Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem
June 10th, 2021
Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.
Bükreş, Romanya'dan Nicolae Simionescu Hücresel Biyoloji ve Patoloji Enstitüsü'ne hoş geldiniz. Burada, Viral Transdüksiyon Laboratuvarı'nda, Profesör Vogelstein tarafından geliştirilen AdEasy sistemine dayanan optimize edilmiş bir metodoloji kullanarak adenoviral parçacık üretiminin bir kısmını gösteriyoruz. Bu adenovirüsleri üretmek için teknolojinin ana adımları, birincisi, BJ5183 bakterilerinde pAdEasy-1 plazmid ile GFP içeren pAdTrack'in yeniden birleşmesidir.
İki, adenoviral parçacıkların paketlenmesi. Üç, AD293 hücrelerinde adenovirüs amplifikasyonu. Dört, adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.
Beş, viral titrasyon ve adenovirüs fonksiyonel test. Burada, metodolojinin önemli bir adımını sunacağız. Adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.
Adenovirüslerin saflaştırılması, virüs üreten hücrelerin ve ortamın toplanmasıyla başlar. AD293 hücreleri rekombinant plazmid ile trans enfekte edildi ve adenovirüs paketlendi. Daha sonra adenovirüs art arda gelen daha büyük kültürler tarafından güçlendirildi.
Burada 25 T175 plaka elde ettik ve adenovirüslerin hücre lisatı ve kültür ortamından arındırılmasına başladık. İlk olarak, transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilen GFP'nin yeşil floresanını kontrol ettik. Hücreler hala bağlıysa, kültür çanağı dokunarak veya uzun bir kazıyıcı kullanarak onları ayıracağız.
Hücreler ve ortam toplanır. Şişeler, Falcon tüplerinde de toplanan PBS ile yıkanır. Hücreler santrifüjleme ile peletlenir.
Adenovirüslerin daha fazla arındırılması için hücre peletini ve ortamı saklayın. Bu adımda, hasat sürecini hızlandırmak için bir meslektaşının yardımı takdir edilir. Hücre peletı GFP ifadesi nedeniyle yeşildir.
Pelet, hücrelerin bozulmasını kolaylaştıracak hipertonik Tris tamponunda yeniden biriktirilir. Hücre lizisi için sıvı nitrojen kullanıyoruz ve kuru gaz 37 dereceye kadar ısındı. Virüs zarar görene kadar üçten fazla döngü yapmayın.
Hücre bozulmasının verimliliğini artırmak için hücre homojenizesini 23 kalibrelik bir şırınga iğnesi ile dikkatlice geçirin. Hücre lisatını 9.600 x g'da 12 dakika santrifüjleyin. Süpernatant'ı yeni tüplere geçirin ve peletleri atın.
Ultracentrifuge ile daha fazla işlem için süpernatantı buz üzerinde tutun. Şimdi, hücrelerden salınan adenovirüsü izole etmek için kültür ortamını işliyoruz. Bunun için öncelikle gerekli miktarda amonyum sülfat ağırlıklandırıp kültür ortamının toplandığı şişeye ekliyoruz.
Şişe, kristaller tamamen çözünene kadar kuvvetlice çalkalanır. Karışım oda sıcaklığında iki saat ve yarım boyunca inkübe edilir. Daha sonra çökeltmenin süspansiyonu Falcon tüplerine ayrılır.
1,600 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant atılır ve pelet 10 milimolar Tris tamponunda yeniden atılır. Adenovirüsun saflaştırılmasına ultrasantrifüjleme adımı ile devam edilemezse, çökelti dört derecede birkaç gün tutulabilir, ancak sadece amonyum sülfatın çıkarılması için diyalizden sonra.
Burada diyaliz adımını sunduk. Süspansiyonu daha önce ıslanmış bir kasete sokmak için şırınna kullanıyoruz. Numuneler dört derecede bir gecede 10 milimolar Tris tampona karşı çaprazlanmıştır.
Saflaştırmanın son adımı, sezyum klorür süreksiz gradyanı üzerindeki ultracentrifugation adımı ile temsil edilir. Gradyanı oluşturmak için, ilk olarak, yüksek yoğunluklu sezyum klorür çözeltisinin üç mililitresini pipetleye alıyoruz. Bu tabakanın üzerine, üç mililitre düşük yoğunluklu sezyum klorür dökün.
Hücre lisatından veya kültür ortamından adenoviral parçacık süspansiyonu daha sonra gradyanın üzerine bindirilir. Tüpler mineral yağ ile doldurulur ve SW41 kovalarında tanıtılır. Dengeden sonra, tüpler ultrasantrifüjde tanıtılan rotora simetrik olarak yüklenir.
Santrifüj, 18 saat boyunca 35.000 RPM ve dört derece ara vermeden çalışır. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpler bantları hasat etmek için arkasında siyah bir kağıt bulunan bir standa yerleştirilir. Temiz üst faz ve hücre kalıntıları, ağartma çözeltisi ile bir atık konteynerinde atılır.
Tam adenovirüs içeren en düşük bant pipet ucu ile hasat edilir ve steril bir Eppendorf tüpünde toplanır. Diyalizden sonra, viral süspansiyona% 4 son konsantrasyona sakkaroz eklenir ve viral aliquot eksi 80 derecede dondurulur. Sonuçlar bölümünde, elde edilen adenovirüs ile transdüklenmiş hücrelerde GFP ekspresyonını gösterdik.
Transdüksiyondan 48 saat sonra GFP, floresan mikroskopi ile gösterildiği gibi transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilir. GFP ekspresyon hücrelerinin yüzdesi akış sitometrisi ile belirlenir. Hücre başına 25 transdüksiyon ünitesi ile transdüklenen insan ve sığır endotel hücrelerinin yaklaşık %50'si GFP pozitiftir.
Hücre başına sadece beş transdüksiyon ünitesi kullanıldığında murine hepatositler için aynı transdüksiyon verimi elde edilmiştir, ancak bu hücre duyarlılığı nedeniyle daha yüksek mortalite ile ilişkilidir. Spesifik reseptörlerin düşük ekspresyasyonu nedeniyle mezenkimal stromal hücrelerin transdüksiyonu ile GFP ekspresyona indirgenmiştir. Sonuç açıklamalar.
Adenoviral parçacıkları elde etmek için gereken süreyi, maliyetleri ve çabayı azaltmak için bu zahmetli teknolojiyi optimize ediyoruz. Hazırlanan adenovirüs çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilir ve ilgi geninin ekspresyonunun indüklesini sağlayabilir.
Genel Bakış
Bu makale, pAdEasy sistemi kullanılarak adenoviral parçacıkların üretimi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Süreç, rekombinasyon, paketleme, amplifikasyon, arıtma ve adenovirüslerin fonksiyonel testi gibi önemli adımları içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viral biyoloji
- Gen terapisi
- Hücre biyolojisi
Arka Plan
- Adenovirler, çeşitli hücre tiplerini enfekte etme yetenekleri nedeniyle gen terapisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
- pAdEasy sistemi, adenovirüs üretimi için optimize edilmiş bir yöntemdir.
- Arıtma sürecini anlamak, yüksek kaliteli viral parçacıklar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
- GFP gibi floresan markörler, transdüksiyon verimliliğini takip etmede yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Etkinliği artırmak için adenovirüs üretim protokolünü optimize etmek.
- Viral transdüksiyon alanında araştırmacılar için kapsamlı bir rehber sağlamak.
- Üretilen adenovirüslerin gen ekspresyonundaki etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteryal hücrelerde plazmitlerin rekombinasyonu.
- AD293 hücrelerinde adenoviral parçacıkların paketlenmesi ve amplifikasyonu.
- Hücre lizası ve kültür ortamından adenoviral parçacıkların arıtılması.
- GFP ekspresyonu ve akış sitometrisi yoluyla fonksiyonel testler.
Ana Sonuçlar
- Adenoviral parçacıkların başarılı bir şekilde arıtılması sağlandı.
- Transduse edilen insan ve sığır endotel hücrelerinin yaklaşık %50'si GFP eksprese etti.
- Transdüksiyon verimleri farklı hücre tipleri arasında değişkenlik gösterdi.
- Optimizasyon, adenoviral üretimde zaman ve çaba gerektimini azalttı.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş protokol, adenoviral parçacıkların üretimi için etkilidir.
- Çeşitli hücre tiplerinde verimli gen teslimine izin verir.
- Bu metodoloji, gen terapisinde araştırmacılar için değerli bir kaynak olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
