Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

SM FISH, spesifik RNaz'ın seviyelerini ve lokalizasyonunu doğru bir şekilde ölçer. Bu yöntem, RNA'daki alel varyasyonu ile hücreden hücreye ve aleli analiz etmek için özellikle yararlıdır. Gen transkripsiyonu, hücre biyolojisinde önemli bir süreçtir, SM FISH, tek hücre düzeyinde dış uyaranlara yanıt olarak RNA içeriğinin araştırılmasına izin verir ve mekansal bilgi sağlar.

Östrojen reseptörü agonisti tedavisini takiben, hücreleri kalsiyum ve magnezyum içeren soğuk steril PBS ile yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre fiksasyon tamponu ile 30 dakika boyunca buz üzerinde sabitleyin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 500 mikrolitre% 70 etanol eklemeden önce hücreleri iki kez soğuk steril PBS ile kalsiyum ve magnezyum ile üç dakika boyunca yıkayın. Daha sonra 24 oyuklu plakayı bir parafin plastik film ile kapatın ve plakayı en az dört ve 16 saate kadar dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin.

RNA FISH hibridizasyonunun sonunda, inkübasyonun sonunda hücreleri bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 10 formamid ile desteklenmiş 500 mikrolitre 2X SSC tamponu ile bir kez yıkayın. İnkübasyon sırasında, bir parça parfin plastik filmi, maruz kalmayacak tarafı yukarı bakacak şekilde, bir RNA yüzey dekontamine ile temizlenmiş bir cam Petri kabına yerleştirin ve tabağın kenarları boyunca steril suya doymuş kağıt havlulara yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, GREB1 intron ve GREB1 ekzon prob tamponuna taze hazırlanmış 30 mikrolitrelik damlacıkları parafin plastik filmin temiz tarafına yerleştirin ve steril forseps kullanarak hücre hücrelerinin bir kapak fişini kabarcıklar olmadan her bir damlacığın üzerine nazikçe yerleştirin.

Çanağı parafin plastik film ile kapattıktan sonra, plakayı folyo ile örtün ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede düz, dönmeyen bir yüzeyde inkübe edin. Ertesi sabah, ısıtılmış bir döndürücüde 37 santigrat derecede yıkama başına% 10 formamid ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze 2X SSC tamponunda iki adet 15 dakikalık yıkama için kapak fişlerini 24 kuyulu plaka hücresine geri döndürmek için forseps kullanın. İkinci yıkamadan sonra, DNA'yı bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2X SSC tamponunda mililitre DAPI başına bir mikrogram ile lekeleyin, ardından oda sıcaklığında 2X SSC tamponunda beş dakikalık bir yıkama yapın.

Fazla 2X SSC tamponunu çıkarmak için bir kağıt havlu kullanın ve fazla tuzları gidermek için numuneleri nükleaz içermeyen suda durulayın. Ardından, kapak fişlerini cam kızaklara monte etmek için sertleşmeyen montaj ortamı kullanın ve kapak fişlerini şeffaf oje ile kapatın. Örnek görüntüleme için, beklenen en yüksek yoğunluğa sahip slaytı, bir sCOMS kamerada 60 veya 100 kat yağ objektifi ile donatılmış geniş alan epifloresan mikroskobu aşamasına yükleyin ve objektifin üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin.

Zstack alımı için, DAPI kanalındaki örneğe odaklanın ve DAPI lekeli çekirdeklerin odak dışına çıktığı mesafelerde Zstack'in üstünü ve altını seçin. Her kanal için ışık kaynağından gelen aydınlatma miktarını ve pozlama sürelerini optimize etmek için slaytı kullanın ve fotoğraf ağartmasından ve/veya kamera piksel doygunluğundan kaçınan koşullar altında tüm slaytlardan görüntüler elde edin. Alımdan sonra, görüntüleri dekonvolize etmek ve tüm projeksiyon görüntülerini kullanılan kameranın bit derinliğine göre kaydetmek için 10 döngü agresif bir restoratif algoritma kullanın.

Görüntü analizi için önce GitHub'dan Jüpiter Not Defteri'ni indirin ve Python Anaconda Dağıtım sürümü 3.6 veya üzerini yükleyin. Anaconda istemini açın ve Anaconda için SimpleITK'yi kurmak için kurulum komutunu girin. Anaconda Navigator'ı açın ve Jüpiter Notebook'u başlatın.

Dizinleri ve dosyaları gösteren bir web tarayıcısı açılacaktır. GitHub'dan indirilen Jupiter Notebook'un bulunduğu dizine ulaşmak için dizin yapılarına göz atın. Ardından not defterini açın ve her hücreyi çalıştırmak için Shift ve Enter tuşlarına basın.

Bu temsili deneyde, yapışık meme kanseri hücreleri 24 saat boyunca bir östrojen reseptörü agonisti veya aracı ile tedavi edildi. GREB1 intronik ve ekzonik dizilere karşı spektral olarak ayrılmış prob setleri, yeni ortaya çıkan ve olgunlaşan mRNA'nın aynı anda görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verdi. Daha da önemlisi, östrojen tepki süresi seyrinin bir parçası olduğu gösterilen her hücredeki transkripsiyonel olarak aktif alellerin sayısı işaretlenebilir.

Örtüşen intron ve ekzon noktaları sayılarak, E2 ile tedavi edilen hücrelerin, araçla tedavi edilen hücrelere kıyasla iki veya daha fazla aktif GREB1 aleli sergileyen dört kat artmış hücre fraksiyonuna sahip olduğu belirlendi. İntronlar, yalnızca ekzon dizilerinden oluşan olgun mRNA üretmek için yeni ortaya çıkan mRNA'dan eklendiğinden, hücre başına olgun mRNA sayısı, yeşil noktaların sayısı ölçülerek sayılabilir. Bu verilerin çizilmesi daha sonra olgun GREB1 mRNA hücresinin dağılımındaki kaymaya ve E2 tedavisinden sonra hücre popülasyonundaki agrega kıvrım değişikliğinin gözlemlenmesine izin verir.

C-FISH, birden fazla RNA türünün sırayla araştırılmasına izin verir, MERFISH, çoğullamayı büyük ölçüde artırmak için bir barkodlama tekniğidir ve iFISH, RNA ve proteinleri aynı anda incelemek için kullanılır.