aşamasına</td></tr> <tr><td>yapıştırmak için kullanılırVannas Yaylı Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91500-09</td><td>Diseksiyon aracı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Elektrofizyoloji</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R Dik Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon Instruments Elektrofizyoloji</td><td></td><td>ve görüntüleme mikroskobu, elektrofizyoloji</td></tr> <tr><td>ile uyumlu herhangi bir mikroskop olabilirElektrot Borosilikat cam, Filament OD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm uzunluğunda</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td>Yama sıkıştırma pipet camı</td></tr><tr><td>Elektrot Dolgusu MicroFil</td><td>WPI</td><td>CMF20G</td><td>Yama elektrot pipet dolgusu</td></tr><tr><td>Hat içi çözelti ısıtıcısı</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>SH-27B</td><td>Dilim perfüzyon sistemi ısıtıcısı</td></tr><tr><td>Çoklu Mikromanipülatör Sistemleri</td><td>Sutter Müdahaleleri</td><td>MP285 özellikli MPC-200</td><td>Yama kelepçesi ve stimülasyon elektrot yerleşimi için mikromanipülatörler</td></tr><tr><td>P-1000 cam mikropipetler için yatay pipet çektirmesi</td><td>Sutter aletleri</td><td>FG-P1000</td><td>Yama kelepçeli pipetleyici çektirme</td></tr><tr><td>Yama kelepçeli amplifikatör ve Yazılım</td><td>HEKA</td><td>EPC-10 / Patchmaster Sonraki</td><td>Herhangi bir amplifikatör/yazılım</td></tr><tr><td>Kayıt Odası</td><td>olabilir Warner Instruments</td><td>RC26G</td><td>Kayıt sırasında dilim "banyosu"</td></tr><tr><td>Kayıt Odası Arp</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Elektrofizyoloji kaydı sırasında dilimi sabitler</td></tr><tr><td>Dilim Kuluçka Odası</td><td>Özel Yapı</td><td></td><td>Dilimleme sonrası toparlanma sırasında dilimler için ısıtılmış, oksijenli tutma odası</td></tr><tr><td>Uyaran izolasyon ünitesi</td><td>A.M.P.I.</td>Elektrofizyoloji Şırınga için <td>Iso-Flex</td><td>Stimulus izolasyon ünitesi</td></tr><tr><td>60CC</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-820-11</td><td>Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı işleme</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>TC-324C</td><td>Dilim perfüzyon sistemi sıcaklık kontrolörü</td></tr><tr><td>Boru 1/8 OD 1/16 ID</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-171-129</td><td>Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı taşıma</td></tr><tr><td>Tugsten konsantrik bipolar mikroelektrot</td><td>WPI</td><td>TM33CCINS</td><td>Elektrofizyoloji</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> için uyarıcı elektrot <tr><td><güçlü > Histoloji< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyu Plate</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td> <td>12-556006</td><td>Histoloji dilimi toplama ve immün boyama</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td><td>Jackson İmmüno laboratuvarları</td><td>016-540-084</td><td>Biyosit görselleştirme için ikincil antikor</td></tr><tr><td>İmmünohistokimya ajitasyonu için</td><td>Corning Orbital Shaker</td><td>Sigma</td><td>CLS6780FP</td> Shaker</tr><tr><td>Cresil Menekşe Asetat</td><td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td><td>C5042-10G</td><td>Histoloji için hücresel boyama</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Mikrotom Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-210-052</td><td>Kayar mikrotom bıçağı</td></tr><tr><td>Filtre şırıngası Nalgene 4mm Selüloz Asetat 0.2um</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>09-740-34A</td><td>Kayıt pipetlerini dahili çözelti ile doldurmak için şırınga filtresi</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Slayt Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>İmmünohistokimya floresan montaj ortamı</td></tr><tr><td>raflı cam slayt boyama kabı</td><td>Fisher Scientific ( Intramalls)</td><td>08-812</td><td>Cresyl Violet boyama odası</td></tr><tr><td>Microm HM450 Kayar Mikrotom</td><td>ThermoFisher</td><td>910020</td><td>Histoloji için donma mikrotomu</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Gözlükler: Dikdörtgenler 50mm x 24mm</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-543D</td><td>Histokimya sürgülü kapak camı</td></tr><tr><td>Permount montaj ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Cresyl menekşe kesit montajı orta</td></tr><tr><td>Superfrost Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034980</td><td>Histoloji slaytları</td></tr></tbody></table>

in vitro kama dilimi in vivo nöronal devre bağlantısı nın takliti için hazırlık

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro dilim elektrofizyoloji teknikleri hassas elektriksel ve zamansal çözünürlük ile tek hücreli aktiviteölçmek. Beyin dilimleri düzgün görselleştirmek ve yama-kelepçeleme veya görüntüleme için nöronlar erişmek için nispeten ince olmalıdır, ve beyin devrelerinin in vitro muayene sadece fiziksel olarak akut dilim mevcut ne sınırlıdır. Presinaptik çekirdeklerin daha büyük bir kısmını korurken in vitro dilim denemenin faydalarını korumak için yeni bir dilim hazırlığı geliştirdik. Bu "kama dilimi" beyin sapındaki medial olivocochlear (MOC) nöronlara çeşitli monaural, ses odaklı girdileri karakterize etmek için yama-kelepçe elektrofizyoloji kayıtları için tasarlanmıştır. Bu nöronlar kontralateral kulak ve buna karşılık gelen koklear çekirdek (CN) uyaranlarla aktive nöronlardan birincil afferent uyarıcı ve inhibitör girdileri alırsınız. Asimetrik bir beyin dilimi, bir yarımkürenin lateral kenarında ki rostro-kaudal etki alanında en kalın olan ve daha sonra karşı yarımkürenin lateral kenarına doğru incelen tasarlanmıştır. Bu dilim içerir, kalın tarafında, işitsel sinir kökü beyne işitsel uyaranlar hakkında bilgi iletiyor, içsel CN devre, ve hem disynaptic uyarıcı ve trisinaptik inhibitör arayolları kontralateral MOC nöronlar üzerinde yakınsama. Kayıt, dilimin ince tarafındaki MOC nöronlarından gerçekleştirilir ve burada tipik yama-kıskaç deneyleri için DIC optikleri kullanılarak görselleştirilir. İşitsel sinirin doğrudan uyarılması, işitsel beyin sapına girerken yapılır, içsel CN devre aktivitesi ve sinaptik plastisite için MOC nöronların sinapsupstream meydana izin. Bu teknikle in vivo devre aktivasyonunu dilim içinde mümkün olduğunca yakından taklit edebilirsiniz. Bu kama dilimi hazırlığı, devre analizlerinin in vitro dilim fizyolojisinin teknik avantajlarıyla birlikte yukarı akım bağlantısının ve uzun menzilli girdilerin korunmasından yararlanacağı diğer beyin devreleri için geçerlidir.

Kama diliminin histolojik incelemesi İşitsel beyin sapı nöron fonksiyonunun araştırılması için, kama dilimi hazırlığı, kayıtlar için hedeflenen MOC nöronların işitsel sinir kökü ve CN kontralateralini içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1B'degösterilen örnek dilim). Preparatın ilk histolojik incelemesi, dilimin devre aktivasyonu için gerekli çekirdekleri içerdiğini ve aksonal projeksiyonların sağlam olduğunu doğrulamak için önemlidir. CN içinde iki hücre tipleri MOC nö...

Nöronlar için çeşitli sinaptik girdilerin entegrasyonu en iyi doğal zamanlama ve devre plastisite için tüm pre-sinaptik çekirdekleri koruyan bir hazırlık ölçülür, ancak beyin dilimleri genellikle birçok bağlantıları sever. In vitro deney yeteneğini korurken in vivo devre aktivitesini taklit etmek için değiştirilmiş bir beyin dilimi geliştirdik.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Beyin dilimi deneyleri yüksek elektriksel ve zamansal çözünürlük ile nöronal fonksiyon sorgulama sağlar, ama bu dilimler genellikle birçok presinaptik bağlantıları sever. Kama şeklindeki bir dilim daha sağlam bir presinaptik devre korur. Bu modifiye beyin dilimi in vitro deney yararları sağlarken vivo benzeri nöronal devre daha eksiksiz korur, görsel güdümlü yama kıskaç kayıtları gibi, farmakoloji, ve aktivite görüntüleme.Doğru kama dilimlenmiş geometri devre içindeki nöronların atlas konumlarına göre tahmin edilebilir, ancak presinaptik şema ve aksonların bütünlüğü histoloji kullanılarak belirlenmelidir. Burundan boynun arkasına kadar kafatasının orta ucundaki deriyi kesmek için bir jilet kullanarak başlayın. Kafatası nı ortaya çıkarmak için ve kafatasının tabanından başlayıp buruna doğru devam etmek için derini geri soyun, orta hattan kafatasında bir kesi yapmak için küçük makas kullanın.Lambda sütür de, beyin ortaya çıkarmak için kafatası geri soymak için her iki tarafta kulak doğru yanal orta hattan kafatası nda kesikler yapmak. Rostral ucundan başlayarak, optik sinirlerin kesilmesine izin vermek için beyni kafatasından hafifçe kaldırmak için küçük bir laboratuvar spatulası kul

in-vitro-wedge-slice-preparation-for-mimicking-vivo-neuronal-circuit

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Bu video, laboratuvar ortamında kama şeklinde beyin dilimleri hazırlama sürecini göstermektedir. Bir vibratom kullanılarak, bir farenin beyninden kama şeklinde bir dilim, değişen kalınlıklarda hazırlanır. Bu dilim daha kalın uçta yer alan işitme sinir kökünü içerirken, daha ince uçta işitme ile ilgili nöronlar yer alır.

İşitsel Nöronları Görselleştirmek için Kama Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

Video, fare beyin dilimlerindeki retinogenikülat ve kortikojenikülat sinapsların elektrofizyolojik kaydını açıklar. Dorsal lateral genikülat çekirdeği (dLGN) içeren dilimler bir kayıt odasına yerleştirilir. Retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) uyarmak ve retinogenikülat sinapsları araştırmak için optik kanal üzerine veya kortikal nöronları uyarmak ve kortikogenikülat sinapsları araştırmak için nükleus reticularis talami'ye uyarıcı bir pipet yerleştirilir. Stimülasyon üzerine, RGC'ler ve...

Fare Beyin Dilimlerinde Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinapsların Elektrofizyolojik Bir Çalışması

Bu video, fare beyni kama dilimlerinde medial olivokoklear nöronlarda işitme sinir kökünü uyarmak ve postsinaptik akımları kaydetmek için bir protokolü göstermektedir.

Bir Fare Beyin Kaması Diliminde İşitsel Sinir Kökü Stimülasyonu ve postsinaptik akım kayıtları

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Keşfedin kama şeklinde beyin dilimi hazırlama tekniğini, presinaptik devre bağlantısını koruyarak in vivo benzeri nöronal devreleri in vitro ortamda çalışmak için. Bu yöntem yüksek çözünürlüklü elektrofizyolojik kayıtlara olanak tanır.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

Daha fazla video keşfet