Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Mevcut protokol, retinal dejenerasyon için hücre tedavisi yaklaşımları geliştirmeyi amaçlayan büyük bir hayvan modelinde tüm retinal organoidlerin subretinal dağıtımını ayrıntılı olarak göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, organoidlerin doğrudan hedef dokuya, retinaya verilmesine izin vermesidir. Bu teknik, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa veya leber konjenital amauroz gibi ileri kör edici retinal dejeneratif durumları tedavi etmeyi amaçlamaktadır.

Prosedürü gösteren Dr. Peterson Jones olacaktır. Organoidlerin subretinal implantasyonu için, dört aylık bir gece açlıklı anestezi uygulanan bir kedide 0.5 ila 1 santimetre lateral kantotomi yapmak için Stevens Tenotomi Makası kullanın ve göz kapaklarını açık tutmak için insizyona uygun büyüklükte bir Barraquer göz kapağı spekulumu yerleştirin. Limbusun yanındaki bulber konjonktivayı nazikçe kavramak için 0.5 Castroviejo kornea bağlama forseps ve küçük bir sivrisinek hemostatı kullanın.

Gözü birincil bakışta tutmak ve üçüncü göz kapağını geri çekmek için limbusun hemen bitişiğindeki konjonktivaya saat 4 ve 8 pozisyonlarında iki adet 6-0 ipek sütür yerleştirin. Manipülasyonlarına yardımcı olmak için dikişlerin uçlarını küçük sivrisinek hemostatlarıyla sıkıştırın ve göze nüfuz etmemeye dikkat ederek limbusun kalınlığı boyunca limbustaki saat 12 pozisyonunda başka bir dikiş yerleştirin. Sütürü gevşek bir şekilde düğümleyin, ucu kısa kesin ve gözü ve birincil bakışı tutmak için saat 4 pozisyonunda limbusun hemen bitişiğindeki konjonktivaya bir kalış sütürü yerleştirin.

Bulber konjonktivayı saat 10 ila 2 arasında yansıtın ve konjonktivayı limbustan iki ila üç milimetre kesmek için tenotomi makası kullanın. Konjonktivayı zayıflatın ve sklerayı limbustan üç ila beş milimetre uzaklıktaki saat iki ve 10 vitrektomi liman bölgelerinde açığa çıkarmak için Tenon'un kapsülünü temizleyin. Sklerotomi bölgelerini tanımlamak için kumpaslar kullanın, kedide belirgin olabilecek ana skleral damarlardan kaçının.

Sağ elini kullanan bir cerrah için saat 10 pozisyonundaki alet portunda üç milimetrelik bir bölge için planlama yaparak, önerilen sklerotominin bölgelerine bağlamadan 6-0 veya 7-0 poliglactin haç desenli dikişleri önceden yerleştirin. Dikişler yerleştirildikten sonra, asistanın dünyayı yerinde tutmaya yardımcı olmak için saat 12 pozisyonundaki dikişleri kavramasını sağlayın ve dokuyu sklerotomi bölgesinin yanında tutmak için 0.12 milimetre Castroviejo forseps kullanın. Lensle temas etmekten kaçınmak için optik sinire doğru açılı saat 2 ve 10 pozisyonlarında sklera boyunca 23 gauge vitrektomi portu sokmak için bir trokar kullanır ve uçların vitreus içinde görselleştirilip görselleştirilemeyeceğini belirlemek için sulama portunu hafifçe itmek için bağlama forsepsleri kullanır.

Asistanın, gözün arka segmentinin görselleştirilmesine izin vermek için korneaya Machemer büyütücü sulama vitrektomi lensi yerleştirmesini ve kısmi çekirdek vitrektomi gerçekleştirmek için alet portundan 23 gauge vitrektomi probu kesicisini yerleştirmesini sağlayın. Daha sonra, bir mililitre triamsinolon çözeltisi içeren bir mililitrelik bir şırınganın iğnesini cihaz portuna sokun ve kristal süspansiyonun 250 ila 500 mikrolitresini enjekte edin. Çözelti verildiğinde, vitrektomi probunu alet portundan geçirerek, port retinal yüzeyden uzağa bakacak şekilde optik sinir kafasına yakın olacak şekilde ilerletin.

Vitreal yüzün retinadan ayrılmasına yardımcı olmak için yüksek vakum kullanın, enjektörü alet portundan retina yüzeyine doğru yerleştirin ve kanül ucunu ekstrüde edin. Retina yüzeyinin ucuna hafifçe bastırın ve asistanın retina dekolmanı başlatmak için şırınga pistonuna hafif bir hızlı itme yapmasını sağlayın, istenen boyuta ulaşana kadar retina dekolmanı yavaş bir şekilde artmasına izin vermek için enjeksiyon basıncını azaltın. Retina makası sokulana kadar dekolmanı hafifçe büyütmek için enjektörün 41 gauge kanülünü kullanın ve saat 10 pozisyonundaki skleral portu çıkarın.

Ardından, bu bölgedeki sklerotomiyi büyütmek için lense dokunmaktan kaçınmak için optik sinire doğru yönlendirilmiş düz bir 2.850 milimetre yarık bıçak kullanın. Nakledilen bölgeden kaynaklanan retinal sinir liflerine zarar vermemek için bleb üzerindeki retinotomiyi optik sinirden uzaklaştırın ve kanama riskini azaltmak için büyük retina damarlarını kesmekten kaçının. Organoidleri implante etmek için, genişlemiş sklerotomi yoluyla retinotomi bölgesine doğru organoidlerle yüklü bir cam kılcal damar yerleştirin ve subretinal bleb açıklığına erişime izin vermek için retinotomiyi hafifçe açmak için kılcal damarın ucunu kullanın.

Organoidleri subretinal bleb içine enjekte etmek için asistanın enjektörün pistonuna yavaşça tekrar basmasını sağlayın. BSS organoidleri, organları ilerletmeli ve retinotomi açık bırakmalıdır. Tüm organoidler teslim edildiğinde, kılcal damarı gözden yavaşça çıkarmadan önce cam kılcal damarı birkaç saniye yerinde bırakın ve ani sıvı salınımını önlemeye özen gösterin.

Kılcal damar çıkarıldığında, önceden yerleştirilmiş dikişi çapraz bir düzende kullanarak sklerotomiyi kapatın. Asistanın infüzyon portunu çıkarmasını sağlayın ve sklerotomi sütürünü hızlı bir şekilde bağlayın ve peritomiyi poliglactin sütürleri ile basit bir sürekli düzende kapatın. Lateral kantotomiyi 6-0 poliglactin sütürü ve lateral kanthus yapmak için sekiz rakamlı deri sütürleri ile kapatın ve yaranın geri kalanını kapatmak için basit kesilmiş cilt sütürleri kullanın.

Daha sonra uygun ameliyat sonrası steroid ve antibiyotik kokteylini uygulayın. İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı retinal organoid yüklemesi, enjeksiyon cihazının cam kanülü içinde ve ameliyat sırasında doğrudan görselleştirme ile doğrulanabilir. Subretinal boşlukta organoidlerin varlığı postoperatif olarak oftalmik muayene ve fundus görüntülemesi ile doğrulanabilir.

Ötanaziden önce, organoidlerin pozisyonunu değerlendirmek için konfokal taramalı lazer oftalmoskopi ve spektral alan optik koherens tomografi görüntüleme de yapılabilir. Bu teknikler, retinal organoidlerin nöral retina ile alıcı gözün retinal pigment epiteli arasındaki subretinal boşlukta kalıcılığını göstermek için kullanılabilir. Histolojik ve immünohistokimyasal analizler, immünsüprese bir hayvanda büyük bir gözün subretinal boşluğundaki ksenojenik grafiklerin hayatta kalmasını göstermek için kullanılabilir.

Sadece eğitimli veteriner oftalmologlar veya vitreoretinal cerrahlar gibi vitreoretinal cerrahide yetenekli olanlar, insan gözüne kıyasla kedi gözündeki tür farklılıklarına aşina olanlar bu prosedürü üstlenmelidir. Bu videoda sunulan teknik, vitreoretinal cerrahi tekniklerin kliniklere çevrilmesinde kullanılan diğer büyük hayvan modellerine uygulanabilir olmalıdır.