Name: Nohutta Kuru Kök Çürüklüğü Hastalığı Tahlilleri: Detaylı Bir Metodoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Keşfedin nohutta kuru kök çürüklüğü hastalığı tahlillerini; Rhizoctonia bataticola ile bitki-patojen etkileşimlerini incelemek için filtre kağıdı ve hasta saksı tekniklerini kullanın. Bu yöntemler genotip taraması için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.S.K laboratuvarındaki projeler Ulusal Bitki Genom Araştırmaları Enstitüsü çekirdek finansmanı tarafından desteklenir. VI, DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430) kabul eder. Kursiyer öğrencilere, Bayan Rishika'ya, Bay Jayachendrayan'a ve Bayan Durgadevi'ye video çekimi sırasında ki teknik yardımları için teşekkür ederiz ve Bay Sandeep Dixit, Bayan Anjali ve Dr. Avanish Rai ham verileri ve el yazması dosyaları eleştirel olarak değerlendirdiği için. Sayın Rahim H Tarafdar ve Bay Sunder Solanki'ye laboratuvardaki yardımları için teşekkür ederiz. Tesis büyüme desteği/alanı için e-kaynaklara ve NIPGR Tesis Büyüme Tesisine erişim sağlayan DBT-eLibrary Konsorsiyumu (DeLCON) ve NIPGR Kütüphanesi'ni kabul ediyoruz.

1. R. bataticola ve depolama izolasyon
<ol><li>Nohut genotip ve DRR semptomlarının ayrıntıları<ol>
<li>Nohut bitkileri kullanın (genotip, JG 62) genellikle tipik DRR belirtileri göstermek, kuru gibi, kabuğu altında hiçbir lateral kökleri ve mikrosclerotia ve pith içinde1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplama ve yıkama<ol>
<li>Epidermis tabakası altında mikrosclerotia ile kuru saman renkli foliar ve kırılgan birincil kök gibi belirtiler gösteren uproot bitkiler. Kök sökme sırasında, enfekte kökleri kırılgan olduğu gibi köklerin büyük bir kısmı toprak içinde kalacaktır. Köke bağlı kaba toprak enkaz kaldırın. Kökleri ayrı ayrı kesin ve uygun etiketle kağıt zarflarda (27,5 cm x 12 cm) toplayın ve bir numune toplama kutusuna yerleştirin.</li>
		<li>Numuneleri laboratuvara taşıdıktan sonra, kökleri 200 mL'lik bir kabın üzerine yerleştirin ve örgü (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) ile kaplayın ve yapışan toprak parçacıklarını çıkarmak için kökleri akan musluk suyuyla iyice yıkayın.</li>
		<li>Sonunda bir kez durulamak için ters ozmoz (RO) su kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüzey sterilizasyonu<ol>
<li>Kökleri her biri neşter bıçakla 2 cm uzunluğunda dört parçaya bölün ve temiz bir 200 mL kabına koyun.</li>
		<li>Otoklavlı RO suyunu, %2 NaOCl,kavanozu atın ve otoklavlı blotasyon kağıdını (5 cm2)laminar akış odasının içinde birleştirin.</li>
		<li>Kökleri 50 mL otoklavlı RO suyu ile üç kez ve daha sonra 50 mL 2% 2 NaOCl ile 10 dakika yıkayın. NaOCl kaldırmak için tekrar üç kez RO su 50 mL ile kökleri yıkayın.</li>
		<li>Lekeler otoklavlı leke kağıdına kökleri yerleştirerek kökleri kurutun ve kökleri kuruyana kadar bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya ve kuluçka<ol>
<li>Sterilize edilmiş bir neşter bıçağı ile köklerin kenarlarını çıkarın. Bıçak kullanarak kökleri bölün ve streptomisin sülfat (50 mg L-1) ve ampisilin (50 mg L-1)içeren bir patates dekstroz agar (PDA) medya Petri plaka üzerine yerleştirmek için sterilize forseps kullanın.</li>
		<li>Plakayı kapatın, parafilm ile kapatın ve karanlıkta iki gün boyunca 28 °C'de bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hipür ucu yöntemi<ol>
<li>İki günlük kuluçkadan sonra plakaları laminar akış odasına getirin. Bir stereomikroskop altında hyphal büyüme8 ucunu kesin (Leica EZ4 eğitim stereomikroskop) ve streptomisin sülfat ve ampisilin ile taze bir PDA plaka içine aktarın.</li>
		<li>28 °C'de kuvözdeki plakaları karanlıkta on gün kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>R. bataticola fungal inoculum'un depolanması ve bakımı<ol>
<li>Test tüpleri PDA eğimler olun ve alev sterilize aşılama döngü kullanarak on günlük kültür plaka bir mantar agar fiş transfer. Test tüpü kapağını parafilm ile kapatın.</li>
		<li>28 °C'de 10 gün boyunca karanlıkta eğimleri kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Kapağı tekrar parafilm ile kapatın ve ileride kullanmak üzere buzdolabında 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Mantarı korumak için her altı ayda bir alt kültür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Virülans Bakımı<ol>
<li>Hasta pot tekniğinde belirtildiği gibi hazırlanan saf mantar inokül ile bitkilere bulaştırmak3. Enfekte bitkilerden aynı mantar izole (Koch's postülatlar)9 ve daha fazla deney için kullanın. NOT: Bu çalışmada mantarın bir alan izole suşu kullanılmıştır (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Blotting kağıt tekniği
NOT: Lekeleme kağıdı tekniği sıvı mantar inokülhazırlanmasını, fide hazırlamayı ve hastalık değerlendirmesini gerektirir.
<ol><li>Sıvı R. bataticola inoculum hazırlanması NOT: Sıvı R. bataticola fungal inoculum hem misel hem de mikroskroti içerir. Bu yapıların her ikisi de birincil inokül görevi görededir.<ol>
<li>1.000 mL'lik bir şişede 500 mL PDB ortam hazırlayın ve 15 dakika boyunca 121 lbs'de otoklavlayın.</li>
		<li>Ortam soğuduktan sonra, mantar eğimli bir kültürden bir döngü dolusu mantar agar fişi ile suyu aşılayın ve karanlıkta 180 rpm'de bir çalkalayıcıda beş gün boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Otoklavlı cam veya plastik huni (10 cm), bir litrelik konik şişe ve iki kat örgü (10 cm2 ebat) (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) masada bir araya getirin. Örgükullanarak mantar miselve mikrosclerotifiltre. Otoklavlı blotlama kağıdında mantarı kurutun.</li>
		<li>% 50 inoculum için 100 g misel tartmak ve oda sıcaklığında tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nohut bitkisinin hazırlanması<ol>
<li>Seçin 50 sağlıklı tohum (Bu çalışmada, DRR duyarlı genotip JG 62 kullanılmıştır), 100 mL kabına yerleştirin ve bir örgü ile kaplayın.</li>
		<li>Toprak enkaz kaldırmak için ilk musluk suyu ile tohumları yıkayın.</li>
		<li>Laminar akış odasına tohumlu kabı alın ve yıkama başına 1 dakika boyunca steril 50 mL RO su ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Tohumları 50 mL %2 sulu NaOCl ile 2 dk boyunca sürekli sallayarak sterilize edin ve tohumları 50 mL steril su ile 1 dk'lık beş kez yıkayın.</li>
		<li>Bir polietilen torbayı (47,5 cm x 25 cm) Soilrite ile doldurun (bahçecilik sınıfı genişletilmiş perlitkarışımı, İrlanda turba yosunu ve aynı oranda eksfoliyon vermikülit yani, 1/3:1/3:1/3), yüzeysterilize 50 tohum iki cm derinliğinde ekmek ve 28 °C ± 2 °C sıcaklık, 16 saat fotoperiod 150 μmol m−2 s−1ışık yoğunluğu ve %70 bağıl nem ile bir büyüme odası / oda tutun. Ro su ile su ve ekim sekiz gün sonra bitkilerin kökünü.</li>
		<li>Soilrite parçacıkları kaldırmak için musluk suyunda kökleri yıkayın. Kökleri steril RO suyuyla durulayın ve 1000 mL'lik bir kabın içinde RO suyunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tepsilerde lekeleme kağıdı hazırlanması<ol>
<li>Bir leke kağıt alın ve çoğaltmaları karşılamak için yeterli sayıda parçalar (30 cm × 23 cm) onları kesti.</li>
		<li>Otoklavlanabilir polietilen torba içinde yaprak paketi ve 15 dakika boyunca 121 lbs onları otoklav ve kurutma için sıcak hava fırında tutun.</li>
		<li>Kat her lekeli kağıt levha yarısında.</li>
		<li>Kağıt, Şekil 2i-iv'tegösterildiği gibi temiz, ruhla silinmiş plastik tepsiye yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daldırma ile bitki aşılama<ol>
<li>%50 inoculum elde etmek için 200 mL otoklavlı RO suyunda 100 g mantar inoculumunu 200 mL'lik bir kabın içinde çözün.</li>
		<li>Mantar inokülünün tek tip bağlanmasını sağlamak için bitki köklerini aralıklı yukarı ve aşağı hareketlerle 1 dakika boyunca hazırlanan inoküle batırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bitkileri leke kağıdına yerleştirme<ol>
<li>Steril RO suyu ile tepsiye yerleştirilen leke kağıdının alt tarafını ıslatın. Bitkileri sadece köklerin kağıtla kaplandığı ve sürgünlerin dışarıda bırakıldığı bir şekilde kağıda yerleştirin.</li>
		<li>Blotlama kağıdının üst tarafını katlayarak kapatın ve bitki büyümesini sürdürmek için yeterli su sağlamak için tüm kağıdı ıslatın.</li>
		<li>Tepsiyi günde bir kez sulayın ve tepsileri 28 °C'de tutun. Nekroz, kök çürümesi ve günlük yaprak sararken sararma gibi belirtileri gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hasta pot tekniği
NOT: Hasta pot tekniği öldürücü inokül ve hasta bir tencere hazırlanması, nem seviyesinin korunması ve hastalık belirtilerinin değerlendirilmesi gerektirir.
<ol><li>Substrat hazırlanması<ol>
<li>Herhangi bir ticari nohut tohumu bir kg alın. Enfekte tohumları çıkarın (mantar büyüme, enfeksiyon lekeleri ve böcek hasarı ile tohumlar). 5 L plastik kabıyerleştirin ve büyük enkaz kaldırmak için iyice 3-4 kez musluk suyu ile yıkayın.</li>
		<li>Tohumları 2 L RO suyu yla üç kez yıkayın ve 1 kg'lık tohumları 5 L'lik bir kabın içine beş saat boyunca üç kat daha fazla su ile ıslatın.</li>
		<li>Bir kez tohumlar su imbibed, tohum exudates kaldırmak için RO su üç kez onları yeniden yıkayın.</li>
		<li>Suyu tamamen çıkarın ve tohumları reçel şişelerine (300 mL, 12 cm yükseklik, 6 cm çapında ve 155 g ağırlık) yaklaşık1/4'lük kapasiteye (reçel şişesi başına 100 g) paketleyin ve şişeleri kapaklarla kapatın. Bir otoklavable plastik torba (48 cm x 30 cm) otoklav iki kez 15 dakika boyunca 15 dakika boyunca 121 lbs pack on reçel şişeleri.</li>
		<li>Şişeiçindeki su damlacıklarını çıkarmak için tohumları bir gecede fırında 40 °C'de kurulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hasta kültürünün hazırlanması<ol>
<li>BSL-2 seviyesi laminar akış odasını açın. % 70 etanol ile zemin iyice silin ve 15 dakika UV açın. Sonra, laminar akış odası içinde tohumları tutun.</li>
		<li>10 günlük taze izole R. bataticola kültürünü (bölüm 1) ele alalım. Daha sonra, steril bir pipet ucu veya mantar borer kullanarak üç mantar agar fişleri (4 mm çapında) almak ve aseptik reçel şişeleri içine koyun. Kapaklar ve parafilm ile mühür ile şişe kapağı.</li>
		<li>Mantar diskini nohut tohumlarıile eşit bir şekilde karıştırmak için şişeleri sallayın.</li>
		<li>Şişeleri 30 °C'de karanlıkta 15 gün kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Siyah mantar büyüme ile reçel şişeleri alın(Şekil 4iii)ve steril çömetler kullanarak bir cam Petri plaka reçel şişeleri hasta kültürü (mikrosclerotia ile tohum) aktarın. Bir cam Petri plaka iki gün boyunca oda sıcaklığında kurulayın.</li>
		<li>Mantar kütlesini bir harç ve havan topu kullanarak tozlayın ve tozu 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Autoclave Soilrite iki kez 15 dakika için 121 £ de.</li>
		<li>Otoklavlı Soilrite karışımını güneşlik altında kurutun.</li>
		<li>Mantar tozunu %50 w/w'de Soilrite ile karıştırın, tencereleri karışımla doldurun ve bir gün oda sıcaklığında tutun.</li>
		<li>Tencere başına yüzeye dayanıklı DRR duyarlı nohut tohumu (10 cm yuvarlak kaplar)(Malzeme Tablosu)ekin ve %80 alan kapasitesi (FC) nem seviyesini koruyun.</li>
		<li>Çimlenme sonrası bitkileri söküp nekroz ve kök çürümesi gibi belirtileri gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hasta pot verimliliğinin değerlendirilmesi NOT: Bitkiler kökleri tamamen çürümüş olduğunda sarı foliar belirtileri gösterir.<ol>
<li>Lezyonun (nekrotik lekeler)(Ek Şekil 2C)sayılarını ve kök çürümesinin şiddetine göre bir hastalık skoru geliştirin. %90 bitki ölümünü gösteren hasta kaplar daha fazla kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genotip taraması<ol>
<li>Büyük miktarlarda hasta kültürü hazırlamak ve 30 cm boyunda tencere sterilize Soilrite veya alan toprak (% 5 w / w) ile karıştırın. Yüzeyi ıslamak için tencereleri sulayın ve yedi gün boyunca bozulmadan bekletin.</li>
		<li>10 cm yuvarlak tencere başına bir yüzeysterilize tohum ve 30 cm yuvarlak tencere başına üç tohum ekin ve yeterli su.</li>
		<li>Sarı foliar ve kök çürümesi belirtileri gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombine kuraklık ve R. bataticola enfeksiyonu<ol>
<li>Sinha ve ark.'da (2019) belirtilen protokolleri izleyerek kuraklık stresi uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Blotting kağıt tekniği laboratuvar koşullarında nohut genotipleri ekrana basit bir yaklaşım sağlar. Dip aşılama, inokül yükü üzerinde kolay kontrol(Ek Şekil 1)ile etkileşimin zamansal olarak araştırılmasını sağlar ve in vitro taramayı kolaylaştırır. Ayrıca genç fideler bile kullanılabilir. Beş günlük mantar kültürü(Şekil 1B)bitkilere bulaştırmak için yeterli inoculum verebilir. Sıvı inokül hem misel hem de mikroskroti içerir (Şekil 1D & ...

Kuru kök çürümesi (DRR) nohut1,2ekonomik açıdan önemli hastalıklardan biridir. Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Makroforin phaseolina)neden olduğu köke özgü bir hastalıktır. Enfekte bitkiler lateral kökleri eksikliği ve kırılgan taproots ve sarı yaprakları1,3sahip . Kuraklık stres altında DRR nohut ekimi için ortaya çıkan bir tehdit olduğu bildirilmiştir1,2,3. Ayrıca, DRR insidansı alan koşulları altında kuraklık stres altında ağırlaştırılmış olduğu bildirilmiştir1,2,3. DRR daha fazla sulu alanlarda daha yağmurla beslenen alanlarda yaygındır4. Dirençli çeşitlerin kullanımı hastalığın üstesinden gelmek ve fungisit kullanımı atlatmak için bir yoldur1,13. Nohut germplasm dünya çapında mevcut özelliği için genetik varyasyon barındıran çünkü5,tarama ve dirençli / duyarlı genotiplerin belirlenmesi ürün geliştirme için moleküler ıslahı için önemlidir.
Sağlam, kolay ve uygun maliyetli hastalık tahlilleri nohutta R. bataticola enfeksiyon modellerini araştırmak için gereklidir. Nohut genotiplerinin R. bataticola enfeksiyonuna tepkisini gözlemlemek için kullanılan birincil hastalık, lekeleme kağıt tekniği1,4'tür. Bu basit bir tekniktir ve sıvı mantar inoculum kullanılarak yürütülebilir, kökleri ile fideler, ve steril leke kağıt. Ancak literatürde adım adım protokol bulunmadığından bu teknik en üst düzeyde kullanılmamıştır.
Bu arada, hasta pot tekniği potansiyel bir hasta kültürünün hazırlanması ve kuraklık stres dayatılması içerir. Kuraklık stresi DRR hastalığı insidansını ağırlaştırdığı göz önüne alındığında3, bu kuraklık stres altında bitki-patojen etkileşimi çalışmak için gereklidir6,7. Hasta pot tekniği böyle bir eşzamanlı çalışma için platform sağlar, germplasm tarama için daha iyi olanaklar teşvik ve etkileşim mekanistik temelini anlamak. Kök uzunluğunun artması ve lateral kök sayısında azalma gibi patomorfolojik değişiklikler —DRR hastalığına bağlı olarak— hasta pot tekniği1,3,7kullanılarak ele alınabilir.
Burada, nohut ve R. bataticola ve ekran nohut germplasm arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilecek kağıt ve hasta pot teknikleri, lekeleme için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çalışmada kullanılan malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Mantar- Rhizoctonia bataticola</td><td>Patojen inoculum</td><td>Hint Tipi Kültür Koleksiyonu No. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id = 1251 & Itemid = 1370)</td></tr> <tr><td>Soilrite karışımı</td><td>Laboratuvarda toprak ortamı</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, Hindistan</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Bitki büyümesini desteklemek için kurutma kağıdı</td><td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Saksı</td><td>Büyüyen bitkiler</td><td>10 ve 30 cm boyutunda saksılar</td><td>Rutin olarak kullanılan fidanlık saksıları, örneğin https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Patates dekstroz agar/et suyu</td><td>Mantarı kültürleyin ve bakımını</td> yapın <td>Kedi # 213400, DifcoTM, MD, ABD</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Kuluçka</td><td>makinesi Mantar kültürü</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, kuluçka makinesi ve çalkalayıcı</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Büyüme odası</td><td>Kontrollü durumda büyüyen bitkiler</td><td>model numarası. A1000, Conviron, Kanada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Laminer hava akımı</td><td>Aseptik egzersizlerin yapılması</td><td>Telstar, Bio II advance, Class II kabin, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Mantar misellerinin filtrelenmesi</td><td>Naylon cibinlik</td><td>Mesh 0,6-1 mm çapında gözenek boyutu ile</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Otoklav ortamı ve nohut tohumları</td><td>Otoklav</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>Mikroskoplar</td><td>Mantar misellerinin enfeksiyonunun görüntülenmesi</td><td>SMZ25 / SMZ18, Araştırma Stereomikroskopları, Leica EZ4 eğitici stereomikroskop</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Tartı terazisi</td><td>Mantar ve kimyasalların tartılması</td><td>Sartorius Elektronik Tartı Terazisi, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Mantar boyama</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>Anilin</td><td>mavisi Mantar boyama</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

nohutta kuru kök Çürüklüğü hastalığı tahlilleri: detaylı bir metodoloji

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Kuru kök çürümesi (DRR) hastalığı, dünyada nohut yetiştiriciliği için ortaya çıkan biyotik stres tehdididir. Bir toprak kaynaklı mantar patojeni neden olur, Rhizoctonia bataticola. Literatürde hastalık tahlilleri ile ilgili kapsamlı ve ayrıntılı adım adım protokoller seyrektir. Bu makalede, DRR direnci için genotiplerin hızlı bir şekilde taranması için bir lekeleme kağıt tekniği kurma dahil adımlar hakkında tam ayrıntılar sağlar. Lekekağıt tekniği kolay ve daha az pahalıdır. Başka bir yöntem, hasta pot yaklaşımına dayalı, doğal enfeksiyon bir taklit ve etkileşen bileşenleri incelemek için uygulanabilir -bitki, patojen, ve çevre-hastalık üçgeninde yer.
Ayrıca, doğada, DRR çoğunlukla bitki büyüme ilerledikçe toprak nem çekilir yağmurla beslenen nohut yetiştirme alanlarında oluşur. Kuraklık stresi DRR hastalığına nohut bitkileri yatkınlık bilinmektedir. Kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler olarak anlaşılması, nohut mikroplu havuzdan drr dirençli elit çeşitlerin belirlenmesinin önünü açabilir. Bu makalede, bir hasta pot ve sonraki hastalık tsay hazırlanması için adım adımlı bir metodoloji sağlar. Genel olarak, burada sunulan bilgiler araştırmacılarR bataticola mantar inoculum hazırlamak, bu patojen korumak, leke kağıt tekniği kurmak, hasta kültür ve hasta pot hazırlamak ve nohut bitkilerde patojen enfeksiyonu değerlendirmek yardımcı olacaktır.

Bu çalışmada, kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler anlaşılmasını kolaylaştırmak için kağıt ve hasta saksı teknikleri gibi teknikler gösterilmiştir. Bunu başarmak için, DRR belirtileri sergileyen bitkiler1,3,4 bir nohut alanından toplandı ve mantar hiphal ucu yöntemi 8 kullanılarak izole edildi . R. bataticola mantar kültürü, kuluçkadan dört gün sonra PDA...

Bu çalışmada nohut-Rhizoctonia bataticola etkileşiminin altında yatan patomorfolojik ve moleküler mekanizmaları incelemek için metodolojiler sunulmuştur. Blotting kağıt yöntemi hızla nohut genotip yanıtları çalışma için yararlıdır, hasta pot tabanlı yöntem aynı anda kuraklık ve R. bataticola enfeksiyon empoze etmek için kullanılabilir ve toleranslı genotipler için ekran.

Nohutta Kuru Kök Çürüklüğü Hastalığı Tahlilleri: Detaylı Bir Metodoloji

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Bu çalışmanın temel amacı, kağıt tekniği ve hasta saksı tekniği gibi kuru kök çürüklüğü hastalıklarının ayrıntılı bir metodolojisini göstermektir. Bu teknikler nohut bitki ve Rhizoctonia bataticola arasındaki etkileşimi incelemek için yararlı olacaktır. Mantar patojeni Rhizoctonia bataticola ile chickweed bitki etkileşimini anlamak tarımsal açıdan önemlidir.Bunun için çok yönlü ve son derece tekrarlanabilir testlergereklidir. Burada, laboratuarımızda yaygın olarak kullanılan iki tahlil gösterilmiştir. Bunlardan biri kağıt tabanlı lekeleme, ve diğer hasta pot tabanlı test.Leke kağıt analizi yürütmek için, katkı kültüründen Petri plaka ve daha sonra sıvı kültür kadar ölçekleme tarafından Rhizoctonia bataticola mantar inoculum hazırlamak. Büyük bir tencerede tohum ekim, nohut fidanlık hazırlayın. Onları kökünden ve sıvı inoculum koyun ve blotting kağıt üzerine yerleştirin.Hastalık belirtileri için gözlemlemek, yani, kök nekroz, kök çürümesi, ve inogülasyon sekiz gün sonra yaprak sarar. Burada gösterilen bir özet, kağıt tekniği lekeleme adımları. Hasta pot testini yürütmek için nohut yemeğini mantarla aşılamak.15 gün boyunca 30 derecede kuluçkadan sonra hasta kültürü elde edilir. Sonra, onları toz ve pot karışımı ile karıştırın. Kontrol pot ve hasta tencere üzerinde tohum ekin.İlerleyen günlerde, semptomlar için gözlemlemek, yani kök nekroz, kök çürümesi, ve enfekte bitkilerüzerinde yaprak sarar, ekim 10 gün sonra. Hasta pot kadar ölçeklendirilebilir ve büyük ölçekli gösterimleri için kullanılabilir. Burada gösterilen hasta pot tekniğinde adımların bir özet.Rhizoctonia bataticola gelişmekte olan bir patojendir. Bu mantar hyphae ve microsclerotia üretir, hangi bitki enfeksiyonu sırasında birincil inuclum olarak hareket. İzolatif yöntemle uygulanan saf kültür tahliller için kullanılır.Bu başarılı tahliller için anahtar nokta optimum inoculum yüktür. Lekeleme kağıt tekniğinin gösterimi burada başlar. Sıvı Rhizoctonia bataticola inoculum hazırlamak için, üç günlük taze plaka kültüründen fungal agar fişi ile 500 ml suyu aşılayın ve beş gün boyunca 28 santigrat derece bir kuvöz de şişe kuluçka.Mikrosclerotia ile koyu gri mantar misel filtre. Otoklavlı suda askıya alın ve ortamı çıkarın. Yine miseli filtreleyin ve birkaç dakika misel kurutarak nemi çıkarın.Bir reçel şişesinde otoklavlı su 200 ml mantar inokül 100 gram askıya alın ve düzgün karıştırın. Tek taban da yüzey sterilize tohumlar ekim tarafından nohut kreş geliştirin. Ekimden sekiz gün sonra bitkileri sökün, yıkayın ve otoklavlı RO ile durulayın. Bir leke kağıt alın ve bir kez katlayın ve tepsiye yarısını yerleştirin.Otoklavlı su ile ıslak olun. Bitkileri alın ve aralıklı yukarı ve aşağı hareket ile 30 saniye boyunca inoculum içine daldırma. Kökleri levha içinde kaplı ve folia dışında kalır şekilde bitkiler yerleştirin.Diğer yarısını katlayın ve kağıdı bükün. Kontrol için, otoklavlı suya bitkiler daldırma, sekiz gün boyunca bir büyüme odasında tepsileri tutun. Sonuç -ları. Yaprak sararma, kök çürümesi, kökne nekroz ve lateral kök sayısında azalma gibi belirtiler için gözlemleyin.Hasta saksı tekniğinin gösterimi burada başlıyor. Bir kilo ticari nohut tohumu alın. Tohumları musluk suyuyla yıkayın ve RO suyuyla tekrar yıkayın.Tohumları beş saat bekletin. Yine, RO su ile tohumları yıkayın bir reçel şişesinde 300 gram ekleyin. 121 LVS'de 15 dakika boyunca iki kez sürekli olarak otoklavlayın.Soğuttuktan sonra, lamina akışı ile şişe aktarın. Üç mantar agar fişleri ile şişe aşılamak yaklaşık dört milimetre kare boyutları ve düzgün karıştırmak için iyi sallayın. Şişeleri sarın ve 15 gün boyunca 30 derecede bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.Nohut tohumları etrafında koyu misel büyüme ile şişeler için gözlemlemek ve tohumları kaldırın. Oda sıcaklığında kurulayın ve toz. Mix Rhizoctonia bataticola toz solorite ile ve beş gün oda sıcaklığında saklayın.Yüzey GT62 tohumlarını sterilize eder ve iki santimetre derinlikte ekin. Sonuç -ları. Hasta tencerede %90 mortalite gözönünden. Ekimden 10 gün sonra, köklerde nekroz ve lateral kök sayısında azalma ve sonraki günlerde yaprak sarargibi semptomları gözlemleyin.Hasta tencere tarla toprağında da hazırlanabilir. Kuraklık ve Rhizoctonia bataticola enfeksiyonu. Suyu tutarak hasta tencereye kuraklık stresi uygulayın.Burada kontrol, kuraklık, patojen ve eşzamanlı kuraklık ve patojen strese maruz kalan bitkiler gösterilmiştir. Semptomlar için gözlemlemek, yani, daha fazla nekroz, kök çürümesi, ve lateral kök sayısında azalma, ve kombine stres tedavisinde kök uzunluğu patojen sadece tedavi ile karşılaştırıldığında. Sonuç. Blotting kağıt tekniği In Vitro koşullarında yapılabilir.Hasta pot tekniği In Vivo koşullarında yürütülebilir. Hasta limanda, abiyotik stres, yani, kuraklık stres, patojen enfeksiyonu ile birlikte empoze edilebilir. Bu teknikleri kullanarak, bir patojen enfeksiyon desen inceleyebilirsiniz.Fizyolojik değişikliklerin çoğu nohut-Rhizoctonia bataticola etkileşimi sırasında meydana gelir ve ayrıca direnç için nohut genotipleri tarar. Leke kağıt analizi çok mikroskopi ve moleküler biyoloji çalışmaları için kaliteli örnekler oluşturmak için yararlıdır. Doğal enfeksiyon koşullarını taklit eden hasta pot atabi nohut germplazmı taraması için geçerlidir.

dry-root-rot-disease-assays-in-chickpea-a-detailed-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Tarif edilen hidrofobik kokültivasyon sistemi, metal örgülü elekler ile bozulmamış bitkileri destekler ve bunları bakteriler ile birlikte yetiştirir. Bitki dokuları, bakteriler ve salgılanan moleküller daha sonra aşağı akış analizleri için ayrıca hasat edilebilmekte, aynı anda her iki bitki barınağının ve etkileşen mikropların veya mikrobiyolojilerin moleküler tepkileri araştırılabilmektedir.

Bitki / Mikrop Moleküler Etkileşimlerinin ve Sinyalizasyonunun Eşzamanlı ve Sistematik Analizi için Hidroponik Birlikte Yetiştirme Sistemi

Sunulan belirli bir kompost bakteri ve mantar büyüme Rhizoctonia solanibastırmak bulunma olasılığı olup olmadığını belirlemek bir plaka rekabet tahlil için bir protokoldür.

Bir plaka rekabet tahlil olarak hastalık bastırma hızlı bir ön değerlendirme

Karpuzun Fusarium solgunluğunu yönetmek, mevcut patojen ırkları hakkında bilgi gerektirir. Burada, patojenik mantar Fusarium oxysporum f. sp niveum'un (Fon) ırk tiplemesindeki etkinliklerini göstermek için kök daldırma, istila edilmiş çekirdek tohumlama ve modifiye tepsi daldırma aşılama yöntemlerini açıklıyoruz.

Bilinmeyen Fusarium oxysporum f.sp. Irkını Belirlemek İçin Kullanılan Üç Aşılama Tekniğinin Kontrastı. niveum Yalı -tır

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Arabidopsis ve Medicago'nun kök sistem mimarisini (RSA) incelemek için basit laboratuvar araçları kullanıyoruz. Fideler ağ üzerinde hidroponik olarak yetiştirilir ve RSA'yı ortaya çıkarmak için bir sanat fırçası kullanılarak yayılır. Görüntüler tarama veya yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılarak alınır, daha sonra özellikleri haritalamak için ImageJ ile analiz edilir.

Bitki kök sistemi mimari özelliklerini haritalamak için basit bir protokol

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Keşfedin nohutta kuru kök çürüklüğü hastalığı tahlillerini; Rhizoctonia bataticola ile bitki-patojen etkileşimlerini incelemek için filtre kağıdı ve hasta saksı tekniklerini kullanın. Bu yöntemler genotip taraması için uygundur.

Nohutta Kuru Kök Çürüklüğü Hastalığı Tahlilleri: Detaylı Bir Metodoloji

Daha fazla video keşfet