Oküler Mikrovasküler Anjiyogenezin Ex Vivo Koroid Filizlenme Satomu
6 Ağustos 2020
Bu protokol, mikrovasküler proliferasyonun ex vivo modeli olan koroid filizlenme testini sunar. Bu tsay koroidal mikro damarlar çoğalan dahil yolları değerlendirmek ve yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak ilaç tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu Koroid testi yüksek oranda tekrarlanabilir ve Koroidal Anjiyogenez araştırması ve Yaşa bağlı Makula Dejenerasyonu ile ilgilidir, AMD Mikrovasküler davranışın in vivo çalışmalarını tamamlayabilir. Bu test, neovasküler AMD için potansiyel tedaviler olarak bileşikleri taramak veya vahşi tip ve genetik olarak değiştirilmiş fare dokusu kullanarak Koroidal Neovaskülarizasyonda yer alan yolları değerlendirmek için kullanılabilir. Başlamak için, beş mililitre penisilin, streptomisin ve 10 ve beş mililitre ticari olarak temin edilebilen takviyeleri serumla birlikte 500 mililitre tam klasik ortama ekleyin, ardından ortamın 50 mililitresini alikotlayın, bazal membran ekstraktını veya BME'yi gece boyunca buzdolabında iki ila sekiz santigrat derecede çözün.
Buzun üzerine tam bir klasik orta dal koyun. Diseksiyon mikroskobunu, forsepsleri ve makası %70 etanol ile temizleyin. Hücre kültürü kaplarına hazırlayın ve birini diseksiyon mikroskobuna ve diğerini buz üzerine yerleştirin.
Daha sonra her yemeğe 10 mililitre tam klasik orta ekleyin. Diseksiyondan önce gözleri buz üzerinde tam klasik ortamda tutun. Bağ dokusunu ve optik siniri çıkarın, ardından kornea Limbus'un 0,5 milimetre arkasını çevresel olarak kesmek için bir mikro makas kullanın.
Kornea İris kompleksini, vitreusu ve lensi çıkarın. Optik sinire doğru kesik kenara dik bir milimetre kesi yapın ve çevresel bir milimetre genişliğinde bir bant kesin, ardından kompleksin merkezi ve periferik bölgelerini ayırın. Retinayı RPE koroid sklera kompleksinden soymak için forseps kullanın.
Periferik koroid bandını buz üzerinde tam klasik ortamda tutun. Diğer gözü izole edin ve ikinci bir bant kesmek için işlemi tekrarlayın. Dairesel bandı yaklaşık olarak beş ila altı eşit kare parçaya kesin.
30 mikrolitre çözülmüş BME'yi 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunun ortasına ekleyin. BME damlacığının, kenarlara dokunmadan plakanın altında dışbükey bir kubbe oluşturduğundan emin olun. Dokuyu BME'nin ortasına yerleştirin.
Koroid X bitkisini düzleştirmeyin. Dokunun BME içinde genişlemesine izin verin. Jelin katılaşmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, ardından her bir oyuğa 500 mikrolitre tam klasik ortam ekleyin.
Klasik ortamı her gün değiştirin. Koroid filizlenmesi mikroskopla üç gün sonra gözlenebilir. Görüntü J ile koroid filizlenme görüntüsünü açın ve görüntüyü, türü ve gri tonlamalı sekiz biti kontrol edin.
Ardından görüntüyü, ayarlayı, parlaklık kontrastını seçerek ve ayarlayarak kontrastı optimize edin. Filizlerin merkezinde bulunan koroid dokusunun ana hatlarını çizmek ve çıkarmak için sihirli değnek işlevini kullanın. Ücretsiz seçim araçlarıyla görüntünün arka planını kaldırın.
Ardından, görüntüye gidin, eşiği ayarlayın ve mikrovasküler filizleri çevredeki arka plana karşı tanımlamak için eşik işlevini kullanın. F2'ye tıklayın ve bir özet görünecektir. Seçili alanın bir görüntüsünü ileride başvurmak üzere orijinal görüntüyle aynı klasöre kaydetmek için kaydet'i tıklatın.
Bir grup numune ölçüldükten sonra, kaydedilen verileri analiz için kopyalayın. Bu protokol, C 57, siyah altı J faresinde üçüncü günden altıncı güne kadar koroid filizlenmesini incelemek ve ölçmek için kullanıldı. Temsili bir durumda, koroidal filizlenme alanı üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı günlerde sırasıyla 0.38, 1.47, 5.62 ve 10.09 milimetre kare idi.
FFAR4 kaybının koroidal vasküler filizlenme üzerindeki etkileri, FFAR4 dört nakavt ve FFAR4 vahşi tip farelerde koroid filizlenme testi kullanılarak değerlendirildi. FFAR4 nakavt farelerinde filizlenme alanı, altıncı günde FFAR4 vahşi tipine kıyasla koroidal vasküler büyümeyi arttırdı. Ayrıca, bir mikromolar FFAR4 agonisti ile tedavi, altıncı günde tedavi edilmeyen farelere kıyasla koroidal filizlenme alanını azalttı.
Bu test, farmakolojik bileşiklerin anti anjiyojenik potansiyelinin tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesine ve genetik olarak değiştirilmiş fare dokusu kullanılarak Koroidal Neovaskülarizasyonda belirli bir yolağın rolünün varyasyonuna izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mikrovascular proliferasyonu, özellikle koroidal anjiyogenez ve neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) ile ilişkili olarak incelemek için ex vivo bir model olarak koroid filizlenme testi sunmaktadır. Bu test, koroidal mikrovasküler proliferasyonda yer alan yolakların değerlendirilmesine ve hem vahşi tip hem de genetik olarak modifiye edilmiş fare dokuları kullanılarak ilaç tedavilerinin analiz edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Koroidal anjiyogenez
- Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)
- Mikrovasküler davranış
Arka Plan
- Göz hastalıklarında koroidal anjiyogenezin önemi
- In vivo çalışmaları tamamlayan ex vivo modeller
- Gelişmiş içgörüler için genetik olarak modifiye edilmiş fare modelleri
Kullanılan Yöntemler
- Koroid filizlenme deneyi
- Yabani tip ve genetik olarak modifiye edilmiş suşlardan fare dokularının kullanımı
- Koroidal filizlenmeyi gözlemlemek için mikroskopi
Ana Sonuçlar
- Analiz, koroidal filizlenmenin birçok gün boyunca tekrarlanabilir şekilde ölçülmesine olanak tanır
- Knockout farelerde FFAR4 kaybı, vahşi tipe kıyasla koroidal vasküler büyümeyi artırmıştır
- FFAR4 agonisti ile tedavi, knockout farelerde koroidal filizlenme alanını azaltmıştır
Sonuçlar
- Çalışma, farmakolojik bileşiklerin anti-anjiyojenik potansiyelini değerlendirmede assay'in etkinliğini göstermektedir
- Koroideal neovaskülarizasyonda belirli sinyal yolaklarının rolünü vurgulamaktadır
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Alanları
Ex vivo koroid filizlenme testi, neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ilaç keşfi ile doğrudan ilgili olan koroidal mikrovasküler proliferasyonun değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir model sunar. Vahşi tip ve genetik olarak modifiye edilmiş fare dokularını kullanarak anjiyojenik yolakların mekanistik risk analizine olanak tanır ve oftalmoloji geliştirme süreçlerinde hedef doğrulamayı ve öncü madde tanımlamasını destekler. Bu test, fizyolojik olarak ilgili bir doku eksplant sisteminde filizlenme dinamiklerini nicelleştirerek keşif biyolojisi ile preklinik değerlendirme arasında köprü kurar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Anjiyojenik yolakların genetik veya farmakolojik modülasyonuna yanıt olarak koroid sprouting'ini (filizlenmesini) ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Endotelyum, makrofajlar, perisitler ve RPE'yi içeren çok hücreli bir doku bağlamında FFAR4 gibi hedeflerin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Bileşiklerin mikro vasküler sprouting üzerindeki doz bağımlı etkilerini zaman içinde nicelleştirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kontrollü koşullar altında mikrovasküler ağ oluşumunu yansıtan, filizlenme alanına dair kantitatif ve görüntüleme tabanlı çıktılar sağlar.
- Operasyonel Değer: Deneyler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için, tanımlanmış besiyeri değişim takvimleri ile büyüme faktörü azaltılmış BME içinde standartlaştırılmış eksplant ekimi kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Orta ila yüksek verimli bileşik taramaları için 24 kuyucuklu plak formatı ve yarı otomatik ImageJ analizi ile uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Patofizyolojik anjiyogenezin modellenmesi için kritik olan hücre-hücre etkileşimlerini koruyarak, doğal koroid-RPE-sklera mimarisini sürdürür.
- Operasyonel Değer: Filizlenme fenotiplerine olan genetik katkıları belirlemek için vahşi tip ve nakavt dokuların (örneğin, FFAR4) doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Agonist/antagonist etkilerinin filizlenme üzerindeki değerlendirmesine imkan tanıyarak, yolak modülasyonu için preklinik kanıtlar sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan oftalmoloji keşif sürekliliğine, özellikle de AMD'deki anti-anjiyojenik stratejilere uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Yolak inhibisyonu veya aktivasyonuna yanıt olarak meydana gelen filizlenme değişikliklerini nicelleştirerek, anjiyojenik regülatörlerin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Doku tabanlı bir formatta, bileşiklerin etkilerinin sıralanmasına olanak tanıyan tekrarlanabilir ve kantitatif filizlenme metrikleri sunar.
- Analitikler: Mikro vasküler yanıtların kinetik analizini destekleyen zamana bağlı, alan bazlı ölçümler (örneğin, 3. günden 6. güne kadar) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Koroidal neovaskülarizasyonu modellemek için hastalıkla ilgili eksplantlar kullanarak, in vivo AMD modellerine ekstrapolasyonu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler boyunca birden fazla bileşiği veya genetik modeli değerlendirmek için standardize edilmiş, yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Genetik veya farmakolojik perturbasyonları, doğal bir doku bağlamındaki ölçülebilir filizlenme sonuçlarıyla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış doku izolasyonu, BME ekimi, besiyeri değişimi ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: In vivo testlerden önce anti-anjiyojenik aktiviteye dair erken, doku tabanlı kanıtlar sunarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doz-yanıt ve genetik doğrulama verilerine dayalı olarak bileşiklerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Steril koşullar altında fare dokusu diseksiyonu ve eksplant izolasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran ekstraktına (BME) ve faz-kontrast mikroskopisine erişime bağımlıdır.
- Tutarlı filizlenme (sprouting) kantifikasyonu için standartlaştırılmış görüntü analiz iş akışlarını (örneğin ImageJ makrosu) gerektirir.
- Filizlenme metrikleri yorumlanırken eksplant boyutundaki ve doku canlılığındaki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Fare dokusu ile sınırlıdır; türler arası farklılıklar, insan koroid biyolojisine aktarılabilirliği etkileyebilir.
