Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi
10 Eylül 2020
Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.
Protokolümüz, düşük ekspresyon seviyelerinde canlı hücrelerde endoplazmik retikulum ve golgi kompleksinin çoklu transmembran proteinleri arasındaki etkileşimleri tanımlamaya ve analiz etmeye izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, genellikle hücresel sağlığa zararlı olan ve protein subhücresel lokalizasyonunu bozabilecek yüksek aşırı ekspresyon seviyelerinden kaçınmaya izin veren özel hassasiyettir. Yapışan HEK293 T hücresi kültürünü tripsinizasyon ile hasat edin ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
Hücreleri şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kopyalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonları ve kontrolleri barındırmak için toplam kuyu sayısını ayarlayın. Daha sonra, hücreleri standart koşullarda gece boyunca kültürleyin.
Ertesi gün, hücreleri istenen ekspresyon plazmit kombinasyonları ile transfekte edin. Plazmitleri serum içermeyen bir ortamda her yapı için mikrolitre başına 6.25 nanograma seyreltin ve lipid bazlı transfeksiyon reaktifini ekleyin. Uygun bir lipit / DNA oranı ekleyin.
Plazmitleri üreticinin talimatına göre inkübe edin. Daha sonra, belirlenen kuyucuklara sekiz mikrolitre lipit DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini yumuşak bir rotasyonla karıştırın ve hücreleri standart koşullarda 20 24 saat boyunca kültürleyin.
Ertesi gün, her bir oyuktaki şartlandırılmış ortamı 100 mikrolitre serum içermeyen bir ortamla değiştirin ve hücrelerin ortam değişiminde ayrılmadığından emin olun. Lüminesansı ölçmeden hemen önce, bir hacim furimazini 19 hacim seyreltme tamponu ile karıştırın. Her bir oyuğa 25 mikrolitre furimazin çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı elle veya bir orbital çalkalayıcı ile hafifçe karıştırın.
Plakayı bir lüminesans mikro plaka okuyucusuna yerleştirin ve plakayı 37 santigrat derecede 10 15 dakika dengeleyin. Analiz edilecek kuyuları seçin ve 0,3 saniyelik bir entegrasyon süresi ile lüminesansı okuyun. Gerektiğinde lüminesansı iki saate kadar izlemeye devam edin.
Bu protokol, N ve C terminalleri sitoplazmaya bakan golgi'de yerleşik tip üç zar proteini olan SLC35A2 ve SLC35A3 olmak üzere iki nükleotid şeker taşıyıcısı üzerinde test edildi. Sekiz olası etiketleme seçeneği vardı ve elde edilen füzyon proteinleri sekiz olası şekilde bir araya getirilebilirdi. Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlara karşılık gelen ortalama bağıl lüminesans birimleri veya RLU değerleri burada gösterilmektedir.
Kombinasyonların üçü için elde edilen RLU değerleri, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilenlerden önemli ölçüde daha yüksekti. İlgilenilen kombinasyonlar için oran değerleri elde etmek için, RLU değerleri ilgili kontroller için elde edilen RLU değerlerine bölünmüştür. 10 ile 1000 arasındaki oranlar, belirli etkileşimlerin oldukça göstergesidir.
SLC35A2 ve SLC35A3 etkileşime girdiği fikrini destekleyen iki kombinasyon vardı. Bu verileri doğrulamak için, HA etiketli SLC35A2 veya SLC35A3, en yüksek bağıl lüminesans ile sonuçlanan kombinasyonla birlikte ifade edildi. Birlikte transfeksiyon için değişen miktarlarda plazmitler ve kodlama HA etiketli NST varyantları kullanıldı ve bu da RLU değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı doza bağlı bir azalma ile sonuçlandı.
En kritik şey, proteinin kişisel çıkarlarını mümkün olan tüm yollarla ele almak ve bazı etiketleme yönelimleri yanlış negatif sonuçlar üretebileceğinden, olası tüm kombinasyonları test etmektir. En iyi performans gösteren kombinasyon seçildikten sonra, ilgili etkileşimin dinamikleri, örneğin zaman içinde ilgi kompleksinizi bozan aracıları veya koşulları belirlemek için izlenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hassas bir bölünmüş lusiferaz tamamlanma deneyi kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmaya dönük uçlara sahip Golgi yerleşikli tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermektedir. Bu yöntem, hücresel sağlığa verilen zararı en aza indirgeyerek, düşük ekspresyon seviyelerindeki etkileşimlerin tanımlanmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Protein etkileşimleri
- Membran biyolojisi
Arka Plan
- Çoklu transmembran proteinler arasındaki etkileşimlere odaklanın.
- Protein etkileşimlerini, zararlı aşırı ekspresyon etkileri olmaksızın değerlendirmeyi hedefleyin.
- Biyolojik sistemler olarak Golgi kompleksinin ve endoplazmik retikulumun kullanımı.
Kullanılan Yöntemler
- Bölünmüş lusiferaz tamamlanma deneyi
- İnsan HEK293 T-hücresi kültürü
- Ekspresyon plazmitlerinin transfeksiyonu
Ana Sonuçlar
- SLC35A2 ve SLC35A3 arasındaki anlamlı etkileşimlerin belirlenmesi.
- RLU değerleri spesifik etkileşimleri göstermiş olup, 10 ile 1000 arasındaki oranlar güçlü etkileşimlere işaret etmiştir.
- HA etiketli ko-ekspresyon ve doz bağımlı analizler aracılığıyla etkileşimler doğrulanmıştır.
Sonuçlar
- Çalışma, canlı hücrelerdeki membran proteinlerinin etkileşimlerini başarıyla açıklamaktadır.
- Hücre biyolojisinde protein ilişkilerinin araştırılması için değerli bir yöntem sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Golgi yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog komplekslerin gösterilmesi, membran proteini etkileşimleri için hedef doğrulamadaki kritik bir zorluğu gidermektedir. Bölünmüş lusiferaz komplementasyon analizi, düşük ekspresyon seviyelerinde hassas deteksiyona olanak tanıyarak aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktları azaltır ve erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini destekler. Bu yetenek, mekanistik risk azaltmayı güçlendirir ve membran proteini hedefleri için portföy elemesini bilgilendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Canlı hücrelerde, fizyolojik olarak ilgili ekspresyon seviyelerinde protein-protein etkileşimlerinin doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Glikozilasyon yolaklarında rol oynayan membran protein komplekslerinin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Spesifik heteromerik etkileşimleri arka plan gürültüsünden ayırt ederek mekanistik belirsizliği azaltır.
- İleri geliştirme için membran protein hedefleri seçerken öngörü güvenilirliğini kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Protein çiftleri arasındaki etkileşim gücü için kantitatif ve tekrarlanabilir bir okuma (RLU) sağlar.
- Analiz geliştirme sürecinde yanlış negatifleri minimize etmek için etiketleme yönelimlerinin sistematik olarak değerlendirilmesine olanak tanır.
- Protein etkileşim modülatörlerinin taranması için analiz standardizasyonunu ve ölçeklenebilirliğini destekler.
- Kontrol ve deneysel kombinasyonlar kullanarak analiz performansının güvenilir bir şekilde kıyaslanmasını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Memeli hücrelerdeki etkileşimleri modelleyerek hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Farklı koşullar altında karmaşık dinamiklerin izlenmesine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç araştırmalarını destekler.
- Keşif aşamasındaki etkileşim haritalamasından, membran protein fonksiyonunun preklinik doğrulamasına kadar süreklilik sağlar.
- Membran protein hedefli programlar için riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu bölünmüş lusiferaz komplementasyon analizi, membran protein kompleksleri için güçlü hedef doğrulaması ve analiz geliştirme sağlayarak, keşiften preklinik aşamaya uzanan sürekliliğe entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücrelerde protein kompleks oluşumu ve yolak haritalama için hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Farklı koşullar arasındaki etkileşim güçlerini karşılaştırmak için kantitatif ve tekrarlanabilir lüminesans çıktıları sağlar.
- Analizler: Spesifik etkileşimleri kontrollerden ayırt etmek için RLU oranlarının istatistiksel analizini sunar.
- Translasyonel Araştırma: Pertürbasyonlara yanıt olarak etkileşim dinamiklerinin izlenmesini kolaylaştırarak biyobelirteç stratejilerine bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde çeşitli membran protein etkileşimlerini incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Membran protein hedef validasyonunda öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Ekipler arası benimseme için assay tekrarlanabilirliğini, standardizasyonunu ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Yalancı pozitifleri ve negatifleri minimize ederek go/no-go karar kalitesini ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Membran protein hedeflerinin ilerletilmesi için riskle uyumlu önceliklendirme sağlar.
Uygulama Hususları
- Membran protein biyolojisi ve canlı hücre analiz tasarımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Lüminesans plaka okuyuculara ve hücre kültürü altyapısına erişim gereklidir.
- Sıkı kontrol tasarımı ve etiketleme yönelimlerinin sistematik değerlendirmesini gerektirir.
- Farklı hücre hatları veya membran protein sınıfları için adaptasyon gerektirebilir.
- Etiketleme, protein fonksiyonunu veya lokalizasyonunu bozarsa yanlış negatif sonuçlar ortaya çıkabilir.
