Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu
26 Eylül 2020
Bu protokol, kalp yetmezliği ni modelleyen enfarktan farelerin epikardiyumuna 3Boyutlu biyobaskılı bir yama naklini amaçlamaktadır. Anestezi, cerrahi göğüs açıklığı, sol anterior inen kalıcı ligasyon (LAD) koroner arter ve kalbin enfarktüs bölgesine biyobbaskılı bir yama uygulaması ile ilgili ayrıntıları içerir.
Her 10 dakikada bir, Avustralya'da biri kalp krizi geçiriyor. Bu hasarlı kalp kası ile onları bırakabilir, ve kalp yetmezliğine yol açabilir. Kandan ya da deriden gelen kök hücreleri atan kalp hücrelerine dönüştürebileceğimizi bulduk.
Sonra, eğer bu yeniden programlanmış hücreleri, 3Boyutlu biyoyazıcımıza, bioink kullanarak koyarsak, insanların kendi hücreleriyle eşleşen hücrelerle kalp yamaları yapabileceğimize inanıyoruz. Ketamin ksilazin kullanan derin anestezili fare, 20 gauge kateter kullanılarak entübe edilir. İzleyicienin entübe edilmesinden sonra, fare dikkatlice bir ısıtma yastığına yerleştirilir ve daha sonra fare ağırlığına göre hedef hacmi otomatik olarak ayarlayan ventilatöre bağlanır.
% 2 izo florür kullanarak hafif bir anestezi altında, fare sadece iyot ve etanol ile temiz. Kalbi ortaya çıkarmak için sol lateral torakotomi yapılır. Bir retraktör üçüncü ve dördüncü kaburga arasında yerleştirilir.
Perikard dikkatlice kesilir. LAD mikroskop altında tespit etti. LAD ligasyon adımı için, LAD ile dikiş kesme önlemek önemlidir.
Bu nedenle, 3.06 ipek dikiş bir takviye parçası gösterildiği gibi kalp üzerine yerleştirilir, aynı yönde çalışan ve sadece LAD üstüne. Lad, 7.06 ipek sütür kullanarak izole edilir ve kalıcı olarak ligated edilir. Bu kalp krizi alıyor kalbin beyazlatma sağlar.
Bu remodeling yol açacaktır ve sol ventrikül zamanla başarısız olacaktır. Bir 3D biyobaskılı kalp yama bir 3D biyoyazıcı kullanılarak laboratuvarda oluşturulur. Bu katman katman sağlar, kalp hücrelerinin birikimi, hücre ve hidrojellerin bir arada kullanarak.
Bu videoda ve şimdi bu resimde yüzen bir görebilirsiniz. Burada altı kuyu plaka bir kuyuda epifloresan ışık mikroskopisi ile görüntülendiğinde yama görünümünün bir görüntüsüdür. Yama hücre çekirdekleri için Hoechst leke ile lekeli olmuştur, ve bu mavi leke de otofloresan hidrojeller vurguluyor.
Bu, videoda gösterilene benzer şekilde transplantasyona uygun sağlam bir allatin yamasıdır. Bizim yöntemimizle, çoğu yamalar 14 ile 28 gün arasında, kültürde parçalanmaya başladı, burada parçalanan başka bir yamanın bu görüntüsünde gösterildiği gibi. Yamaları nakletmek için en uygun zamanın biyobaskıdan sonra yedinci gün ile 14.
Bu, kardiyak hücreler içeren yamalar, doku olgunlaşma bir dereceye kadar gösteren dövmeye başladı, ama yamalar parçalanmaya başlamadan önce oldu. Yama cerrahi odasına getirilir ve yavaş yavaş ve dikkatle farenin bir parçası kalbin üstüne yerleştirilir. Dikkatle de infer inealanına taşınır.
Retraktör yavaş yavaş kaldırılır. Son olarak, üçüncü ve dördüncü kaburga birlikte 6.0 prolene dikiş kullanılarak kapatılır. Bir kas ile birlikte, kaburga kapalı, cildin kapatılması takip.
Göğüs kapatıldıktan sonra, fare Antisedan ve furosemid enjekte edilir. Yavaş yavaş, fare bağımsız nefes alma aktivitesini yeniden kazanır ve parmak sıkışmasına yanıt verir. Fare yakından izlenir ve anesteziden uyandığında kendi kafesine yerleştirilir.
Bu resim, biyobbaskılı yama fare kalp üstüne oturacak kabul alanı ile gösterir. Sonuç olarak, 3D biyobaskılı allatin jelatin yamaları bizim yöntemimiz ile, epikardyum üzerine, miyokard enfarktüsü bir fare modeli nde nakledilebilir göstermiştir. Biyobaskı aşamasında, aljenatin jelatin hidrojeller reolojik özellikleri nedeniyle mükemmel yazdırılabilirliğe sahiptir, hücrelere zarar vermeden ekstrüzyona izin verir, ancak 3D biyobaskı sonrası ve transplantasyon sırasında yapılarını korumak için biyomekanik güce sahiptir.
Bizim yöntem yaygın olarak uygulanabilir olması muhtemeldir ve aynı zamanda 3D biyoprinted yamalar birden fazla grup test etmek için uygundur. Örneğin, farklı hücresel içeriklerle.
Genel Bakış
Bu çalışma, kalp yetersizliğini modellemek amacıyla, enfarkte farelerin epikardiyumuna 3D biyoyazdırılmış bir yamamanın nakli için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, ayrıntılı cerrahi adımları ve kardiyak hücrelerden yapılmış biyoyazdırılmış yamaların kullanımını içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak doku mühendisliği
- 3B biyobaskı
- Miyokard enfarktüsü modelleri
Arka Plan
- Kalp krizleri, kalp kasının hasar görmesine ve kalp yetmezliğine yol açabilir.
- Kök hücreler, atan kalp hücrelerine yeniden programlanabilir.
- 3D biyobaskı, biyomürekkep kullanılarak kalp yamalarının oluşturulmasına olanak tanır.
- Yamanın transplantasyonu için optimal zamanlama, başarının anahtarıdır.
Çalışmanın Amacı
- Biyobasılmış kalp yamalarının transplantasyonu için bir yöntem geliştirmek.
- Yama oluşturmak için hastaya özgü hücrelerin kullanımının fizibilitesini değerlendirmek.
- Yamaların etkinliğini, miyokard enfarktüsü oluşturulmuş fare modeli üzerinde incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerde anestezi için ketamin ksilazin kullanımı.
- Kalbi açığa çıkarmak için sol lateral torakotomi.
- Sol ön inen koroner arterin kalıcı ligasyonu.
- Kalbe 3B biyobasılmış yamaların transplantasyonu.
Ana Sonuçlar
- 3D biyoyazdırılmış yamalar iyi yazdırılabilirlik ve biyomekanik dayanıklılık göstermiştir.
- Yamalar, kültürde 14 ile 28. günler arasında parçalanmaya başlamıştır.
- Optimal transplantasyon, biyoyazdırmadan sonraki 7. ve 14. günler arasında gerçekleşmiştir.
- Yöntem, çeşitli biyoyazdırılmış yama kompozisyonlarının test edilmesi için uygundur.
Sonuçlar
- 3D biyoyazıcıyla üretilmiş aljinat-jelatin yamalar başarıyla nakledilebilir.
- Tekniğin kardiyak araştırmalarda yaygın olarak uygulanabilir olması muhtemeldir.
- Gelecek çalışmalar, daha iyi sonuçlar elde etmek için farklı hücresel içerikleri araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu protokol, kardiyak rejenerasyon araştırmalarındaki kritik bir darboğaza odaklanmaktadır: fare miyokard enfarktüsü modellerinde 3B biyobasılmış terapötik yamaların güvenilir in vivo testlerinin yapılması. Cerrahi transplantasyonla ilişkili prosedürel değişkenliği ve mortaliteyi azaltarak, mühendislik ürünü dokuların istatistiksel olarak daha güçlü preklinik değerlendirmesine olanak tanır. Bu gelişme, fonksiyonel doğrulama çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırarak erken evre biyolojiklerin ve biyomalzemelerin risklerinin azaltılmasını desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Doku nakli ve parakrin sinyalizasyona ilişkin mekanistik hipotezleri doğrulamak için, biyobaskı ile üretilmiş yamaların hastalıkla ilişkili iskemik bir mikroortamda fonksiyonel değerlendirmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kompleks biyolojik materyallerin cerrahi olarak uygulanmasını standartlaştırarak, nakil verimliliğindeki hayvanlar arası değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yapısal korunma ve entegrasyon metriklerine dayanarak yama formülasyonlarının (örneğin, hücre tipleri, hidrojel oranları) karşılaştırılması için tekrarlanabilir bir platform sağlar.
- Operasyonel Değer: Çalışma kohortları genelinde tutarlı cerrahi teslimat sağlayarak biyomalzeme adaylarının orta ölçekli taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İskemik hasarın klinik olarak ilgili bir modelinde, yama aracılı ventriküler yeniden şekillenmenin ve fonksiyonel iyileşmenin boylamsal değerlendirmesini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Azaltılmış kayıplarla istatistiksel olarak anlamlı çalışmalar yürütülmesine olanak tanıyarak doz-yanıt ve zamanlama optimizasyonu deneylerinin uygulanabilirliğini artırır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulaması sonrası ve hastalık modellerindeki etkinlik taraması öncesinde mühendislik ürünü dokuların standartlaştırılmış şekilde iletilmesini sağlayarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Enfarktüre uğramış miyokardda hücre sağkalımı, tutunma ve biyoaktif faktör sekresyonuna ilişkin hipotezlerin test edilmesini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış cerrahi implantasyon ve transplantasyon sonrası izleme aracılığıyla yama tasarımlarının kantitatif karşılaştırmasına olanak tanır.
- Analitikler: Yama performansını sıralamak için histopatolojik ve fonksiyonel veriler (örneğin, enfarkt boyutu, duvar kalınlığı) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Devam/dur kararlarını bilgilendirmek için in vitro maturasyon metrikleri ile in vivo fonksiyonel sonuçlar arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli projeler genelinde farklı kardiyak rejeneratif adaylarını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir cerrahi platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Cerrahi karıştırıcı değişkenleri azaltarak preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Karmaşık doku transplantasyon prosedürlerinin tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Etkinlik değerlendirmelerindeki biyolojik gürültüyü azaltarak erken geliştirme aşamasındaki daha net devam/dur kararlarını destekler.
- Portföy Etkisi: Daha güvenilir preklinik verilere dayanarak, kardiyak rejenerasyon adaylarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Fare kardiyak cerrahisi, anestezi ve ameliyat sonrası bakım konularında uzmanlık gerektirir.
- Hassas LAD ligasyonu için mikro-sütür araçlarına, ventilatörlere ve stereomikroskoplara erişime bağlıdır.
- Yama uygulama ve konumlandırma protokollerinin operatörler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Hücre kaynağına ve hidrojel bileşimine bağlı olarak yama olgunlaşma süresindeki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Akut ve subakut yaralanma modelleriyle sınırlıdır; model adaptasyonu olmadan kronik iskemi çalışmaları için uygun değildir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
