Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması
2 Kasım 2020
Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.
Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların baş ve boyun kanserindeki yüzlerce genin tümör baskılayıcı fonksiyonlarını aynı anda geleneksel bir nakavt fare modelinin maliyetinin çok altında araştırmasına izin verir. Bu teknik esnektir ve ciltteki işlevlerini incelemek için genlerin ekspresyonunu kapsayacak şekilde uyarlanabilir. Hedeflenen CRISPR kütüphane protokolü diğer kanser türleri için de uygulanabilir.
Anestezi uygulanmış hayvanın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtılmış ameliyat aşamasına yerleştirin ve pençeleri yerinde tutmak için cerrahi bant kullanın. Ameliyat tamamlanana kadar sürekli bir izofluran ve oksijen kaynağı için nosecone anestezi tüpünü uygulayın. E9.5 gebeliğini doğrulamak için, karın bölgesine az miktarda tüy dökücü krem uygulayın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak üç x üç santimetre karelik bir alana yayın.
İki ila üç dakika sonra, kremi gazlı bez veya mendille nazikçe çıkarın ve alanı PBS ve% 70 etanol kullanarak silerek temizleyin. Ultrason probunu ve jeli kullanarak, hamile fareyi embriyonik gün E9.5 için kontrol edin. Bu, ameliyat gününde zaman kazanmak için bir gün önce E8.5'te de yapılabilir.
Ultrason jelini çıkarın ve BPS ve ardından% 70 etanol kullanarak alanı silerek temizleyin. En çok deri altı analjezik ile enjekte edin. Daha sonra ciltte dikey bir kesi yapmak için steril forseps ve makas kullanın.
Kesi etrafındaki cildi peritondan ayırmak için künt forseps kullanın. Sonra karın zarını kesmek için steril forseps ve makas kullanın. Künt forseps kullanarak, sol ve sağ uterus boynuzunu nazikçe dışarı çekin ve embriyoları sayın.
Rahim boynuzlarının çoğunu yeniden yerleştirin, ancak üç embriyo içeren bir rahim boynuzunun distal ucunu açıkta bırakın. Künt forseps kullanarak, modifiye edilmiş Petri kabının silikon zarındaki açıklıktan uterusu üç embriyo ile hafifçe itin ve çekin. Modelleme kili küpleri kullanarak Petri kabını stabilize edin.
Silikon bir kalıp kullanarak uterusu Petri kabının içindeki üç embriyo ile stabilize edin. Daha sonra künt bir alet kullanarak embriyoların yan tarafındaki silikon tıkacı düzleştirin. Petri kabını steril PBS ile doldurun ve Petri kabının altındaki silikon zarı hamile barajın karnıyla yıkayın, böylece herhangi bir sızıntıyı önleyin.
Ultrason başlığını, üst embriyonun yaklaşık 0,5 santimetre yukarısındaki Petri kabına yerleştirin ve sahneyi, amniyotik boşluğun ultrason görüntüsünde net bir şekilde görülebilmesi için ayarlayın. Enjektör iğnesini dikkatlice modifiye edilmiş Petri kabına hizalayın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu üst embriyonun beş milimetre yakınına yerleştirin, ardından ucunun ultrason görüntüsünde en parlak göründüğü düzleme hareket etmek için iğneyi ileri geri hareket ettirin.
Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi rahim duvarından amniyotik boşluğa itin. 62 nanolitre lentivirüsü sgRNA kütüphanesi ile yavaş bir enjeksiyon hızında enjekte edin. Embriyo başına toplam 496 nanolitre için Enjekte düğmesine sekiz kez basın.
Diğer iki embriyo için de aynı işlemi tekrarlayın. Ardından ultrason kafasını kaldırın ve silikon tapayı çıkarın. Üç embriyonun ilk ikisini steril bir pamuklu çubuk kullanarak farenin karnına nazikçe itti.
Sonraki üç embriyoyu dışarı çekin ve daha önce enjekte edilen üçüncü embriyoyu içeri itin. İstenilen sayıda embriyo enjekte edilene kadar enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın ve 30 dakikalık anesteziyi aşmamaya dikkat edin. Bittiğinde, ultrason kafasını kaldırın, mikromanipülatörü iğne ile çıkarın, PBS'yi aspire edin ve Petri kabını çıkarın.
Steril mendiller kullanarak, karın boşluğunda birikmiş olabilecek herhangi bir PBS'yi emdirin. Periton kesisini emilebilir dikişler kullanarak kapatın. Ardından karın derisindeki kesiyi kapatmak için iki zımba kullanın.
Daha sonra, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR amplifiye DNA'nın nesil dizileme okumaları yüksek bir korelasyon göstermelidir. Plazmit DNA'dan okunan sgRNA, sgRNA'ların eşit temsilini göstermiyorsa, viral hazırlama ve konsantrasyon prosedürü dikkatle tekrarlanmalıdır. Doğum sonrası P0'da E9.5 Lox-STOP-Lox konfeti fare yavrularında Cre rekombinaz taşıyan lentivirüsün ultrason eşliğinde enjeksiyonunun sonuçları burada gösterilmektedir.
Yüksek virüs titresi, farenin derisinin daha geniş bir şekilde kaplanmasına neden olurken, aynı zamanda birden fazla sgRNA'nın aynı hücreye transdüksiyonuna neden olur. Bu grafik, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR ile amplifiye edilmiş DNA'nın yeni nesil dizileme okumalarını ve ayrıca dört temsili tümörden okumaları göstermektedir. Tümör baskılayıcıları ADAM10 ve RIPK4'ü hedefleyen sgRNA kılavuzları, plazmit havuzuna veya enfekte hücrelere kıyasla tümör örneklerinde zenginleştirilir.
Ameliyatın E9.5'te yapılması çok önemlidir. Haçı kurduktan dokuz gün sonra ultrason ile hamileliği kontrol etmeyi ve her dişi farede embriyonik zaman noktasını belirlemeyi unutmayın. Yavrular doğduktan sonra, dönüştürülen hücreler, tek hücreli RNA dizilimi gibi en son gen profilleme teknikleri kullanılarak izole edilebilir ve kapsamlı bir şekilde profillenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, ultrason yönlendirmeli in utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlar kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR/Cas9 taramasının metodolojisini tanımlar. Bu, araştırmacıların immünokompetan farelerin derisi ve ağız boşluğunda birkaç genin işlevlerini değerlendirmelerine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik
- Kanser Araştırması
Arka Plan
- Teknik, yüzlerce genin tümör baskılayıcı işlevlerinin incelenmesini sağlar.
- Geleneksel knockout fare modellerine göre maliyet etkindir.
- Yöntem, derideki gen ekspresyonunu incelemek için uyarlanabilir.
- Çeşitli kanser tiplerine uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Eş zamanlı gen işlevi değerlendirmesi için bir metodoloji geliştirmek.
- Baş ve boyun kanserinde gen rollerine olan anlamayı geliştirmek.
- Kanser araştırmaları için esnek bir araç sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ultrason yönlendirmeli in utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlar.
- Anestezi için isoflurane ve oksijen uygulaması.
- Kıl çıkarma kremi uygulaması ile hamilelik doğrulaması.
- Hedeflenen CRISPR kütüphanesi protokolünün kullanılması.
Ana Sonuçlar
- In vivo gen işlevlerinin başarılı bir şekilde değerlendirilmesi.
- Yöntemin maliyet etkinliğinin gösterilmesi.
- Farklı kanser tipleri için uyarlanabilirliğin doğrulanması.
- Gen işlevi çalışmalarında daha geniş uygulamalar için potansiyel.
Sonuçlar
- Protokol, gen işlev analizi için hızlı ve verimli bir yaklaşım sunar.
- Kanser araştırması ve gen çalışmaları için yeni yollar açar.
- Gelecekteki uygulamalar baş ve boyun kanserinin ötesine uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In vivo CRISPR/Cas9 screening enables rapid, multiplexed functional interrogation of gene roles in disease-relevant mouse tissues, accelerating target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This approach reduces the time and cost barriers of traditional GEMMs, supporting earlier, data-driven portfolio triage and prioritization. Its adaptability across tissues and gene perturbation types positions it as a scalable platform for preclinical model innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous functional assessment of hundreds of candidate tumor suppressor genes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in tissue-specific oncogenesis.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target prioritization for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated, multiplexed knockout models for robust screening of gene function.
- Provides quantitative readouts via next-generation sequencing of sgRNA representation.
- Improves reproducibility and scalability compared to single-gene knockout workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology by enabling tissue- and context-specific gene perturbation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell profiling of transduced cells.
- Reduces late-stage attrition risk by providing early, in vivo functional evidence for candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo CRISPR screening method bridges early discovery and preclinical model development, enabling direct functional genomics in relevant tissues before lead identification.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function testing and pathway mapping in disease-relevant systems.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for robust comparison of gene perturbations.
- Analytics: Leverages next-generation sequencing for precise measurement of sgRNA enrichment and depletion.
- Translational Research: Supports biomarker discovery and mechanistic alignment with clinical phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues, gene sets, and disease models across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and enables high-throughput functional genomics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing early, multiplexed in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero surgery, CRISPR library design, and next-generation sequencing analytics.
- Demands access to ultrasound-guided injection systems and high-titer lentiviral production capabilities.
- Standardization of sgRNA library representation and viral delivery is critical for reproducibility.
- Protocol can be adapted to other organs or CRISPR modalities with appropriate optimization.
- Careful control of viral titer and injection parameters is necessary to avoid confounding effects from multiple sgRNA integration.
