Name: Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Öğrenin, bölünmüş luciferaz komplemantasyon testi ile canlı memeli hücrelerde Golgi-rezidant Tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimleri nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, düşük ekspresyon seviyelerinde hassas protein-protein etkileşimi analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Polonya'nın Krakow kentindeki Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/23/D/NZ3/01314 no'lu hibe ile desteklenmiştir.

1. İfade plazmidlerinin oluşturulması
<ol><li>Bir topoloji tahmin aracı kullanarak ilgilenilen proteinlerin membran topolojisini inceleyin.</li>
	<li>Klonlama stratejisini, füzyon proteinleri Golgi membranlarına yerleştirildikten sonra daha büyük ve daha küçük fragmanların sitoplazmaya bakacağı şekilde tasarlayın. Burada sunulan örnekte olduğu gibi, ilgili proteinlerin hem N- hem de C-termini sitoplazmik olarak yönlendirilmişse, proteinleri sekiz olası şekilde etiketleyin (bkz. Şekil 1B). İlgilenilen proteinlerden birinin veya her ikisinin N- veya C-terminusu ışığa yönelikse, etiketlemeyi hariç tutun.</li>
	<li>Standart klonlama protokollerini izleyerek ilgilenilen genleri uygun ekspresyon vektörlerine (bakınız Malzeme Tablosu) alt klonlayın. NOT: Bazı etiketleme seçenekleri yetersiz yakınlık, yetersiz yönlendirme veya uzamsal kısıtlamalar nedeniyle çalışmayabileceğinden, tüm olası yönlendirmelerin sınanması önerilir.</li>
</ol>2. Plazmidlerin ekspresyonunun hücrelere geçici transfeksiyonu
<ol><li>Yapışkan HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile toplayın ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri (2 x 104/100 μL/kuyu) şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 delikli bir plakaya yerleştirin. Toplam kuyu sayısını, replikalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonlara ve kontrollere uyacak şekilde ayarlayın. NOT: Termal kaymaları en aza indirmek ve gece boyunca buharlaşmayı önlemek için plakanın yalnızca iç 60 kuyusunu kullanmaya çalışın. Malzeme Tablosunda belirtilenler gibi poli-D-lizin kaplı plakaların kullanılması şiddetle tavsiye edilir, aksi takdirde sonraki yıkama adımları sırasında hücreler ayrılabilir.</li>
	<li>Hücreleri standart koşullarda (37 °C, %5 CO2) gece boyunca kültüre alın.</li>
	<li>Ertesi gün, 1.1 numaralı maddede elde edilen ekspresyon plazmidlerinin istenen kombinasyonları ile hücreleri transfekte edin.<ol>
<li>İfade plazmidlerini serumsuz bir ortamda seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu) her yapı için 6.25 ng / μL'ye kadar.</li>
		<li>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipit-DNA oranında ekleyin ve üreticinin talimatına göre inkübe edin.</li>
		<li>Belirlenen kuyucuklara 8 μL lipid: DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini nazik bir dönüşle karıştırın. Bu, her iki ekspresyon yapısının 50 ng / kuyucukta transfeksiyonu ile sonuçlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standart koşullarda hücreleri 20-24 saat kültürleyin (37 °C, %5 CO2). NOT: Hücrelerin daha uzun süre kültürlenmesi, fragmanlar arasında spesifik olmayan bir ilişkiyi teşvik edebilecek daha yüksek füzyon protein ekspresyonu seviyelerine neden olabilir.</li>
</ol>3. Orta değişim
<ol><li>Ertesi gün, şartlandırılmış ortamı her bir kuyucukta 100 μL serumsuz bir ortamla değiştirin. Hücrelerin orta değişimde ayrılmadığından emin olun. NOT: Bu adım, furimazin çalışma çözeltisinin eklenmesinden 2-3 saat önce yapılmalıdır. Serum yoksunluğu, furimazinin otolüminesansının neden olduğu arka planı en aza indirir.</li>
</ol>4. Furimazin çalışma çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>Ölçümden hemen önce, 1 hacim furimazini 19 hacimlik bir seyreltme tamponu (20 katlı seyreltme) ile karıştırın. NOT: Hazırlanacak furimazin çalışma çözeltisinin toplam hacmi, analiz edilecek bireysel kuyucukların sayısına bağlıdır (furimazin çalışma çözeltisi, hücre kültürü ortamına 1: 5 oranında eklenir, bu nedenle, daha önce 100 μL serumsuz bir ortam ile doldurulmuş her bir kuyucuğa, furimazin çalışma çözeltisinin 25 μL'si eklenmelidir).</li>
	<li>Furimazin çalışma solüsyonunu belirlenmiş kuyucuklara (25 μL/kuyu) ekleyin. Plakayı elle veya yörüngesel bir çalkalayıcı kullanarak yavaşça karıştırın (örneğin, 300-500 rpm'de 15 sn).</li>
</ol>5. Lüminesans ölçümü
<ol><li>Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.<ol>
<li>37 ° C'de yapılacak deneyler için plakayı belirtilen sıcaklıkta 10-15 dakika dengeleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analiz edilecek kuyuları seçin.</li>
	<li>0,3 sn entegrasyon süresi ile ışıltıyı okuyun. Gerektiğinde 2 saate kadar parlaklığı izlemeye devam edin.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlar için ortalama değerleri ve standart sapmaları hesaplayın.</li>
	<li>Birden fazla karşılaştırmayla tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin.</li>
	<li>Faiz kombinasyonları için elde edilen ortalama bir lüminesansı, karşılık gelen negatif kontroller için elde edilen ortalama bir lüminesansa bölerek katlama değişim değerlerini hesaplayın. Sonuçları değerlendirin. NOT: Burada önerilen veri analizine yaklaşım, test edilen kombinasyon için elde edilen lüminesansın, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesanstan istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olması ve aynı zamanda bu iki değerin oranının 10'u aşması durumunda etkileşimin talep edilebileceğini varsayar.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, bölünmüş lusiferaz kompleman testi kullanılarak NST'ler gibi Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasında oluşan heterolog komplekslerin gösterilmesini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Veri analizi ve yorumlanması için önerilen yaklaşım, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansın, daha büyük parça ile kaynaşmış ilgili proteinlerden birinden ve daha küçük parça ile kaynaşmış bir bakteri kökenli kontrol proteininden oluşan karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen ...

Bu makalede, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, geçici olarak transfekte edilmiş insan hücrelerinde Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin varlığını kontrol etmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, nükleotid şeker taşıyıcılarına (NST'ler) karşı en kapsamlı şekilde test edilmiştir, ancak N- ve / veya C-termini sitoplazmaya bakan diğer Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri için de olumlu sonuçlar elde edebildik.
Araştırma grubumuz, NST'lerin makromoleküllerin glikozilasyonundaki rolünü araştırmaktadır. NST'ler, organellar membranın sitoplazmik tarafına bakan N- ve C-termini ile Golgi ve/veya ER'de yerleşik tip III membran proteinleridir1. NST'lerin, glikoziltransferazları substratlarıyla beslemek için nükleotid ile aktive olmuş şekerleri organel zarları boyunca taşıdığı düşünülmektedir. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler oluşturur2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ayrıca, farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir6,11. NST'lerin fonksiyonel olarak ilişkili glikozilasyon enzimleri ile kompleksler oluşturduğu da gösterilmiştir12,13,14. NST'lerin ve fonksiyonel olarak ilişkili Golgi'de yerleşik proteinlerin etkileşimlerini incelemek için günümüzde kullanılan floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) tabanlı FRET yaklaşımına bir alternatif aradık, bu yüzden bölünmüş lusiferaz kompleman testini test etmeye karar verdik. Bir NST ile fonksiyonel olarak ilişkili bir glikozilasyon enzimi arasındaki yeni bir etkileşimi tanımlamamızı sağladı9.
Bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son modifikasyonu olan NanoBiT, burada sunulan protokolde kullanılmaktadır15. Lusiferaz enziminin (örneğin, NanoLuc) iki parçadan yeniden yapılandırılmasına dayanır - büyük BiT veya LgBiT olarak adlandırılan büyük olanı, 17.6 kDa'lık bir protein ve küçük BiT veya SmBiT olarak adlandırılan sadece 11 amino asitten oluşan küçük olanı. İlgilenilen iki protein, tamamlayıcı parçalarla kaynaştırılır ve geçici olarak bir insan hücre hattında ifade edilir. İki füzyon proteini etkileşime girerse, hücre geçirgen bir substratın eklenmesiyle in situ olarak bir lüminesans üretilir. Bu iki parça, kaynaştıkları ilgili proteinler arasındaki bir etkileşimle bir araya getirilmedikleri sürece minimum afinite ile ilişkilendirilmeleri için optimize edilmiştir.
Genel olarak, biyolüminesans bazlı yöntemlerin floresan bazlı yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Biyolüminesan sinyaller daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir, çünkü arka plan lüminesansı lusiferaz kaynaklı sinyale kıyasla ihmal edilebilir16. Buna karşılık, floresan temelli yaklaşımlar genellikle otofloresan fenomeninin neden olduğu nispeten yüksek bir arka plandan muzdariptir. Ayrıca, biyolüminesans, analiz edilen hücrelere floresandan daha az zararlıdır, çünkü eski durumda numuneyi uyarmaya gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı, PPI'ları in vivo olarak incelemeye yönelik biyolüminesan yaklaşımlar, Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) gibi yaygın olarak kullanılan floresan yöntemlerden daha fazladır.
Protokolümüz, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansı, kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesansa yönlendirmeye dayanmaktadır. İkincisi, daha büyük bir parça ile kaynaşmış test edilen proteinlerden birini ve daha küçük bir parça ile kaynaşmış bir kontrol proteinini (örneğin, HaloTag) içerir. İkincisi, memeli proteinlerinin hiçbiriyle etkileşime girmesi beklenmeyen bakteriyel kökenli bir proteindir. Bu proteini bir kontrol olarak kullanmak, analiz edilecek Golgi'de yaşayan protein çiftlerinin topolojisinde sınırlamalar getirir. Memeli hücrelerinde bu protein sitoplazmada sentezlendiğinden, ilgilenilen her iki proteinin de en az bir sitoplazmik kuyruğu olmalıdır.
Bu yaklaşım, ÜFE'lerin ilk taraması için özellikle yararlı olabilir. İlgilenilen füzyon proteinleri, uygulanacak diğer yaklaşımlar için yetersiz olan seviyelerde ifade edildiğinde tercih edilen yöntem haline gelebilir. Benzer şekilde, bölünmüş lusiferaz kompleman testi, ilgili proteinler yüksek seviyelerde eksprese edilirse en iyi seçenek olabilir, ancak bu, hücre altı lokalizasyonlarını olumsuz yönde etkiler veya spesifik olmayan etkileşimleri zorladığı bilinmektedir. Daha küçük fragman sadece 11 amino aside sahip olduğundan, daha büyük etiketler kullanıldığında bölünmüş lusiferaz kompleman testi uygulanabilir. Son olarak, burada sunulan durumda olduğu gibi, diğer teknikler kullanılarak elde edilen verileri daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yapışık memeli hücre hattı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lizin 96 oyuklu Beyaz/Şeffaf Düz Tabanlı TC ile tedavi edilmiş Mikroplaka, Kapaklı</td><td>Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü santrifüjü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü takviyeleri (ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, L-glutamin, penisilin, streptamisin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT fragmanları</td><td></td><td></td><td></td>ile etiketlenmemiş ilgilenilen protein(ler)i kodlayan ekspresyon plazmitleri</tr><tr><td>FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Mikroplaka Okuyucu (veya farklı bir lüminesans mikroplaka okuyucu)</td> <td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr>Kullanılan <td></td><td></td><td></td><td>hücre hattına adanmış büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Standart moleküler klonlama için malzemeler ve reaktifler (bakteriler, termostabil polimeraz, restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, nükleik asit saflaştırması için malzemeler ve reaktifler)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT MCS Başlangıç Sistemi</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>Bu kit, ilgilenilen proteinlerin farklı oryantasyonlarda NanoBiT fragmanları ile etiketlenmesini sağlayan vektörlerin yanı sıra SmBiT ile kaynaşmış HaloTag proteinini kodlayan kontrol plazmidi ve pozitif bir kontrol plazmid çifti içerir.</td></tr><tr><td>Nano-Glo Canlı Hücre Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>Bu kit, canlı hücrelerde NanoLuc aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan bir substrat olan furimazin ve özel bir seyreltme tamponu içerir.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı içermez</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veri analizi için yazılım (örn. GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

golgi-resident tip iii membran proteinleri tarafından oluşturulan heterolog komplekslerin bölünmüş luciferaz komplemantasyon testi kullanılarak gösterilmesi

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

Bu protokolün amacı, nükleotid şeker taşıyıcıları (NST'ler) tarafından oluşturulan heterolog kompleksleri göstermek için bölünmüş lusiferaz komplemansiyonunun en son varyantının uygulanabilirliğini araştırmaktır. Bu ER ve Golgi'de yerleşik multitransmembran proteinleri, substratlarıyla glikozilasyona aracılık eden enzimleri sağlamak için sitoplazmik olarak sentezlenmiş nükleotid şekerlerini organel membranları boyunca taşır. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler olarak bulunur. Farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir. Tekniğin NST heteromerizasyonu fenomenini incelemek için uygun olup olmadığını doğrulamak için, daha önce birkaç başka yolla ilişkili olduğu gösterilen iki Golgi'de yerleşik NST'nin bir kombinasyonuna karşı test ettik. Lusiferaz kompleman testi, Golgi'de yerleşik membran proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle uygun görünmektedir, çünkü genellikle protein yanlış lokalizasyonunu tetikleyen ve yanlış pozitif riskini artıran yüksek ekspresyon seviyeleri gerektirmez.

Bu yaklaşımda en güvenilir verileri elde etmek için tüm olası kombinasyonlar test edilmelidir (bkz. Şekil 1). Paralel olarak, pozitif ve negatif kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, etkileşime girdiği bilinen iki proteinden oluşmalıdır, bunlardan biri daha büyük parça ile kaynaştırılır ve diğeri daha küçük parça ile kaynaştırılır. Negatif kontrol ideal olarak, aynı şekilde etiketlenmiş iki etkileşimsiz tip III membran proteininden oluşmalıdır. Bununla birlikte, böyle bir kontrolün ...

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Protokolümüz, düşük ekspresyon seviyelerinde canlı hücrelerde endoplazmik retikulum ve golgi kompleksinin çoklu transmembran proteinleri arasındaki etkileşimleri tanımlamaya ve analiz etmeye izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, genellikle hücresel sağlığa zararlı olan ve protein subhücresel lokalizasyonunu bozabilecek yüksek aşırı ekspresyon seviyelerinden kaçınmaya izin veren özel hassasiyettir. Yapışan HEK293 T hücresi kültürünü tripsinizasyon ile hasat edin ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.Hücreleri şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kopyalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonları ve kontrolleri barındırmak için toplam kuyu sayısını ayarlayın. Daha sonra, hücreleri standart koşullarda gece boyunca kültürleyin.Ertesi gün, hücreleri istenen ekspresyon plazmit kombinasyonları ile transfekte edin. Plazmitleri serum içermeyen bir ortamda her yapı için mikrolitre başına 6.25 nanograma seyreltin ve lipid bazlı transfeksiyon reaktifini ekleyin. Uygun bir lipit / DNA oranı ekleyin.Plazmitleri üreticinin talimatına göre inkübe edin. Daha sonra, belirlenen kuyucuklara sekiz mikrolitre lipit DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini yumuşak bir rotasyonla karıştırın ve hücreleri standart koşullarda 20 24 saat boyunca kültürleyin.Ertesi gün, her bir oyuktaki şartlandırılmış ortamı 100 mikrolitre serum içermeyen bir ortamla değiştirin ve hücrelerin ortam değişiminde ayrılmadığından emin olun. Lüminesansı ölçmeden hemen önce, bir hacim furimazini 19 hacim seyreltme tamponu ile karıştırın. Her bir oyuğa 25 mikrolitre furimazin çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı elle veya bir orbital çalkalayıcı ile hafifçe karıştırın.Plakayı bir lüminesans mikro plaka okuyucusuna yerleştirin ve plakayı 37 santigrat derecede 10 15 dakika dengeleyin. Analiz edilecek kuyuları seçin ve 0,3 saniyelik bir entegrasyon süresi ile lüminesansı okuyun. Gerektiğinde lüminesansı iki saate kadar izlemeye devam edin.Bu protokol, N ve C terminalleri sitoplazmaya bakan golgi'de yerleşik tip üç zar proteini olan SLC35A2 ve SLC35A3 olmak üzere iki nükleotid şeker taşıyıcısı üzerinde test edildi. Sekiz olası etiketleme seçeneği vardı ve elde edilen füzyon proteinleri sekiz olası şekilde bir araya getirilebilirdi. Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlara karşılık gelen ortalama bağıl lüminesans birimleri veya RLU değerleri burada gösterilmektedir.Kombinasyonların üçü için elde edilen RLU değerleri, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilenlerden önemli ölçüde daha yüksekti. İlgilenilen kombinasyonlar için oran değerleri elde etmek için, RLU değerleri ilgili kontroller için elde edilen RLU değerlerine bölünmüştür. 10 ile 1000 arasındaki oranlar, belirli etkileşimlerin oldukça göstergesidir.SLC35A2 ve SLC35A3 etkileşime girdiği fikrini destekleyen iki kombinasyon vardı. Bu verileri doğrulamak için, HA etiketli SLC35A2 veya SLC35A3, en yüksek bağıl lüminesans ile sonuçlanan kombinasyonla birlikte ifade edildi. Birlikte transfeksiyon için değişen miktarlarda plazmitler ve kodlama HA etiketli NST varyantları kullanıldı ve bu da RLU değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı doza bağlı bir azalma ile sonuçlandı.En kritik şey, proteinin kişisel çıkarlarını mümkün olan tüm yollarla ele almak ve bazı etiketleme yönelimleri yanlış negatif sonuçlar üretebileceğinden, olası tüm kombinasyonları test etmektir. En iyi performans gösteren kombinasyon seçildikten sonra, ilgili etkileşimin dinamikleri, örneğin zaman içinde ilgi kompleksinizi bozan aracıları veya koşulları belirlemek için izlenebilir.

demonstration-heterologous-complexes-formed-golgi-resident-type-iii

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Bu video, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lusiferaz tamamlama testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen proteinler, lusiferaz enziminin küçük ve büyük parçalarına etiketlenir. Proteinler etkileşime girdiğinde, büyük ve küçük fragmanlar, belirli bir substratın varlığında ölçülebilen parlak ışıldama açığa çıkaran aktif bir enzim kompleksi oluşturmak üzere birleşir.

Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Burada büyük tümör baskılayıcı (Latı) kinaz aktivitesinin ölçmek için bir luciferase tabanlı biyoalgılayıcı mevcut-Merkez kinaz yolu sinyal Hippo içinde. Bu biyoalgılayıcı temel ve translasyonel araştırma Hippo yol regülatörleri vitro ve in vivoaraştıran yönelik çeşitli uygulamalar vardır.

Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Öğrenin, bölünmüş luciferaz komplemantasyon testi ile canlı memeli hücrelerde Golgi-rezidant Tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimleri nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, düşük ekspresyon seviyelerinde hassas protein-protein etkileşimi analizi sağlar.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi (Video) | JoVE Journal

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

Daha fazla video keşfet