Name: Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Öğrenin, fare derisi ve ağız boşluğunda CRISPR/Cas9 taraması ile yüzlerce genin tümör baskılayıcı işlevlerini aynı anda değerlendirin. Bu maliyet etkin yöntem, kanser araştırmalarında gen fonksiyon çalışmaları için esnek bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR 365252), Krembil Vakfı ve Ontario Araştırma Fonu Araştırma Mükemmellik Turu 8'den (RE08-065) bir proje hibesi ile desteklenmiştir. Sampath Kumar Loganathan, Kanada Kanser Derneği bursunun (BC-F-16#31919) sahibidir.

<ol><li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li>
<li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+squamous+cell+carcinoma%3A+an+epidemiological+review%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li>
<li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pathway+network%2C+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knockout+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554(2014).</li>
<li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li>
<li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li>
<li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR%E2%80%93mediated+direct+in+vivo+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508(2018).</li>
<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CRISPR/Cas9 genom düzenleme, gen fonksiyonlarını ve hücresel süreçleri araştırmak için in vitro ve in vivo çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo çalışmaların çoğunda crispr/cas9 gen düzenlenmiş hücreler bir hayvan modeline (allograft veya ksinograft) aşılanmış kullanır. Bu, kanser genetiği ve hücresel fonksiyonları incelemek için güçlü bir araç olsa da, hala doğal doku mikroçevrasyonundan yoksundur ve yara ve / veya bağışıklık tepkileri ortaya çıkabilir.
Bu zorlukların üstesinde...

Post-genomik çağda kanser araştırmaları için zorluklardan biri, nedensel gen mutasyonları için çok miktarda genom verisi çıkarmak ve gen ağında terapötik olarak hedeflenebilen düğümleri tanımlamaktır. Biyoinformatik analizler bu hedeflere son derece yardımcı olsa da, verimli in vitro ve in vivo modeller oluşturmak, biyolojik sistemlerin ve hastalık durumlarının karmaşıklığını çözmek ve ilaç gelişimini sağlamak için bir ön koşuldur. Konvansiyonel transgenik fare modelleri in vivo kanser genetiği çalışmaları için yoğun olarak kullanılmış olsa da, maliyet, zaman ve emek yoğun doğası, modern genomik tarafından çözülen yüzlerce putatif kanser geninin sistematik analizini büyük ölçüde yasaklamıştır. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, tek bir farenin derisinde ve ağız boşluğunda yüzlerce genin fonksiyon kaybı mutasyonlarını aynı anda teşvik etmek ve incelemek için daha önce kurulmuş bir ultrason güdümlü rahim enjeksiyon metodolojisi1,2'yi CRISPR / Cas9 (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) gen düzenleme teknolojisi3 ile birleştirdik.
Burada açıklanan metodoloji, embriyonik gün E9.5'te canlı fare embriyolarının amniyotik boşluğuna tasarlanmış lentivirüslerin ultrason güdümlü enjeksiyonlarını kullanır. CRISPR/Cas9 bileşenlerini içeren lentiviral yük, daha sonra cildin ve ağız boşluğunun epiteline yol açan tek katmanlı yüzey ektodermini aktarır. Cilt bir dış epidermisin, ardından bodrum membran ve dermisin oluşur. Epidermis, bodrum zarı ile teması sürdüren, proliferatif ve kök hücre kapasitesine sahip, iç, bazal bir tabakadan oluşan tabakalı bir epiteldir. Bazal tabaka, dikenli, granül ve stratum korneum katmanları2,4gibi yukarıdaki farklı katmanlara yol açar. Soy izleme çalışmaları, bu doğrudan in vivo CRISPR/Cas9 yönteminin, yetişkinlik boyunca devam eden bazal tabaka içindeki doku yerleşik kök hücreleri genetik olarak manipüle ettiğini göstermektedir. Lentivirüs, E9.5 yüzey ektodermini klonal yoğunlukta transdüze etmek için titratlanabildiğinden, bu yöntem binlerce ayrık gen nakavt klonunu barındıran mozaik fareler üretmek için kullanılabilir. Yeni nesil dizileme daha sonra crispr/cas9 aracılı gen ablasyonunun bu klonlar içindeki etkisini çok katlı bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir5.
Son zamanlarda bu yöntemi, insan Baş ve Boyun Skuamöz Hücreli Karsinom (HNSCC)5'tetekrarlayan mutasyonlar gösteren 484 genin işlevini değerlendirmek için kullandık. HNSCC% 40-50 yüksek ölüm oranına sahip yıkıcı bir kanserdir ve dünya çapında en sık görülen6. HNSCC, üst hava yolunun veya ağız boşluğunun mukozal astarlarında ortaya çıkar ve tütün ve alkol tüketimi veya insan papillomavirüs (HPV) enfeksiyonu ile ilişkilidir. Cutaneous Skuamöz Hücreli Karsinom (SCC) cilt tümörleridir ve insanlarda en sık görülen ikinci kanseri temsil eder7. Cutaneous SCC ve HNSCC histolojik ve moleküler olarak çok benzerdir, TP53, PIK3CA, NOTCH1 ve HRAS8'dedeğişiklik sergileyen vakaların yüksek bir yüzdesi ile. Yüksek frekansta mutasyona uğramış sadece bir avuç gen olsa da, genellikle uzun kuyruk dağılımı olarak adlandırılan bir fenomen olan düşük frekansta mutasyona uğramış yüzlerce gen (< % 5) vardır. Uzun kuyruklu genlerin çoğunluğu biyolojik veya klinik doğrulamadan yoksun olduğu için, bu in vivo CRISPR tarama teknolojisini p53, Pik3ca veya Hras'ta hassaslaştırıcı mutasyonlarla tümöre eğilimli farelerde bu genlerin fonksiyon kaybını modellemek için kullandık ve tümör gelişimini tetiklemek için p53, Pik3ca veya Hras ile işbirliği yapan birkaç yeni tümör baskılayıcı gen tanımladık5.
Burada, çok katlı sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA kütüphaneleri oluşturmak ve fare yüzeyi ektoderminde CRISPR / Cas9 gen nakavt ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Not olarak, bu metodoloji CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) ve CRISPR inaktivasyonu (CRISPRi) gibi diğer gen manipülasyon teknolojilerini içerecek şekilde uyarlanabilir veya gen işlevlerini incelemek için faredeki diğer organ sistemlerini hedef alacak şekilde değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>0.45 mikron filtre</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k veya 92k oligo çip</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm hücre kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Sistemleri Biyolojik Bilimler</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Amplisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Kromik bağırsak sütürü</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Derin dizileme (Next-Seq veya Hi-Seq)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA temizleme kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy Kan ve Doku DNA ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Endura elektroyetkin hücreler</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal</td><td>Damarlar Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Wisent Teknolojileri</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme Sutter</td><td>Aleti</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mini hazırlık plazmid Kiti</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>Fare oksijen anestezi sistemi</td><td>Görsel Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II mikromanipülatör</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 ( BsmBI için Tampon</td>)<td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>İğne kalemtıraş</td><td>Sutter Instrument</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Oligo temizleme kiti</td><td>Zymo araştırma</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>SAYFA saflaştırılmış illumina sıralama astarı</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI (polietilenimin)</td> <td>Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Permoplast modelleme kili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merkezi açıklıklı Petridish</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraz 2x Master mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Florometrik Kantifikasyon</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>Yarım Daire Biçimli Silikon tapa</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon membran</td><td>Görsel Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2000 ultrason sistemi</td><td>Görsel Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare derisi ve ağız boşluğundaki gen İşlevlerini aynı anda değerlendirmek için vivo crispr/cas9 taraması

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM), gen fonksiyonlarının değerlendirilmesinde, insan hastalıklarının modelinde ve terapötik yolları değerlendirmek için preklinik model olarak hizmet vermede etkili olmuştur. Bununla birlikte, zaman, emek ve maliyet yoğun doğaları, gen fonksiyonunun sistematik analizi için yararlarını sınırlar. Genom düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmekte ve belirli bir gen pertürbasyonunun doğrudan belirli fare organları içinde çok katlı ve hızlı bir şekilde hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Burada, cildin epitelinde ve farelerin ağız boşluğunda binlerce gen nakavt klonu oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir yöntemi (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) tanımlıyoruz ve tümör baskılayıcı genler için doğrudan in vivo CRISPR ekranı gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklayan bir protokol   sunuyoruz. Bu yaklaşım, doku homeostazı sırasında veya çeşitli hastalık ortamlarında genlerin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara veya CRISPR aktivasyonu veya CRISPR-inaktivasyonu gibi diğer CRISPR /Cas9 teknolojilerine uygulanabilir.

Şekil 1A, birkaç özel CRISPR kütüphanesini tek bir 12k veya 92k oligo yongasında uygun maliyetli bir şekilde çoklandırmak için oligonükleotidlerin tasarımını göstermektedir. SgRNA'lar (mavi renk kodlu) seçildikten sonra, oligonükleotidler kısıtlama siteleri (turuncu renkli BsmBI) ve kütüphaneye özgü PCR astar çiftleri (yeşil renk kodlu) ile tasarlanmıştır. Tek bir oligo yongasında çoklama için astar çiftlerinin benzersiz kombinasyonu kullanılarak çeşitli kütüphaneler tasarlanabilir. PCR, bel...

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların baş ve boyun kanserindeki yüzlerce genin tümör baskılayıcı fonksiyonlarını aynı anda geleneksel bir nakavt fare modelinin maliyetinin çok altında araştırmasına izin verir. Bu teknik esnektir ve ciltteki işlevlerini incelemek için genlerin ekspresyonunu kapsayacak şekilde uyarlanabilir. Hedeflenen CRISPR kütüphane protokolü diğer kanser türleri için de uygulanabilir.Anestezi uygulanmış hayvanın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtılmış ameliyat aşamasına yerleştirin ve pençeleri yerinde tutmak için cerrahi bant kullanın. Ameliyat tamamlanana kadar sürekli bir izofluran ve oksijen kaynağı için nosecone anestezi tüpünü uygulayın. E9.5 gebeliğini doğrulamak için, karın bölgesine az miktarda tüy dökücü krem uygulayın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak üç x üç santimetre karelik bir alana yayın.İki ila üç dakika sonra, kremi gazlı bez veya mendille nazikçe çıkarın ve alanı PBS ve% 70 etanol kullanarak silerek temizleyin. Ultrason probunu ve jeli kullanarak, hamile fareyi embriyonik gün E9.5 için kontrol edin. Bu, ameliyat gününde zaman kazanmak için bir gün önce E8.5'te de yapılabilir.Ultrason jelini çıkarın ve BPS ve ardından% 70 etanol kullanarak alanı silerek temizleyin. En çok deri altı analjezik ile enjekte edin. Daha sonra ciltte dikey bir kesi yapmak için steril forseps ve makas kullanın.Kesi etrafındaki cildi peritondan ayırmak için künt forseps kullanın. Sonra karın zarını kesmek için steril forseps ve makas kullanın. Künt forseps kullanarak, sol ve sağ uterus boynuzunu nazikçe dışarı çekin ve embriyoları sayın.Rahim boynuzlarının çoğunu yeniden yerleştirin, ancak üç embriyo içeren bir rahim boynuzunun distal ucunu açıkta bırakın. Künt forseps kullanarak, modifiye edilmiş Petri kabının silikon zarındaki açıklıktan uterusu üç embriyo ile hafifçe itin ve çekin. Modelleme kili küpleri kullanarak Petri kabını stabilize edin.Silikon bir kalıp kullanarak uterusu Petri kabının içindeki üç embriyo ile stabilize edin. Daha sonra künt bir alet kullanarak embriyoların yan tarafındaki silikon tıkacı düzleştirin. Petri kabını steril PBS ile doldurun ve Petri kabının altındaki silikon zarı hamile barajın karnıyla yıkayın, böylece herhangi bir sızıntıyı önleyin.Ultrason başlığını, üst embriyonun yaklaşık 0,5 santimetre yukarısındaki Petri kabına yerleştirin ve sahneyi, amniyotik boşluğun ultrason görüntüsünde net bir şekilde görülebilmesi için ayarlayın. Enjektör iğnesini dikkatlice modifiye edilmiş Petri kabına hizalayın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu üst embriyonun beş milimetre yakınına yerleştirin, ardından ucunun ultrason görüntüsünde en parlak göründüğü düzleme hareket etmek için iğneyi ileri geri hareket ettirin.Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi rahim duvarından amniyotik boşluğa itin. 62 nanolitre lentivirüsü sgRNA kütüphanesi ile yavaş bir enjeksiyon hızında enjekte edin. Embriyo başına toplam 496 nanolitre için Enjekte düğmesine sekiz kez basın.Diğer iki embriyo için de aynı işlemi tekrarlayın. Ardından ultrason kafasını kaldırın ve silikon tapayı çıkarın. Üç embriyonun ilk ikisini steril bir pamuklu çubuk kullanarak farenin karnına nazikçe itti.Sonraki üç embriyoyu dışarı çekin ve daha önce enjekte edilen üçüncü embriyoyu içeri itin. İstenilen sayıda embriyo enjekte edilene kadar enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın ve 30 dakikalık anesteziyi aşmamaya dikkat edin. Bittiğinde, ultrason kafasını kaldırın, mikromanipülatörü iğne ile çıkarın, PBS'yi aspire edin ve Petri kabını çıkarın.Steril mendiller kullanarak, karın boşluğunda birikmiş olabilecek herhangi bir PBS'yi emdirin. Periton kesisini emilebilir dikişler kullanarak kapatın. Ardından karın derisindeki kesiyi kapatmak için iki zımba kullanın.Daha sonra, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR amplifiye DNA'nın nesil dizileme okumaları yüksek bir korelasyon göstermelidir. Plazmit DNA'dan okunan sgRNA, sgRNA'ların eşit temsilini göstermiyorsa, viral hazırlama ve konsantrasyon prosedürü dikkatle tekrarlanmalıdır. Doğum sonrası P0'da E9.5 Lox-STOP-Lox konfeti fare yavrularında Cre rekombinaz taşıyan lentivirüsün ultrason eşliğinde enjeksiyonunun sonuçları burada gösterilmektedir.Yüksek virüs titresi, farenin derisinin daha geniş bir şekilde kaplanmasına neden olurken, aynı zamanda birden fazla sgRNA'nın aynı hücreye transdüksiyonuna neden olur. Bu grafik, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR ile amplifiye edilmiş DNA'nın yeni nesil dizileme okumalarını ve ayrıca dört temsili tümörden okumaları göstermektedir. Tümör baskılayıcıları ADAM10 ve RIPK4'ü hedefleyen sgRNA kılavuzları, plazmit havuzuna veya enfekte hücrelere kıyasla tümör örneklerinde zenginleştirilir.Ameliyatın E9.5'te yapılması çok önemlidir. Haçı kurduktan dokuz gün sonra ultrason ile hamileliği kontrol etmeyi ve her dişi farede embriyonik zaman noktasını belirlemeyi unutmayın. Yavrular doğduktan sonra, dönüştürülen hücreler, tek hücreli RNA dizilimi gibi en son gen profilleme teknikleri kullanılarak izole edilebilir ve kapsamlı bir şekilde profillenebilir.

in-vivo-crisprcas9-screening-to-simultaneously-evaluate-gene-function

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, genomu CRISPR-Cas9 kullanılarak modifiye edilen transgenik Drosophila sineklerini tanımlamak için bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. CRISPR-Cas9, bilim insanlarının bir organizmanın genomunu manipüle etme biçiminde devrim yaratan güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Örnek protokolde, bir transaktivasyon dizisinin eklenmesinin dalsız (bnl) genin ilk eksonunun yerini aldığı ve böylece bnl genine özgü bir sürücü hattı olan bnl-LexA'nın oluşturulduğu CRISPR tarafından üretilen...

Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin, fare derisi ve ağız boşluğunda CRISPR/Cas9 taraması ile yüzlerce genin tümör baskılayıcı işlevlerini aynı anda değerlendirin. Bu maliyet etkin yöntem, kanser araştırmalarında gen fonksiyon çalışmaları için esnek bir araç sunar.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Daha fazla video keşfet