Name: Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, fare epididimal yağ dokularından yüksek canlılıkta yağ progenitör hücrelerini FACS ile izole etme yöntemini. Bu teknik, tek hücreli RNA dizileme gibi hassas analizler için uygundur ve hücre biyolojisi araştırmalarında ileri karakterizasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FACS sıralama konusunda yardım için Mayo Clinic Mikroskopi Hücre Analizi Çekirdek Akış Sitometri Tesisi'ni kabul ediyoruz.

Tüm hayvan deneysel işlemleri Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanarak gerçekleştirildi.
1. Çözelti hazırlama 
<ol><li>Kollajenaz II 2 g'ı 100 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) çözerek kollajenaz% 2 (w/v) çözeltisi hazırlayın. Her kullanım için aliquot 200 μL her biri.</li>
	<li>84 mL F-12 orta, 15 mL at serumu ve 1 mL penisilin/streptomisisini karıştırarak nötralizasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininin (DPBS) 100 mL'sinde 500 mg sığır serum albümini (BSA) ve 400 μL 0,5 M EDTA'yı eriterek akış sitometri tamponu hazırlayın.</li>
</ol>2. Epididimal yağ yastığının diseksiyonu ve doku ayrışması
<ol><li>İnsanca ötenazi (izofluran/servikal çıkık) bir erkek fare. Bu protokolde dört aylık bir FVB fare kullanıldı.</li>
	<li>Karın bölgesine %70 etanol uygulayın/püskürtün ve temiz makas ve önps kullanarak alt karın boşluğunu ortaya çıkarın.</li>
	<li>Epididimal yağ yastığını bulun (proksimal/testislere bağlı). Testisler ve epididimal yağ pedi arasındaki kavşağı künt toparlamalarla tutun ve epididimal yağ yastığını serbest bırakmak için hafifçe çekin.</li>
	<li>Makas kullanarak keserek testisleri çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 50 mL konik bir tüpte% 3 BSA ile desteklenmiş 5 mL HBSS'de epididimal yağ yastığını kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4 °C'de 7 dakika boyunca 150 x g'da santrifüj.</li>
	<li>50 mL konik tüpten yüzen epididimal yağ yastığı alın ve temiz makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kıyın.</li>
	<li>13 mL kültür tüpünde 3,8 mL HBSS'ye 200 μL kollajenaz% 2 çözelti ekleyin. Kıyılmış dokuyu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 5 rpm'de dönen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Dönen bir inkübatör yerine, 37 °C'deki hücre kültürü inkübatörü alternatif olarak zaman zaman ajitasyonlarla kullanılabilir.</li>
	<li>Tüm içeriği 50 mL konik bir tüpe aktarın ve 10 mL nötralizasyon ortamı ekleyin. Tüpü 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>70 μm hücre süzgeç ile donatılmış başka bir 50 mL konik tüp hazırlayın. Hücre süzgecini kullanarak sindirilen dokuyu yeni tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Akışı 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da 15 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın.</li>
	<li>5 mL DPBS ile süpernatant ve resuspend hücre peletlerini dikkatlice çıkarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 50 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın ve hücreleri buzda tutun. Hücre peletlerinin hacmi ve az miktarda artık süpernatant nedeniyle, akış sitometri tamponundaki hücrelerin toplam hacmi 50 μL'den (yaklaşık 100 μL) büyük olacaktır.</li>
</ol>3. Antikor etiketleme ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)
<ol><li>Hücreleri nazik pipetleme ile iyice karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunun 54 μL'lik kısmını 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6 μL FcR blokaj reaktifi ekleyin ve hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır. 54 μL aldıktan sonra kalan hücreleri kaydedin ve 3.5 ve adım 3.6'da yersiz bir kontrol olarak kullanmak için buzda tutun.</li>
	<li>3.1. adımdaki inkübasyon sırasında, anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC ve anti-CD45-FITC antikorlarının her birini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir antikor kokteyli hazırlayın. Hafif pipetleme ile iyice karıştırın ve ışıktan korunan buz üzerinde tutun.</li>
	<li>FcR bloke reaktifi ile 10 dakika inkübasyondan sonra, antikor kokteylinin 40 μL'lik kısmını ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Lekeli hücrelere 1 μg/mL DAPI ile desteklenmiş 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hücre süzgeç yapışma kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpü kullanarak nazik pipetleme ve filtre hücreleri ile iyice karıştırın. Hücreleri buzda tutun.</li>
	<li>3.1. adımda kalan hücrelere 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. Hücre süzgeç yapıştırıcı kapaklı 5 mL test tüpü kullanarak hücreleri filtreleyin. Bu hücreleri buzda tutun ve aşağıdaki adımda bozulmamış bir kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri ve bozulmamış kontrolü FACS analiz veya sıralama cihazına götürün.<ol>
<li>Şekil 1'de gösterilen gating stratejileriyle APC+/FITC-/DAPI- popülasyonu tanımlayın ve yalıtın. Bu hücreler uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- hücrelerini temsil eder. Enkaz ve hücre agregaları ileri (FSC) ve yan dağılım (SSC) çizimleri kullanılarak tükenür. Daha sonra, DAPI- nüfus kapılı, ardından APC+/ FITC- nüfus gating. Gating parametrelerinin ayarlanmasına yardımcı olmak için ellenmemiş denetimler kullanılmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL akış sitometri tamponunda toplayın. İleriye doğru, kontaminasyonu en aza indirmek için tüm prosedürler steril koşullar altında yapılmalıdır. Bir fareden yaklaşık 50.000 – 100.000 hücre toplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre canlılığını değerlendirmek için hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre agregaları daha fazla aşağı akış analizini engelleyebileceğinden, hücre agregalarının varlığı da bu agregaların minimum varlığını (<5% uygulanabilir hücre sayısının) sağlamak için değerlendirilir.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), tek hücre düzeyindeki çeşitli hücre popülasyonlarını aynı anda incelemek için güçlü bir araç olarak hızla çekiş kazanıyor. Numune hazırlama ve yüksek verim sıralaması ile ilişkili yüksek maliyetler nedeniyle, deneysel başarı olasılığını artırmak için hücresel girdileri (yüksek canlılık ve saflık) optimize etmek zorunludur. Bazı hücre hazırlama protokolleri, FACS sıralama14olmadan düşük dönüşlü yıkamalar ve sütun tabanlı ayırma kullanarak ölü hücrelerin ve kalı...

Yağ dokusu enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Fazla enerji lipitler şeklinde depolanır ve yağ dokusu beslenme durumuna ve enerjik talebe bağlı olarak önemli genişleme veya geri çekilme yeteneğine sahiptir. Yağ dokusunun genişlemesi adiposit boyutundaki (hipertrofi) ve/veya adiposit sayısındaki (hiperplazi) artıştan; ikinci süreç, yağ progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması ile sıkı bir şekilde düzenlenir1,2. Obezite sırasında, yağ dokusu aşırı genişler ve hipoksi, iltihaplanma ve insülin direnci de dahil olmak üzere doku disfonksiyonu genellikle3,4gelişir. Bu komplikasyonlar hipertansiyon, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, inme ve kanser dahil olmak üzere birçok kronik hastalık için risk faktörleridir5. Bu nedenle, kontrolsüz yağ dokusu genişlemesini sınırlamak ve yağ dokusu patolojilerini azaltmak en önemli biyomedikal araştırma öncelikleridir. Yağ dokusu genişlemesi sırasında, yerleşik yağ dokusundan türetilmiş kök hücreler (ASC'ler) çoğalır ve sırayla preadipositlere (taahhüt edilen progenitör hücreler) ve daha sonra olgun adipositlere farklılaşır6. Son tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) çalışmaları, bu yağ progenitör hücre (APC) popülasyonlarının (ASC'ler ve preadipositler) önemli moleküler ve fonksiyonel heterojenlik 7,8 ,9,10,11,12. Örneğin, ASC'ler daha az adipojenik farklılaşma kapasitesi gösterirken, preadipositler7'yekıyasla daha yüksek çoğalma ve genişletme yetenekleri de sergiler. ASC ve preadiposit popülasyonlarında daha fazla moleküler farklılıklar bildirilmektedir, ancak bu farklılıkların işlevsel ilgisi belirsizliğini korumaktadır7. Birlikte, bu veriler yağ progenitor hücre havuzunun karmaşıklığını vurgular ve bu kritik hücre popülasyonlarını daha iyi anlamak ve manipüle etmek için araçlar geliştirme ve standartlaştırma ihtiyacının altını çizer.
Bu protokol, tek hücreli çalışmalar (scRNA-dizileme) ve hücre kültürü de dahil olmak üzere hassas aşağı akış analizleri için uygun olan fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek canlılık Sca1+ yağ progenitör hücre popülasyonlarının izolasyonunun ayrıntılarını içerir. Epididimal yağ pedlerinin izolasyonu ve ayrışması, izole APC'lerin uygulanabilirliğini artıran hafif değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi7,13 olarak gerçekleştirildi. Kısacası, epididimal yağ pedlerinden ayrışmış hücreler, hem ASC'ler hem de preadipositler6,7ve diğer soy (Lin) belirteçleri için bir belirteçolanSca1'e karşı antikorlarla lekelenir: Ter119 (eritroid hücreler), CD31 (endotel hücreleri) ve CD45 (lökositler). Uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- hücreler daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile sıralanır. Daha da önemlisi, bu protokol, ASC'ler ve preadipositler içinde fonksiyonel olarak heterojen subpopulasyonları tanımlayan yeni bir tek hücreli RNA dizileme çalışmasında bildirilen uygulanabilir Sca1+/ Lin- yağ progenitör hücrelerinin başarılı izolasyonu ve analizi ile doğrulanmıştır7.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL kültür tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL hücre süzgeci geçmeli kapaklı test tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 ve mikro; m hücre süzgeci</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC antikoru</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC antikoru</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1-APC antikoru</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC antikoru</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcR bloke edici reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür çözeltisi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

fare epidididimal yağ dokularından yağ progenitör hücrelerinin hazırlanması

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obezite ve diyabet, kalp hastalığı ve kanser gibi metabolik bozuklukların tümü dramatik yağ dokusu tadilatı ile ilişkilidir. Doku bazlı yağ progenitör hücreler (APC' ler) yağ dokusu homeostazında önemli bir rol oynar ve doku patolojisine katkıda bulunabilir. Tek hücreli RNA dizilimi ve tek hücreli proteomik dahil olmak üzere tek hücreli analiz teknolojilerinin artan kullanımı, popülasyon veya doku çapındaki değişiklikler bağlamında bireysel hücre ifade değişikliklerinin benzeri görülmemiş bir şekilde çözülmesine izin vererek kök/progenitör hücre alanını dönüştürmektedir. Bu yazıda, fare epidimal yağ dokusunu parçalamak, tek yağ dokusundan türetilmiş hücreleri izole etmek ve uygulanabilir Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC'ler için zenginleştirmek için floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, araştırmacıların tek hücreli RNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için uygun yüksek kaliteli APC'ler hazırlamalarını sağlayacaktır.

Bu deneyde dört aylık erkek FVB fareleri kullanıldı. FSC/SSC arazileri kullanılarak enkaz ve çiftlerin dışlanmasından sonra, uygulanabilir hücreler (DAPI- popülasyon) kapılıydı, ardından APC+/ FITC- popülasyon seçimi (Şekil 1). DAPI, APC ve FITC kapıları, tespit edilmemiş kontrole göre çizildi. Gating stratejileri Şekil 1'de gösterilmiştir.
1 saat sıralamadan sonra, izolasyon kalitesi akış sitometri an...

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Bu protokol, hassas aşağı akış analizi için fare epididimal yağ dokusundan yüksek kaliteli adipoz progenitör hücrelerin izole edilmesini mümkün kılar. Bu teknik, oldukça canlı adipoz progenitör hücreler verir ve yakın tarihli bir tek hücreli RNA dizileme çalışmasında doğrulanmıştır. Erkek fareye ötenazi yaptıktan sonra, epididimal yağ pedini bulun ve kasıtlı olarak künt forseps ile hafifçe çekin.Testisleri çıkarmak için makas kullanın ve epididimal yağ pedini 15 dakika boyunca 50 mililitrelik konik bir tüpte% 3 BSA ile desteklenmiş beş mililitre HBSS içinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü dört santigrat derecede yedi dakika boyunca 150 x g'de santrifüjleyin. Yüzen epididimal yağ pedini konik tüpten çıkarın ve temiz bir makasla ince bir şekilde kıyın.13 mililitrelik bir kültür tüpünde 3.8 mililitre HBSS'ye 200 mililitre% 2 kollajenaz çözeltisi ekleyin. Daha sonra kıyılmış dokuyu ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca beş RPM'de dönen bir inkübatörde inkübe edin. Tüm içeriği 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 10 mililitre nötralizasyon ortamı ekleyin.Tüpü iki ila üç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. 70 mikrometre hücre süzgeci ile donatılmış 50 mililitrelik başka bir konik tüp hazırlayın ve sindirilmiş dokuyu yeni tüpe süzün. Akışı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakikada 350 x g'da santrifüjleyin.Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini beş mililitre DPBS ile yeniden süspanse edin. Ardından tüpü 10 dakika daha santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 50 mikrolitre akış sitometrisi tamponu ekleyin.Hücreleri nazikçe pipetleyerek karıştırın ve buz üzerinde tutun. Akış sitometrisi tamponundaki hücrelerin toplam hacmi yaklaşık 100 mikrolitre olacaktır. Hücreleri karıştırdıktan sonra, 54 mikrolitre hücre süspansiyonunu 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Altı mikrolitre FCR bloke edici reaktif ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Daha sonra tüpü 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Lekesiz kontrol olarak kullanmak için kalan hücreleri buz üzerinde tutun.İnkübasyon sırasında, 11 mikrolitre anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC ve anti-CD45-FITC antikorlarını bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir antikor kokteyli hazırlayın. Karışımı nazikçe pipetleyin ve ışıktan koruyarak buz üzerinde tutun. FCR bloke edici reaktif ile inkübasyondan sonra, 40 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Leke hücrelerine mililitre DAPI başına bir mikrogram ile desteklenmiş 500 mikrolitre akış sitometrisi tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve hücre süzgeci geçmeli kapaklı beş mililitrelik bir test tüpü kullanarak hücreleri filtreleyin.Sonra hücreleri buz üzerinde tutun. Lekelenmemiş hücrelere 500 mikrolitre akış sitometrisi tamponu ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücreleri filtrelemek ve buz üzerinde tutmak için hücre süzgeci geçmeli kapaklı beş mililitrelik bir test tüpü kullanın.Lekeli hücreleri ve lekesiz kontrolü FACS analizine veya sıralama cihazına taşıyın. Metin el yazmasında açıklanan geçit stratejilerini kullanarak APC pozitif, FITC negatif, DAPI negatif popülasyonu tanımlayın ve izole edin. Geçit parametrelerinin ayarlanmasına yardımcı olması için lekesiz kontrolleri kullanın.FSC-SSC grafikleri kullanılarak enkaz ve çiftlerin dışlanmasından sonra, canlı hücreler kapılandı ve ardından APC pozitif, FITC negatif popülasyonun seçimi yapıldı. DAPI, APC ve FITC kapıları lekesiz kontrole dayalı olarak çizilmiştir. Aşağıdaki sonuçlar, dört aylık erkek FVB farelerinden adipoz progenitör hücrelerin izolasyonunu göstermektedir.Bir saatlik sıralamadan sonra, izolasyon kalitesi, hücrelerin yüksek canlılık ve saflığı koruduğunu gösteren akış sitometrisi analizi ile kantitatif olarak değerlendirildi. Bu protokolden sonra tek hücreli RNA dizilimi, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve akış sitometrisi gibi hassas aşağı akış analizi yapılabilir. Bu, adipoz progenitör hücrelerin daha fazla karakterizasyonunu sağlayacaktır.Adipoz progenitör hücreler, daha fazla tek hücreli çalışma gerektiren heterojen popülasyonlardır. Bu yöntem, tek hücreli çalışmalara uygun hücrelerin izole edilmesini mümkün kılar.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, murin periaortik ark yağ dokusundan floresan etiketli nöral krestten türetilmiş adipoz türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. İzolasyonu takiben, NCADSC'ler tespit edilir, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak sıralanır ve daha sonra hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir plaka üzerinde kültürlenir.

Murin Periaortik Yağ Dokusundan Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin İzole Edilmesi

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Öğrenin, fare epididimal yağ dokularından yüksek canlılıkta yağ progenitör hücrelerini FACS ile izole etme yöntemini. Bu teknik, tek hücreli RNA dizileme gibi hassas analizler için uygundur ve hücre biyolojisi araştırmalarında ileri karakterizasyon sağlar.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet