Name: Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Öğrenin, pirinçte Agrobacterium-aracılı genetik dönüşüm ve CRISPR-Cas9 gen düzenleme kullanarak erkek kısırlığı üretme yöntemini. Bu protokol, Oryza sativa'da OsABCG15 genini devre dışı bırakarak stabil kısır hatlar oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar genç pirinç çiçeklenme ve pirinç dokusu kültürü orta yapımında yardım sağlamak için Xiaofei Chen kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900611) tarafından desteklenmiştir.

1. sgRNA-CAS9 bitki ekspresyonu vektör konstrüksiyonu ve Agrobacterium-aracılıdönüşüm
<ol><li>Yayınlanan literatüre göre pirinç bir erkek steril gen OsABCG15 hedef28.</li>
	<li>OsABCG15'in ikinci eksonlarında 106-125 bp arasında yer alan hedeflenen site için tasarım sgRNA(Şekil 1).</li>
	<li>SgRNA oligolarını sentezlemek için T4 polinükleotid kinaz kullanın (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' ve 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').</li>
	<li>PsR-Cas9 omurga vektörü29'usindirmek için ensoneklease BbsI kullanın.</li>
	<li>Üreticiprotokolünden sonra T4 ligase kullanarak doğrusallaştırılmış psgR-Cas9 omurgalı sentezlenmiş sgRNA oligolarını inceleyin.</li>
	<li>HindIII/EcoRI kullanarak, sgRNA kasetini adım 1.5'ten sindirin ve kararlı dönüşüm için pCAMBIA1300 ikili vektörünün HindIII/EcoRI bölgesine subclone29.</li>
	<li>Enzim sindirimi ve sıralama ile inşa plazmid onaylayın. Daha sonra, ikili yapıyı Agrobacterium tumefaciens strain EHA105'e dönüştürün ve 28 °C'de 2-3 gün boyunca Kan/Rif seçim plakalarında yetiştirin.</li>
</ol>2. Pirinç genetik dönüşümü ve bitki doku kültürü
<ol><li>Nasır indüksiyon ve rejenerasyon NOT: Nasırı indüklemek için başlangıç malzemesi olarak taze genç pirinç çiçeklerini kullanın (Şekil 2).<ol>
<li>1.6-4.8 mm floret uzunluğu(Şekil 2A)29tarafından belirlenen, meyyoz aşamasında çeltik alan veya yeşil ev genç çiçeklenmeleri toplamak. Pirinç çiçeklenmeleri yaprak kılıf ile kaplı olduğundan emin olun. Her çiçeklenmeyi %70 alkol bezi ile silin ve kesmeden önce kurutun.</li>
		<li>Çiçeklenmeyi temiz bir steril tezgaha getirin. Sterilize makasla küçük parçalar halinde kesin (ne kadar küçük olursa o kadar iyi) ve sonra kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın(Şekil 2B, Tablo 1).</li>
		<li>Plakayı karanlıkta 26 °C'de yaklaşık 10-14 gün boyunca inkünoslayın ve nasır ı indükler (Şekil 3A). NOT: Agrobacterium infiltrasyonu için yeni oluşan nasırı (adım 2.2.7) doğrudan kullanın veya daha fazla nasır elde etmek için taze NBD2 ortamında bir kez daha yenileyin. Nasırı her 8-10 günde bir yeni NBD2 ortamına aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dönüşüm ve ortak tarım<ol>
<li>Dönüşüm için adım 1.6 ikili plazmid içeren A. tumefaciens bakteri kullanın. A. tumefaciens suşlarını YEB ortamda(Tablo 1)%50 gliserol ile -80 °C'de saklayın.</li>
		<li>Streak A. tumefaciens bir -80 °C gliserol stokye selektif antibiyotik içeren YEB agar orta(Tablo 1) ve 25-28 °C'de 48-72 saat büyür, koloniler görünmesini sağlamak için.</li>
		<li>50 mL konik steril test tüpünde, aynı seçici antibiyotikleri içeren sıvı YEB ortamının 5 mL'sine seçici antibiyotiklerle YEB plakasından tek bir koloniyi aşılayın. 250 x g,25-28 °C'de bir orbital shaker üzerinde sallayın bakteriler 0.5 OD600 kadar büyür. g</li>
		<li>250 mL konik şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mL YEB ortamına(Tablo 1)1 mL bakteriyel süspansiyon ekleyin ve 250 x g'deorbital shaker üzerinde sallayın, 4 saat boyunca 28 °C'de.</li>
		<li>Bakteri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika için 4.000 x g santrifüj. Supernatant atın.</li>
		<li>AAM-AS ortamı(Tablo 1)ile bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve süspansiyonu OD600 = 0.4'e seyreltin. NOT: Bakteriyel süspansiyonun mükemmel od verimli dönüşüm için çok önemlidir. Bu nasır üzerinde aşırı bakteri üreme ortadan kaldırılmasında yardımcı olur.</li>
		<li>Adım 2.1.3 bir 150 mL steril şişe içine yaklaşık 150 sağlıklı büyüyen açık sarı kırılgan embriyojenik calli toplayın. Steril şişeiçine adım 2.2.6 dan 50-75 mL bakteri hücresi süspansiyon ekleyin ve sonra 10-20 dakika için calli batırmak için bazı 10-25 mL taze AAM-AS orta ekleyin, zaman zaman sallayarak.</li>
		<li>Şişeden bakteriyel süspansiyonu dikkatlice dökün ve steril filtre kağıdı #1 veya kağıt mendil kullanarak nasırdan fazla bakteriyel süspansiyonu kurulayın. Daha sonra nbd-AS orta(Tablo 1)ile steril bir filtre kağıdı ile kaplı bir Petri çanak üzerine yerleştirin #1. 25-28 °C'de 3 gün boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın ve bakteriyel aşırı büyüme olup olup olup yok.</li>
	</ol></li>
	<li>Dirençli nasır için seçim<ol>
<li>3 günlük birlikte ekimden sonra calli'yi steril filtre kağıdı ile steril bir Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Temiz bir bankta 2 saat boyunca calli'yi havayla kurutun. Nasırın filtre kağıdına yapışmadığından emin olun.</li>
		<li>Calli'yi steril cımbız kullanarak birincil seçim ortamı NBD2'ye (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile) eşit olarak aktarın (Tablo 1). 25-28 °C karanlıkta 2 hafta boyunca kültür calli.</li>
		<li>2 hafta sonra, calli'yi taze seçim ortamı NBD2 içeren yeni bir plakaya eşit olarak transfer edin (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür 25-28 °C karanlıkta başka bir 2 hafta için calli.</li>
	</ol></li>
	<li>Nasır farklılaşması<ol>
<li>Taze MS Medium'a aktarma (25 mg/L higromisin ve 150 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür ışık altında 25-28 °C'de yaklaşık 2 hafta sürer.</li>
		<li>Adımı 2.4.1'i bir kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Daha fazla sürgün çoğalmak için yeni MS ortamı (10 mg / L higromisin ile) ateş tomurcukları aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kök indüksiyonu<ol>
<li>Yeni sürgünleri 1/2 MS ortamına aktarın(Tablo 1). 25 °C - 28 °C ışık altında kültür. Dönüştürülmüş bitkiler 2 hafta içinde kök üretirler.</li>
		<li>1 hafta sonra, dehidratasyon önlemek için bitki kapsayan tencere temizlemek için bitkiler aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Genotip tanımlama
<ol><li>Cetyltrimethyl amonyum bromür (CTAB) yöntemi31kullanarak toplam DNA çıkarma için yeni oluşturulan bitkilerden genç yaprakları toplamak.</li>
	<li>Şablon olarak genomik DNA kullanarak, transgen entegrasyonu ve frekansları doğrulamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için astar (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCACCGTATT 3' ve Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGTCTTTCA 3' Hipgromisin bölgesinde bulunan) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için seçin (Şekil 4). Aşağıdaki PCR koşulları: 5 dk için 94 °C; 36 devir (30 s için 94 °C; 30 s için 56 °C; 1 dk için 72 °C); 7 dk için 72 °C. Başarılı PCR reaksiyonları 604 bp amplicon verir.</li>
	<li>Transformatörlerin genotipini belirlemek için CRISPR hedef bölgelerini çevreleyen genomik bölgeyi özel astarlar (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' ve OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTAAAACATTGCTAT 3') kullanarak güçlendirmek için başka bir PCR gerçekleştirin. PCR koşulları adım 3.2 ile aynıdır.</li>
	<li>Mutasyonları tanımlamak için doğrudan Sanger sıralaması için 3.3 adımdaki PCR parçalarını kullanın.</li>
</ol>4. Mutantın temel fenotipini gözlemleyin
<ol><li>I2-KI çözeltisini hazırlayın: 2 g KI 'yi (potasyum iyodür) 10 mL distile suda çözün ve sonra 0,2 g I2 (resublimed iyot) ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, distile su ile 100 mL toplam hacmi getirmek.</li>
	<li>FAA çözeltisini (%63 susuz etanol, %5 buzul asetik asit, %5 formaldehit ve %27 su) hazırlayın ve kullanmadan önce karıştırın.</li>
	<li>%0,5 Toluidin mavisi boyama çözeltisini hazırlayın: 0,5 g Toluidin mavisini 100 mL distile suda çözün.</li>
	<li>Bir dijital kamera ile tüm bitkilergörüntüleme, bitkisel phenotik gözlem gerçekleştirin.</li>
	<li>Üreme fenotip gözlemyapmak, floret palea ve lemma kaldırın. Bir stereomikroskop altında tüm anthers fotoğraf çekmek.</li>
	<li>İyot boyama ile polen canlılığını gözlemleyin.<ol>
<li>Çiçek anthesis önce olgun pirinç spikelets pick, anthers serbest bırakmak için palea ve lemma kaldırın.</li>
		<li>6 anthers alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 1 damla distile su ekleyin, polen tanelerini serbest bırakmak için cımbızla anther'i iyice ezin ve ardından 2-3 damla I2-KI çözeltisi ekleyin. Kapak la kaplayın.</li>
		<li>Düşük büyütme mikroskobu altında gözlemleyin. Polen taneleri boyalı siyah daha güçlü canlılık göstermek, hiçbir renk veya sarı-kahverengi boyalı bodur veya dejenere vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pirinç anther yarı ince bir bölüm gerçekleştirin<ol>
<li>Bir FAA çözüm içine farklı gelişim aşamalarında pirinç çiçekleri düzeltin. Malzeme nin toplama şişesinin dibine banına kadar fiksatifin dokulara nüfuz etmesini sağlamak için malzemeleri 4 °C'de (genellikle 15 dk) vakumlayın.</li>
		<li>Ertesi gün yeni bir FAA çözümü ile değiştirin. Malzeme dibe battıktan sonra % 70 etanol ile değiştirin ve uzun süreli kullanım için 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Etanol farklı degradeleri ile malzeme dehydrate (70%, 80%, 30 dakika için her zaman% 95, 2 saat için% 100 etanol, 2 saat safranin boya biraz içeren% 100 etanol). NOT: Daha sonra daha kolay kesit için anterler renk ikinci% 100 etanol içine Safranin boya biraz ekleyin.</li>
		<li>Üreticinin talimatını (Malzeme Tablosu) izleyerek gömme gerçekleştirin. Daha sonra, kesitleme den önce 60 °C'de 48 saat fırında pişirin.</li>
		<li>Numuneyi bir mikrotom kullanarak 2 μm kalınlığa kadar kesin. Cam slayt üzerine bir damla su ekleyin. Daha sonra, anther blokları içeren ince bölümleri forceps tarafından almak ve slaytlar üzerinde su damla yüzeyine koyun.</li>
		<li>Slaytları 50 °C'de su banyosuna yerleştirin ve kayalıkaya sıkıca yapışmasını bekleyin.</li>
		<li>30 dakika boyunca slaytlar leke% 0.5 toluidin mavi çözeltisi kullanın. Daha sonra, su ile durulayın ve duman kaputunda kuru. Nötr ağaç tutkal ile mühür. Yavaşça slayt üzerine bir coverslip yerleştirin ve duman kaputunda kuru.</li>
		<li>Örneği mikroskop altında gözlemleyin ve fotoğrafladı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf">http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf</a> (2013).</li>
<li>FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf">http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf</a> 109551-109555 (2017).</li>
<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+model+plant%3A+The+importance+of+rice+to+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li>
<li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li>
<li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+breeding+in+wheat%3A+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li>
<li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosis%3A+revisiting+the+magic%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li>
<li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+food+security%3A+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li>
<li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782(2020).</li>
<li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473(2013).</li>
<li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants%3A+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+in+the+genomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824(2008).</li>
<li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+rice+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li>
<li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796(2006).</li>
<li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+japonica+rice+%28Oryza+sativa%29+cultivar%2C+Taichung+65%2C+by+the+Agrobacterium-mediated+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li>
<li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li>
<li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li>
<li>Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li>
<li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li>
<li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li>
<li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49(2011).</li>
<li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li>
<li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415(2016).</li>
<li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein%2C+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li>
<li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+plant+development%3A+from+zygote+to+spikelet%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li>
<li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li>
<li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis%3A+resources+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Rice%22%5BJournal%5D)">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39(2013).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
</ol>

Yapay gen erkek steril mutantlar geleneksel rasgele fiziksel, kimyasal veya biyolojik mutagenez tarafından oluşturulur. Bu güçlü teknikler olmasına rağmen, onların rasgele doğa moleküler ıslah ıslahı32özel iyileştirmeler sunmak için potansiyele sahip modern genomik bilginin büyük miktarda yararlanmak için başarısız olur. CRISPR-Cas9 sistemi,DNA'yımanipüle etmek ve düzenlemek için basit ve uygun fiyatlı araçları sayesinde bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır 29,</s...

Pirinç, özellikle gelişmekte olan ülkelerde en önemli gıda mahsulüdür ve dünya nüfusunun yarısından fazlası için bir temel gıda temsil eder. Genel olarak, pirinç tanesi için talep büyüyor ve 2030 yılına kadar% 50 ve 205011,2%100 artırmak için tahmin edilmektedir. Pirinç veriminde gelecekteki iyileştirmeler, pirinci monocotyledonous bitki araştırmaları için mükemmel bir model haline getiren çeşitli moleküler ve genetik kaynaklardan yararlanmak zorunda kalacaktır. Bunlar arasında etkin bir dönüşüm sistemi, gelişmiş moleküler harita ve uzun yıllar boyunca oluşturulmuş olan ifade edilmiş sıra etiketleri3,,4'üngenel olarak erişilebilir veritabanı bulunmaktadır. Bir strateji ürün verimi artırmak için hibrid tohum üretimi5, hangi erkek doğurganlık işlemek için yeteneği olan merkezi bir unsurdur. Tahıl bitkileri erkek doğurganlık moleküler kontrol anlamak hibrid tohum üretimini artırmak ve bitki verimliliğini artırmak için pratik teknikler içine anahtar bilgi çevirmek için yardımcı olabilir6,7.
Genetik dönüşüm, yabancı genlerin tanıtılmasına veya ekin bitkilerinde endojen genlerin manipülasyonuna olanak sağladığı ve genetiği değiştirilmiş çizgilerin üretilmesiyle sonuçlandığından temel araştırma ve ticari tarım için önemli bir araçtır. Uygun bir dönüşüm protokolü gen regülasyonu nun temel anlaşılması için genetik ve moleküler biyoloji çalışmalarının hızlandırılmasına yardımcı olabilir8. Bakterilerde genetik dönüşüm doğal olarak gerçekleşir; ancak, bitkilerde, yapay moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak yapılır9,10. Agrobacterium tumefaciens t-DNA aktararak bitkilerde taç safra hastalığına neden olan bir toprak kaynaklı, Gram-negatif bakteri, onun Ti plazmid bir bölge, bir tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine11,12. Bitkilerde, A. tumefaciens-aracılı dönüşüm gen modifikasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir çünkü konak genom13içine T-DNA kararlı ve düşük kopya sayısı entegrasyonu yol açar. Transgenik pirinç ilk olarak 1990'ların ortalarında japonica çeşitleri14'te Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü ile üretildi. Bu protokol kullanılarak 4 aylık bir süre içinde %10-30 oranında dönüşüm verimi ile çeşitli transgenik hatlar elde edilmiştir. Çalışma, başarılı dönüşüm için iki kritik adım olduğunu göstermiştir: biri olgun tohumlardan embriyojenik nasır indüksiyonu ve diğeri de bitkilerde daha yüksek dönüşüm verimliliği sağlayan birlikte ekimi sırasında bakteri kültürüne fenolik bir bileşik olan asetozipon eklenmesidir14,15. Bu protokol yaygın japonica16,17,,18,19 yanı sıra indica20,21,,22,,23 ve tropikal japonica24,25gibi diğer çeşitleri küçük değişiklikler ile kullanılmıştır. Nitekim, pirinç dönüşümünü açıklayan makalelerin% 80'den fazla bir araç olarak Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü13kullanın. Bugüne kadar, birkaç genetik dönüşüm protokolleri nasır indüksiyon16,17,,18,19için bir başlangıç malzemesi olarak pirinç tohumu kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak, çok az nasır üretimi için eksplandan olarak genç çiçeklenme hakkında bilinmektedir. Genel olarak, fonksiyonel genomik ve mahsul geliştirme çalışmaları için hızlı, tekrarlanabilir ve verimli bir gen dönüşümü ve rejenerasyon protokolü oluşturmak önemlidir.
Son yıllarda, CRISPR-Cas9 teknolojisinin ilerlemesi gen fonksiyonunu anlamak ve bitki ıslahı için tarımsal olarak önemli iyileştirmeler sunmak için hassas bir genom düzenleme mekanizması sonuçlandı26,27. CRISPR aynı zamanda erkek üreme gelişimi ve hibrid üretimin manipülasyon için önemli bir umut vaat ediyor. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak bir gen nakavt sistemi kullandık ve verimli bir pirinç geni dönüşüm protokolüile birleştirerek genç çiçeklenmeleri eksektif olarak kullandık ve böylece üreme gelişimi için istikrarlı erkek steril çizgileri oluşturduk.

<table><tbody><tr><td>1-Naftalinasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, 4-Diklorofenoksiasetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurin (6-BA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Asetosiringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Aneurin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Susuz etanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik pepton</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>Sığır özü</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Kazein asit hidrolizatı</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt (II) klorür hekzahidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat pentahidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz susuz</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodyum tuzu, Dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS Dijital SLR ve Kompakt Sistem Fotoğraf Makineleri</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Tam Otomatik Döner Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>İnositol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>İyot</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Demir (II) sülfat heptahidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartik asit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-prolin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Manganez sülfat monohidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoplar</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum iyodür</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum nitrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Piridoksin Hidroklorür (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum molibdat dihidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskoplar</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Technovit gömme Kitleri 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Almanya</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin Mavi</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Parafin bölümleri için su banyosu</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-aracılı genetik dönüşüm, transgenik Üretim ve pirinçte erkek Üreme gelişimi Çalışmaları için uygulaması

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Erkek kısırlığı genellikle erkek üreme organları / gametfonksiyonel kusurları ile karakterize melez tohum üretimi için önemli bir tarımsal özelliktir. CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisindeki son gelişmeler, belirli bölgelerde ki endojen aday genlerin yüksek düzenleme etkinliği ve zaman kazandıran nakavt mutasyonlarına olanak sağlar. Ayrıca, Pirinç Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm de yaygın birçok kamu ve özel laboratuvarlar tarafından kabul edilmiştir gen modifikasyonu için önemli bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 genom düzenleme araçlarını uyguladık ve OsABCG15'in japonica çeşitlerinde hedeflenen genom düzenlemesi ile üç erkek steril mutant hattını başarıyla oluşturduk. Biz pirinç hibrid tohum üretimi için genetik emasculation mükemmel bir araç sağlayabilir değiştirilmiş Bir Agrobacteriumaracılı pirinç dönüşüm yöntemi kullanılır. Transgenik bitkiler 2-3 ay içinde elde edilebilir ve homozigot transformantlar PCR amplifikasyon ve Sanger dizilimi kullanılarak genotipleme ile tarandı. Erkek steril homozigot çizginin temel henotik karakterizasyonu pirinç erkek üreme organlarının mikroskobik gözlemi, polen canlılık analizi iyot potasyum iyodür (I2-KI) ile yapıldı.

Burada gösterilmiştir pirinç Agrobacteriumtarafından gelecekteki araştırmalar için bir erkek steril çizgi oluşturmak için gen düzenleme teknolojisinin kullanımıdır-pirinç genetik dönüşüm aracılı. İkili vektör konstrüksiyonu için CRISPR-CAS9 aracılı mutagenez osabg15erkek steril hattını oluşturmak için kullanılmıştır. SgRNA OsU3 organizatörü tarafından tahrik edildi, hSpCas9 ifade kaseti çift 35S organizatörü tarafından tahrik edildi ise, ve orta vektör agrobacteriumiçin tasarlanmış tek bir ikil...

Bu çalışma, CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisinin nakavt endojen gen OsABCG15'e ve ardından pirinçte istikrarlı bir erkek steril çizgi üretmek için modifiye edilmiş Agrobacteriumaracılı dönüşüm protokolüne kullanımını açıklamaktadır.

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Nasır üretimi için eksplant olarak genç çiçeklenmeler, hızlı ve verimli bir gen dönüşümü ve gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak ve mahsul üniversiyonu için bir rejenerasyon yöntemi oluşturmak için önemlidir. Nasır üretimi için eksplant olarak genç çiçeklenmeler, hızlı ve verimli bir gen dönüşümü ve gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için rejenerasyon yönteminin oluşturulması nda önemlidir. Bu tekniğin video gösterimi, izleyicinin zaman ve çaba harcamadan istenen transgenik hizalamayı üretmek için malzemeleri koruma sürecini anlamasına yardımcı olacaktır.Onlar yaprak kılıfı ile kaplı olduğundan emin olmak, çeltik alanından veya meyozaşamasında bir sera genç pirinç çiçeklenmeleri toplayarak başlayın. Her çiçeklenmeyi %70 alkol bezi ile silin ve kesmeden önce kurutun. Çiçeklenmeyi steril bir laboratuvar tezgahına getirin ve sterilize edilmiş makasla küçük parçalara bölün, ardından kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın.Nasırı indüklemek için 10 ila 14 gün boyunca 26 santigrat derecede karanlıkta plakayı kuluçkaya yatırın. Dönüşümü gerçekleştirmek için, seçici antibiyotiklerle beyaz EB plakasından tek bir koloniyi 50 mililitrelik konik steril test tüpünde aynı antibiyotikleri içeren beş mililitre likit YEB ortamına aktarın. Bakteriler 0,5 OD 600 büyüyene kadar 250 kez g ve 25-28 santigrat derece bir orbital shaker üzerinde tüp çalkalayın.250 mililitrelik konik bir şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mililitre YEB ortamına bir mililitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve dört saat boyunca 250 kez g ve 28 santigrat derecede bir orbital shaker üzerindeki şişeyi sallayın. Bakteri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4, 000 g kültür santrifüj. Supernatant atın ve aam as orta ile pelet resuspend, sonra 0,4 bir OD 600 süspansiyon seyreltin.Kuluçka sonra, 150 mililitre steril şişe içine yaklaşık 150 sağlıklı açık sarı embriyojenik calli toplamak. Şişeiçine bakteri hücresi süspansiyon 50 ila 75 mililitre ekleyin ve sonra 10 ila 20 dakika için calli batırmak için orta taze AAM olarak 10 ila 25 mililitre ekleyin, zaman zaman sallayarak. Şişeden bakteriyel süspansiyonu dikkatlice dökün ve calli'yi steril filtre kağıdıyla kurulayın, ardından NBD AS orta ile bir Petri kabına yerleştirin ve filtre kağıdıyla kapatın.Calli'yi 25-28 derecede karanlıkta üç gün boyunca kuluçkaya yatırın, bakteriyel aşırı büyüme kontrol edin. Üç günlük birlikte ekimden sonra calli'yi filtre kağıdı kullanarak steril bir Petri kabına aktarın, ardından temiz bir bankta iki saat boyunca havakuru. Calli'nin filtre kağıdına yapışmadığından emin olun ve bunları birincil seçim ortamı NBD2'ye aktarın.İki hafta sonra, taze seçim ortamı içeren yeni bir plaka eşit calli aktarın, sonra farklılaşma için taze MS orta calli hareket ve daha fazla sürgünler çoğaltmak için litre Hygromycin başına 10 miligram ile MS orta ateş tomurcukları. Kök indüksiyonu için yeni sürgünleri yarı MS ortamına aktarın ve 25-28 santigrat derecede ışık altında kültürleyin. Dönüştürülmüş bitkiler iki hafta içinde kök üretmelidir.Üreme fenotip gözlemi yapmak için, florid'den palea ve lemma'yı çıkarın ve tüm anthers'ı stereo mikroskop altında görüntüleyin. Polen canlılığını gözlemlemek için, çiçek tezinden önce olgun pirinç başaklarını toplayıp palea ve lemma'yı çıkartın. Altı anthers alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin.Distile su bir damla ekleyin, polen taneleri serbest bırakmak için cımbız ile anther ezmek, sonra iyot çözeltisi iki ila üç damla ekleyin ve bir coverslip ile kaplayın. Düşük büyütme mikroskobu altında slayt gözlemleyin. Siyaha boyanan polen taneleri, rengi olmayan veya boyalı sarı kahverengi taneler bodur veya dejenere olurken daha güçlü bir canlılık gösterir.Enine kesitli mikroskopi yapmak için, slaytları 30 dakika boyunca lekelemek için %0,5 toluidin mavisi solüsyonu kullanın, ardından suyla durulayın ve duman kaputunda kurulayın. Kurutuldıktan sonra, nötr ağaç tutkal ile slaytmühür, yavaşça slayt üzerine bir coverslip yerleştirin ve duman kaputunda kuru, sonra bir mikroskop altında örnek görüntü. Bu protokol pirinç Agrobacterium aracılı genetik dönüşüm tarafından steril bir çizgi oluşturmak için kullanılmıştır.Embriyojenik calli doğrudan dönüşüm için kullanılan veya daha fazla enfeksiyon için daha calli elde etmek için proliferasyon için alt kültüre. 48 saat boyunca birlikte işlendikten sonra, calli ikinci tur seçim ortamına kaydırıldı. 10 ila 14 gün sonra, dönüştürülmüş calli yeni oluşan microcalli gösterdi ise dönüştürülmemiş calli kahverengi döndü ve öldü.Daha sonra sağlıklı ve kremsi renkli calli rejenerasyon ortamına aktarıldı. Dönüştürülmüş calli yavaş yavaş yeşil noktalar gösterdi. Bu yeşil noktalar, sürgün büyümesi için rejenerasyon orta kültürlü ve daha sonra kökleri ikna etmek için yarım MS orta kaymıştır.Daha sonra, iyi gelişmiş kökleri ile sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler hasat edildi. Toplamda 21 rejenere fide elde edildi. Hygromycin bölgesi için PCR amplifikasyonu dönüşüm sıklığının yaklaşık %85.71 olduğunu gösterdi Transformantlar sgRNA hedef bölgelerindeki mutasyonları tanımlamak için genotipli edildi.18 transgenik bitki arasında sekiz heterozigot çizgi ve üç homozigot çizgi CRISPR CAS9 pozitif idi. Homozigot nakavt mutantları temel erkek üreme organı gözlemi ile doğrulandı. osabcg15 anthers vahşi tip daha küçük ve soluk ve olgun polen taneleri yoktu.Osabcg15'te anther morfolojik defektlerini araştırmak için enine kesit mikroskopisi yapıldı. Evre 10,vahşi tip mikrosporlar yuvarlak şekilli hale geldi ve koyu mavi lekeli exine ile aşılandı. Buna karşılık, osabcg15 mikrosporlar çöktü ve bozuldu.Bu protokolü denerken, toplanan malzemenin meyozaşamasında olduğundan emin olmak ve calli'nin hava kurak zamanını kontrol etmek önemlidir.

agrobacterium-mediated-genetic-transformation-transgenic-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Beernink, B. M. ve diğerleri. Mısır fidanlarının doğrudan agroinaşılanması, rekombinant foxtail mozaik virüsü ve şekerkamışı mozaik virüsü bulaşıcı klonlarla enjeksiyon yapılmasıdır. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, gen susturma için rekombinant viral klonların Agrobacterium aracılı olarak mısır fidanlarına aktarılmasını gösteriyor.  Agrobakteriyel enfeksiyon, sistemik viral yayılım ve RNA girişimiyle ilgili fenotipik değişiklikler sürecini özetlemektedir.

Gen Susturması için Rekombinant Viral Klonlarının Mısır Fidanlarına Agrobakteri Aracılı Teslimatı

Bu videoda, bir Agrobacterium tumefaciens ikili vektörü kullanarak pirinç genomunun genetik dönüşümünü gösteriyoruz. Bu bakteri, Agrobacterium virülans proteinlerini kullanarak yabancı bir DNA plazmidinin transferini kolaylaştırır.

Agrobakteri Aracılı Genetik Dönüşüm: Genetik Olarak Tasarlanmış Agrobacterium tumefaciens ile Pirinç Genomunu Genetik Olarak Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Çeşitli çalışma alanlarında model bir tür olarak çok yönlü uygulaması nedeniyle, dar yapraklı muzda (Plantago lanceolata) genetik dönüşüm araç setine ihtiyaç vardır.  Burada, Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon kullanılarak,% 20'lik bir dönüşüm verimliliğine sahip stabil transgenik çizgilerle sonuçlanan bir protokol sunulmuştur.

Agrobacterium tumefaciens-Dar Yapraklı Muzun Aracılı Genetik Transformasyonu

Bu protokol, ilgilenilen gen(ler)i yeşil mikroalgler Chlorella vulgaris'in nükleer genomuna entegre etmek için Agrobacterium tumefaciens aracılı dönüşümün (AMT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve kararlı dönüştürücülerin üretimine yol açar.

Yeşil Mikroalglerin Agrobacterium tumefaciens Aracılı Genetik Mühendisliği ( Chlorella vulgaris)

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Protokol, genom düzenleme teknolojilerini hassas, verimli ve teknik olarak basit bir şekilde kullanarak tasarım yoluyla ıslaha dirençli nişasta pirinç çeşitlerini açıklar.

Genom Düzenleme Teknolojileri ile Fonksiyonel Pirinç için Tasarım Yoluyla Islah

Agrobakteriya aracılı bir Brassicaceae türü olan Rorippa aquatica'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için, kaynak yoğun steril doku kültürü prosedürleri olmadan verimli ve optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Görsel dönüşüm işaretleyicisi ve sürgün yenileme boru hattı kullanılarak yakın klonal transformantlar başarıyla üretildi ve böylece bitkinin su altı ortamına uyum sağlama çalışmalarını ilerletti.

Eşeysiz Amfibi Brassicaceae Türü, Rorippa aquatica'nın Verimli Rejenerasyon Temelli Agrobakteriya Aracılı Dönüşümü

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Öğrenin, pirinçte Agrobacterium-aracılı genetik dönüşüm ve CRISPR-Cas9 gen düzenleme kullanarak erkek kısırlığı üretme yöntemini. Bu protokol, Oryza sativa'da OsABCG15 genini devre dışı bırakarak stabil kısır hatlar oluşturur.

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Daha fazla video keşfet