Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama
1 Mayıs 2021
Burada sunulan, mikrobiyolojik tabanlı yöntemler ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile daha sonra tanımlanması ile benzersiz bir göz çubuğu ve kültür tabanlı zenginleştirme adımı kullanılarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik fare konjonktival commensal bakterilerin izolasyonu ve amplifikasyonu için bir protokoldür.
Bu yöntem, gözlerin düşmanca ortamı nedeniyle zorlayıcı olan uygulanabilir oküler konjonktival mikroorganizmaları tanımlar. Oküler mikrobiyomun var olup olmadığını ve göz hastalığında bakteri varlığının nasıl değiştiğini cevaplana yardımcı olabilir. Hem uygulanabilir hem de canlı olmayan mikroorganizmaları tanımlayan DNA diziliminin aksine, bu yöntem sadece uygulanabilir mikroorganizmaları tanımlar ve bu da öküler kommenal topluluğun daha net anlaşılmasını sağlamakla sonuçlanır.
Çalışmalar, otoimmün olmayan ve otoimmün kuru göz gibi göz hastalıklarını teşhis örülmenin zor olduğunu ve benzersiz oküler bakteri varlığına sahip olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, ayırt edici mikrobiyal imzalara sahip göz hastalıklarını teşhis etmek için kullanılabilir. Sürünecek fare sayısı için uygun miktarda pamuk vuruşu ve kürdanı otomatik olarak kapatarak başlayın, ardından 1/2 santimetre uzunluğunda pamuk vuruşu parçasını kıstırın ve vuruş dağılmadan hemen önce duran düz bir gözenekli tabaka oluşturmak için kenarları çekerek alay edin.
Bükülmüş olarak gerilmiş parçayı kürdan ucunda hafifçe tutarak vuruşu kürdanın keskin uçlarından birinin etrafında döndürün. Bitmiş göz çubuğu, uçtan yaklaşık 1/2 ila bir santimetre uzağa uzanan ucun üzerine gerilmiş çok ince bir pamuk tabakasına sahip olacaktır. Sürüntüleri küçük bir behere yerleştirin, aşağı doğru sürün, sonra örtün ve otoklavlayın.
Kontaminasyonu ve 0,5 mililitre steril beyin kalbi infüzyonunu veya BHI ortamını etiketli 1,5 mililitre steril mikro santrifüj tüplerine en aza indirmek için çalışma alanını bir dezenfektanla temizleyin. Tüpleri bir rafa takın ve rafı buza yerleştirin. Deneysel fareler, boş steril kafes, oda sıcaklığı anestezisi, 25 kalibre iğne ve bir mililitre şırınga ile kafesi içeren fare anestezi istasyonundan başlayarak soldan sağa iş akışını ayarlayın.
Daha sonra, buz üzerinde aliquoted BHI, sterilize göz çubukları, yağlama damlaları, biyolojik tehlike kabı, temiz kağıt havlular ve% 70 izopropanol spreyi içeren bir göz tarama istasyonu hazırlayın. Son olarak, oda sıcaklığında kan agar plakaları, 10 mikroliter pipet, 10 mikroliter steril tek kullanımlık uç ve biyolojik tehlike atık kabı ile kaplama istasyonunu kurun. Bir arka ayak pedi sıkarak farenin düzgün bir şekilde uyuşturulduğından emin olun.
Sadece hareket yoksa devam edin. Anesteziye bulaşmış fareleri işlemek için bir el, göz bezini ve kültürü işlemek için diğer ellerinizi atayın. Fareyi kafesten çıkarın ve sol gözü açıktayken yan tarafına yerleştirilmiş çalışma yüzeyinin üzerine yerleştirin.
Eldivenli ellere izopropanol püskürtün ve kağıt havlu ile kurulayın. Etiketli BHI mikro santrifüj tüpünü özel medya işleme eliyle çıkarın ve ikisini rafa geri yerleştirin. Göz küreğinin pamuk kaplı ucunu BHI'ye batırın, ardından fazla sıvıyı çıkarmak ve çıkarmak için ucu iç tüpe iki kez döndürürken küveti tüpten çekin.
Fare taşıma eliyle, fareyi boynun scruff'ından hafifçe tutun. Diğer taraftan, göz bezinin ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin. Göz küresini hafifçe bastırın ve bezi alt göz kapağı ile göz arasındaki bir pencere yıkama hareketinde 10 kez hareket ettirerek sürekli basıncı koruyun.
Kürke dokunmadan, çubuğun ucunu yerleştirildiği yere dik olarak hafifçe çıkarın. Çubuk pamuk tarafını doğrudan BHI ortamlı etiketli bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sürünmüş göze bir göz damlası uygulayın.
İsterseniz, kontrol numuneleri için cilt veya kürk sürüntüleri alın, eldivenleri her çubuk arasında uygun şekilde sterilize edin. İşiniz bittiğinde, fareyi kafese geri döndürün. Bez buz üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin, ardından eldivenli elleri sterilize edin ve ucu 10 dönüş boyunca medyada karıştırırken çubuğu çıkarın.
Ucu tüpün iç duvarına doğru beş dönüş boyunca döndürerek çubuğu çekin ve biyolojik tehlike kabına atın. Her fare için işlemi yineleyin. Tüpü statik olarak 37 santigrat derecede bir saat inkübe ederek numuneyi zenginleştirin.
Kuluçka sırasında, fare gözü çubuğu başına bir oda sıcaklığı TSA plakasını etiketleyin veya çubuğu kontrol edin ve ikiye bölün. Zenginleştirilmiş numuneleri inkübatörden çıkarın ve buza yerleştirin. Karıştırmak için örnekleri kısaca girdaplayın, ardından numunenin 10 mikrolitresini TSA plakasına koyun ve bir şerit oluşturmak için plakayı eğin.
Bunu iki kez tekrarlayın. Plakaların çizgiyi bölen diğer tarafında, her biri 10 mikrolitre örnekle 10 nokta oluşturun. Tabakları 37 santigrat derecede 18 saat, iki gün ve dört gün boyunca agar plakalarının kurumasını önleyen temiz bir odada kuluçkaya yatırın.
Şeritlerdeki kolonileri sayın. Morfolojiye dikkat edin ve morfolojik olarak benzer izolatlar için çubuk başına koloni oluşturma birimlerini hesaplayın. Şeritlerde benzersiz organizmaların yakalanmadığı noktalara bakın.
Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bakterileri orta ve sağ plakalarda yoğun bir şekilde kapladık. Tipik olarak, göz bezi plakalarında çok daha az bakteri gözlemledik. Bazen, göz sürüntülerinin geri kazanılabilir bakteriler vermeyebileceğini unutmayın.
Burada C57 siyah altı fareden morfolojik olarak farklı izolelere sahip temsili bir göz çubuğu plakası gösterilmiştir. Her ayrı izole için, koloniler şeritte sayıldı ve göreceli bolluk hesaplandı ve çizildi. Mikrobiyolojik karakterizasyon için, bakteriler ana bir TSA plakası üretmek için bireysel fare gözü çubuk plakalarından seçildi.
Büyüme ortaya çıktığında, mikropları karakterize etmek veya tanımlamak için ek testler yapıldı. Ana plaka, ilgili izolatları genişletmek için yeterli inokülyum sağlamak için kullanılmıştır. İzoleleri tanımlamak için bir gecede bir TSA plakası çizildi ve inkübe edildi ve MALDI-TOF MS yapıldı.
Burada gösterilen izolat örnekleri Streptococcus acidominimus ve Aerococcus viridans olarak tanımlanmıştır. Erkek ve dişi C57 siyah altı fareden önemli ölçüde farklı düzeylerde östensel organizmalar elde edildi. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagulates negatif Staphylococci ve E.coli C57 siyah altı N fareden izole edildi.
Bu protokolü denerken, en iyi sonucun çubuğu ince bir şekilde kaplayarak ve göz çubuğu adımı sırasında zaman alarak elde edileceğini unutmayın. MALDI-TOF MS'e erişim sınırlıysa, izolatlar mikrobiyolojik ve biyokimyasal testlerle tanımlanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, aerobik ve fakültatif anaerobik fare konjonktival kommensal bakterilerin izole edilmesi ve çoğaltılmasına yönelik bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, özgün bir göz sürüntüsü ve kültür tabanlı zenginleştirme adımının ardından, mikrobiyolojik yöntemler ve MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak yapılan tanımlamayı içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Oftalmoloji
- Kommensal Bakteriler
Arka Plan
- Gözün elverişsiz ortamı nedeniyle, canlı oküler konjonktival mikroorganizmaları tanımlamak zordur.
- Bu yöntem, oküler komensal topluluğun daha net anlaşılmasını sağlayarak canlı mikroorganizmalara odaklanır.
- Benzersiz bakteriyel imzalar, teşhisi zor göz hastalıklarıyla ilişkili olabilir.
- Bu yöntem, hem canlı hem de canlı olmayan mikroorganizmaları tespit eden DNA dizileme ile karşıtlık göstermektedir.
Çalışmanın Amacı
- Oküler mikrobiyomun varlığını belirlemek.
- Bakteriyel varlığın göz hastalıklarında nasıl değiştiğini araştırmak.
- Mikrobiyal imzalara dayalı bir göz hastalığı tanı yöntemi geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerin sürüntü örneği alımı için pamuk ve kürdanların otoklavlanması.
- Hazırlanan pamuklarla farelerin konjonktival bölgesinden sürüntü alınması.
- İzole edilen bakterilerin kültür temelli zenginleştirilmesi.
- MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak bakterilerin tanımlanması.
Ana Sonuçlar
- Fare konjonktiva örneklerinden canlı mikroorganizmalar başarıyla tanımlanmıştır.
- Yöntem, oküler kommensal topluluğuna dair bilgiler sağlamıştır.
- Bakteriyel varlık ile göz hastalıkları arasında potansiyel bağlantılar öne sürülmüştür.
- Bu yaklaşım, ayırt edici mikrobiyal imzalara sahip göz hastalıklarının teşhisini geliştirebilir.
Sonuçlar
- Protokol, canlı oküler mikroorganizmaları etkili bir şekilde izole eder ve tanımlar.
- Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, oküler mikrobiyom hakkında daha net bir anlayış sunar.
- Bu yöntem, mikrobiyal profillere dayalı göz hastalıklarının teşhisinde belirleyici olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Canlı oküler kommensal bakterilerin izole edilmesi, mikrobiyal değişimleri izlemek için hastalığa özgü bir sistem sağlayarak göz hastalığının preklinik modellerinde hedef doğrulamasını mümkün kılar. Bu yöntem, canlı mikroorganizmaları ölü olanlardan ayırt ederek mekanistik risk azaltmayı destekler ve biyobelirteç keşfindeki öngörü güvenini artırır. Mikrobiyolojik profillemeyi, oftalmoloji geliştirme süreçlerinde terapötik hipotezlerin risklerini azaltmaya yönelik translasyonel bir araç olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Farklı hastalık koşulları altında canlı konjonktiva mikroorganizmalarını izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Farelerde komensal çeşitliliğini tanımlamak için kültür tabanlı bir yöntem sağlayarak oküler hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Mikrobiyal imzaları hastalık durumlarıyla ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler ve hedef güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Oküler örneklerdeki aerobik ve fakültatif anaerobik cinsleri zenginleştirerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışları için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü zenginleştirme ve ekim aşamalarını içeren sürüntü tabanlı bir teknik aracılığıyla assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
- Ölçeklenebilirlik: Deneysel gruplar ve hastalık modelleri genelindeki mikrobiyal değişimlerin izlenmesi için platformun yeniden kullanım potansiyelini vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Benzersiz bakteriyel varlığı, otoimmün ve otoimmün olmayan kuru göz gibi teşhisi zor göz hastalıklarıyla ilişkilendirerek hastalıkla olan ilgisini tartışır.
- Operasyonel Değer: Oküler mikrobiyotanın boylamsal izlenmesine olanak tanıyarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Translasyonel biyobelirteç uyum stratejileriyle uyumlu olarak, mikrobiyal imzalara dayalı kararları destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem keşifteki hipotez testlerinden preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, mikrobiyal profilleme yoluyla öncü bileşik tanımlamayı destekler.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, oküler yüzey immünitesindeki yolak katılımını açıklığa kavuşturmak için canlı mikroorganizmaları izole ederek hipotez testlerini nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Kültür tabanlı zenginleştirme ve sürüntü başına koloni oluşturan birimler gibi kantitatif çıktılar aracılığıyla analiz hazırlığını tanımlar.
- Analitikler: Ekiplerin gruplar arası koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan morfoloji, bağıl bolluk ve MALDI-TOF MS tanımlaması gibi ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerindeki mikrobiyal değişikliklerin izlenmesine olanak tanıyarak biyobelirteç uyumunu destekler ve yöntemi preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi tek kullanımlık bir teknik olarak değil, çeşitli oküler hastalık modelleri genelinde mikrobiyolojik profilleme için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörücü güven, hedef doğrulaması, oküler mikrobiyom çalışmalarındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Düşük bolluğa sahip oküler örneklerden canlı bakteri izolasyonunun standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Oftalmoloji programlarında daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Hastalık fenotipleriyle bağlantılı mikrobiyal imzalara dayalı riskten arındırılmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Mikrobiyolojik teknikler, anaerobik kültür işleme ve MALDI-TOF MS kullanımı konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Enstrümantasyon ve analitik altyapı gereksinimleri arasında otoklav, inkübatör, ekim ekipmanları ve tanımlama için kütle spektrometresi yer almaktadır.
- Sürüntü hazırlama, zenginleştirme süresi ve kullanıcılar arası ekim tutarlılığı için ekipler arası standardizasyon gereklilikleri.
- Farklı türler veya oküler yüzey erişilebilirliği için potansiyel ayarlamalar dahil olmak üzere, model sistemler arası adaptasyon değerlendirmeleri.
- Kaynak materyal tarafından desteklenen pratik sınırlamalar: düşük geri kazanılabilir bakteri sayısı, izolat elde etmede nadiren karşılaşılan başarısızlıklar ve uygun sürüntü tekniğine olan bağımlılık.
