Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon
14 Ocak 2021
Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.
Erişkin farelerden spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını izole etmek için bu yeni etkili yöntem, meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, şu anda kullanılan FACS emirlerine uygulanabilen geniş bir uyarma spektrumlu düşük sitotoksisite DNA bağlayıcı boya kullanır. Bu yöntem çok basittir.
En zorlu yönü akış sitometri gating ama ayrıntılı gating stratejisi diğer hücre ayırıcılar için protokol adapte yardımcı olmalıdır. Prosedürü gösteren Yu-Han Yeh, Satoshi Namekawa Laboratuvarı'ndan bir araştırma asistanı olacaktır. Sekiz haftalık erkek fareden her iki testis hasat sonra, buz soğuk PBS iki mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak dokuları yerleştirin ve tuluk albuginea kaldırın.
Seminiferous tübülleri hafifçe dağıtmak için testisleri forcep'lerle hafifçe ayırın. Ve tübülleri 100 milimetrelik petri kabında bir damla taze buz gibi pbs'ye aktarın. Tübülleri hafifçe çözmek ve tübülleri az önce gösterildiği gibi üç ek PBS damlacıklarında yıkamak için büşraları kullanın.
Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir kuluçka için iki mililitre dissosiasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüp içine untangled seminiferous tübüller yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüpü kuvöze altı dakika daha dönmeden önce tübülleri 20 kez hafifçe pipetlemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Kuluçka sonunda, pipet dokular ek 20 kez, tüp kuvöz e dönmeden önce.
Üç dakika sonra, tübülleri 10 kez veya görünür doku parçaları kalmayana kadar hafifçe pipetleyin, 10 mililitre FACS tamponu yla ayrışma yı durdurmadan önce. Sonra, spermatozoa ve mümkün olduğunca çok enkaz kaldırmak için ikinci yıkama için taze FACS tampon için ek bir 10 mililitre kullanarak doku süspansiyon iki kez santrifüj. Akış sitometrik analizi için hücreleri lekelemek için, FACS tampon üç mililitre pelet yeniden askıya.
Ve hücre süspansiyonuna 70 mikron naylon hücresüzden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Saydıktan sonra, lekelenmemiş negatif kontrol olarak hücrelerin %10'u buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Ve kalan hücre süspansiyoniçine iyice DCV leke altı mikrolitre karıştırın.
30 dakikalık bir kuluçka dan sonra 37 santigrat derece karanlıkta nazik sallayarak her 10 dakikada bir, hücrelere DNase I beş mikrolitre ekleyin. Ve hücreleri 35 mikron naylon örgü süzgeçten buz üzerinde beş mililitrelik FACS tüpüne filtreleyin. Hücrelerin akış sitometrik analizi için, akış analizi yazılımında yeni bir deneme oluşturun ve çalışma sayfası araçları menüsü altında, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı ile karşı ileri dağılım alanı oluşturmak için yeni yoğunluğu tıklatın.
Logaritmik ölçekte DCV mavi histogram çizimi oluşturmak için yeni histogramı tıklatın. Ve lekesiz örneği işlemeye başlamak için başlat ve kaydet'i tıklatın. Örnek çalışırken, lekesiz hücreleri ileri ve geri dağılım çizimi ölçeğine yerleştirmek için hem ileri hem de yan dağılım PMT gerilimlerini ayarlamak için dedektör ve eşik ayarlarını tıklatın.
DCV mavi histogram logaritma ilk on yıl içinde DCV negatif popülasyonun konumunu bulmak için jappy kanalı için PMT voltajayarlayın. Ardından, lekelenmemiş örneği boşaltmak için dur'u tıklatın. Lekeli numuneyi kısa bir süre girdaplayıp yükledikten sonra, örnek için yeni bir çalışma sayfası oluşturmak için sonraki tüpü tıklatın.
Sitometreyi altı etkinliğe en az bir kez 10 almak için ayarlayın ve başlat ve kaydet'i tıklatın. Ardından, ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım genişliği oluşturmak için yeni yoğunluk seçeneğini tıklatın. Ve DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk çizer doğrusal bir ölçekte.
İleri dağılım alanı ve geri dağılım alanı yoğunluğu çiziminde, hücrelerin çoğunu içerecek şekilde hücre adı verilen bir kapı çizmek ve küçük enkazı dışlamak için çokgen aracını kullanın. Bu geçidi ileri dağılım yüksekliğine karşı ileri dağılım genişliği çizimine uygulayın ve tek hücreolmayan hücreleri hariç tutmak için tek bir hücrenin kapısını çizmek için dikdörtgen aracını kullanın. Tek hücrenin kapısını DCV mavisine karşı DCV kırmızı yoğunluk çizimine uygulayın ve genişletilmiş bir profili yakalamak için ölçeği ayarlayın.
Lekelenmemiş hücreleri ve yan popülasyonu dışlamak için bir DCV kapısı çizmek ve doğrusal ölçekte Bir DCV mavi histogram çizimine geçit uygulamak için çokgen aracını kullanın. Üç ana zirvefarklı 1C, 2C ve 4C DNA içeriğine atıfta bulunur. Doğrusal ölçekte ikinci bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun.
Ve 1C ve 4C popülasyonlarını bulmak için plan üzerine DCV kapısı arka kapı. Doğrusal ölçekte başka bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun. Ve 1C popülasyonuna bir kapı çizmek için elips aracını kullanın.
4C popülasyonuna sürekli bir eğri yle geçit vermek için çokgen aracını kullanın. Ve doğrusal bir ölçekte başka bir DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk arsa oluşturun. 4C tek kapı oluşturmak için çokgen aracını kullanın.
Yan dağılım arsa yeni bir ileri, pachytene, diploten ve leptoten, zigot spermatosit kapıları oluşturmak için elips aracı kullanın. Tüm kapılar çizildiğinde, üç popülasyonun kapı içinde sürekli sırada olduğundan emin olmak için 4C kapısı için uygulamak için doğrusal ölçekte yeni bir DCV mavisi ile DCV kırmızı renkli nokta çizimi oluşturun. Ardından, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı yoğunluğuna karşı yeni bir ileri dağılım alanı oluşturun ve saf yuvarlak spermatid popülasyonu olarak hücrelerin birleşik boyutunu seçin.
Sıralamadan sonra, ayrılmış leptoten, zigotene, pachyten e-pişen ve diploten spermatosit fraksiyonlarının temsili saflıkları genellikle SYCP3 ve Gamma H2AX immünboyama tarafından doğrulanan %80 ile %90 arasındadır. Yuvarlak spermatid hizip saflığı Sp56 ve H1t boyama ile birlikte DCV ile çekirdek boyama ile teyit edilebilir, ve aynı zamanda tipik olarak yaklaşık 90%Izole hücre popülasyonlarının canlılığı genellikle% 95 üzerinde ve tek bir yetişkin fare her fraksiyonun ortalama toplam verimleri genellikle çeşitli downstream analizi için yeterlidir. Sitolunan hücreler spermatogenez sırasında gen ekspresyonunu ve regülasyonlarını daha iyi keşfetmek için çeşitli yeni nesil sıralama analizleri için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yetişkin fare testislerinden canlı meiyotik ve post-meiyotik germ hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunmaktadır. Düşük sitotoksisiteye sahip bir DNA bağlayıcı boya ve floresanla aktive edilen hücre ayıklama (FACS) yöntemi kullanılarak, araştırmacılar çeşitli uygulamalar için yüksek derecede zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları elde edebilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Üreme Biyolojisi
Arkaplan
- Spermatogenik hücrelerin izolasyonu, mayoz ve spermatogenezin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler yüksek sitotoksisite içerebilir ve bu durum hücre canlılığını kısıtlayabilir.
- Bu yöntem, izolasyon sırasında hücre canlılığını artırmayı amaçlamaktadır.
- Akış sitometrisi kapılama (gating), sürecin kritik bir adımıdır.
Çalışmanın Amacı
- Spermatosit ve spermatidleri izole etmek için verimli bir protokol geliştirmek.
- Mayozdaki moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırmak.
- Protokolün diğer hücre ayırıcı cihazlara uyarlanması için ayrıntılı bir kapılama (gating) stratejisi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yetişkin erkek farelerden testislerin hasat edilmesi.
- Düşük sitotoksisiteye sahip, menekşe ışığıyla uyarılan bir DNA bağlayıcı boyanın kullanımı.
- Floresan aktive hücre ayırma (FACS) yönteminin uygulanması.
- Ayrıntılı bir akış sitometrisi kapılama (gating) stratejisinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Canlı meiyotik ve post-meiyotik germ hücrelerinin başarılı şekilde izole edilmesi.
- Spermatojenik hücre popülasyonlarının yüksek düzeyde zenginleştirilmesi.
- Yöntemin çeşitli FACS sistemlerine uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Araştırmacılar için basit bir protokolün sunulması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, izole edilmiş germ hücrelerinin canlılığını artırır.
- Spermatogenezin incelenmesi için değerli bir araç sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar, mayozdaki genetik ve epigenetik faktörlerin araştırılmasını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Canlı spermatojenik alt popülasyonların izolasyonu, reprodüktif biyolojideki hedeflerin mekanistik olarak risklerinin azaltılmasına ve germ hattını hedefleyen terapötik keşiflere olanak tanır. Bu yöntem, aşağı akış omiks ve fonksiyonel analizler için yüksek saflıkta ve canlı hücreler sağlayarak hedef doğrulamada öngörücü güveni destekler. Standart menekşe lazerli FACS platformlarıyla uyumluluğu, keşif iş akışları genelinde erişilebilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Saflaştırılmış leptoten/zigoten, pakiten ve diploten spermatosit fraksiyonlarını kullanarak mayoz ve spermatogenez yolaklarındaki terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yaygın olarak bulunan menekşe lazerli hücre ayırıcılarla uyumlu, düşük sitotoksisiteye sahip bir boyama yaklaşımı sağlayarak ekipman engellerini azaltır.
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel takip için %95'ten fazla canlılığa sahip canlı hücrelerin izole edilmesi yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: DCV boyama yoluyla kantitatif DNA içeriği okumaları (1C, 2C, 4C) oluşturarak, analiz tekrarlanabilirliği için standartlaştırılmış ploidite tabanlı kapılama sağlar.
- Operasyonel Değer: FACS tabanlı tarama hatları için kritik bir ön adım olan fare testislerinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Bilimsel Değer: RNA-seq gibi tutarlı alt uygulamalar için uygun, yüksek derecede saflaştırılmış spermatid ve spermatosit fraksiyonları (%80–90 saflık) elde eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Mayozun genetik ve epigenetik düzenleyicilerini incelemek için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlayarak, hedef-hipotez uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Mekanistik çalışmalar için canlı germ hücreleri sağlayarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Bilimsel Değer: Germ hattı hedef doğrulamasındaki mekanistik belirsizliği azaltarak, riski ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle hücresel bağlamın kritik olduğu germ hattını modüle eden terapötikler için, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlama aşamasına kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Moleküler profilleme için belirlenmiş meiyotik evrelerin izole edilerek hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Tutarlı hücre süspansiyon kalitesi sağlayan standardize disosiyasyon ve boyama protokolleri aracılığıyla analiz hazır hale getirir.
- Analitikler: DCV floresansı ile ploidi çözünürlüğüne sahip kantitatif okumalar sunarak, farklı deneysel koşullar arasındaki hücresel durumların karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İnsan spermatogenezi ile translasyonel ilişkisi olan bir murin model sistemi sağlayarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve hedef sınıfı genelinde canlı germ hücrelerini izole etmek için yeniden kullanılabilir, FACS uyumlu bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mayotik ilerlemedeki mekanistik açıklık yoluyla hedef doğrulamada öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Detaylı kapılama stratejisi ve düşük sitotoksisiteye sahip boya kullanımı ile standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Üreme hedefi programlarındaki geç aşama biyolojik risklerin azaltılmasıyla iyileştirilmiş devam/dur kararları.
- Portföy Etkisi: Saflaştırılmış hücre alt kümelerindeki fonksiyonel doğrulamaya dayalı olarak germ hattı hedeflerinin riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Çok parametreli DCV analizi için akış sitometrisi kapılama (gating) ve floresan kompanzasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Violet-lazer eksitasyon kapasitesine (405 nm) sahip FACS cihazlarına erişime bağımlıdır.
- Operatörler ve laboratuvarlar arasında doku disosiyasyonu ve boyama zamanlamasının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, disosiyasyon tamponunun ve inkübasyon koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Yöntem şu an için yetişkin fare testislerinde valide edilmiştir; immatür veya insan dokusuna uygulanabilirliği daha fazla araştırma gerektirmektedir.
