Name: Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin fare beyin dilimleme yöntemiyle hipokampal ağ salınımlarını incelemeyi. Bu protokol spontan keskin dalga dalgalanması aktivitesini koruyarak elektrofizyolojik kayıtlar yapmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar, Steve Siegelbaum'a destek için teşekkür eder. Finansman 5R01NS106983-02 ve 1 F31 NS113466-01 tarafından sağlanmaktadır.

Burada açıklanan tüm yöntemler Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AC-AAAU9451) tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümler hazırlayın
<ol><li>Tablo 1'de açıklandığı gibi dilimleme için sakkaroz kesme çözeltisi hazırlayın. NOT: 1 L sakkaroz çözeltisi hazırladıktan sonra, bir buz tepsisinde az miktarda (yaklaşık 100-200 mL) dondurun. Bu donmuş sakkaroz buz küpleri buzlu bir bulamaç içine karıştırılacaktır (bkz. adım 4.3).</li>
	<li>Tablo 2'de açıklandığı gibi kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.</li>
	<li>eser metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş 1 mL arıtılmış suda 0,05844 g NaCl çözerek 1 M NaCl'yi stimülasyon pipetleri için hazırlayın. NOT: Sakkaroz kesme çözeltisi ve ACSF her deney için taze hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. Agar rampası hazırlayın
<ol><li>Agar tozlarını eser metalleri ve diğer safsızlıkları gidermek için filtrelenmiş arıtılmış suya eriterek% 4 agar (örneğin, 50 mL suda 2 g agar) hazırlayın. Karışımı bir mikrodalga fırında kaynamaya başlayana kadar ısıtın (yaklaşık 30-60 s). Erimiş agarı bir kalıba dökün ve yaklaşık 12 ° eğimdeki bir buzdolabında 4 ° C'de soğumasını ve katılaşmasını bekleyin. NOT: Bir kalıp için, 4 cm uzunluğunda ve yaklaşık 0,8 cm yüksekliğinde bir rampa oluşturacak kadar erimiş agar dökülmüş bir açıyla ayarlanmış herhangi bir cam veya plastik kap kullanılabilir.</li>
</ol>3. Dilimleme alanını sahnele
<ol><li>Yaklaşık 250 mL ACSF ile bir dilim geri kazanım odası içeren 400 mL'lik bir kabı doldurun; 32 °C'ye kadar ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin ve karbojen (%95 oksijen gazı/%5 karbondioksit gazı) ile köpürmeye başlayın. NOT: Geri kazanım kabını, tutma odasının naylon a örgüsünü çözeltinin en yüzeyine yerleştirmek için yeterli sıvı ile doldurun, böylece dilimler sıcak çözelti karışımının ve havanın arayüzünde tutulacaktır (Şekil 1). Naylon ağın üzerine küçük lens kağıdı parçaları yerleştirin. Dilimler, daha sonra dilimleri kayıt odasına ayrı ayrı aktarmak için kullanılabilecek lens kağıdının üzerine uzanır (bkz. adım 6.6).</li>
	<li>Rahatlamak ve karbojen ile köpürmeye başlamak için bir buz kovasına sakkaroz çözeltisi ile bir şişe yerleştirin. NOT: Geri kazanım kabı ve sakkaroz çözeltisi, fare izofluran odasına yerleşmeden önce en az 30 dakika boyunca karbojen köpürerek sırasıyla ısıtılmalı ve soğutulmalıdır.</li>
	<li>Önceden hazırlanmış, donmuş sakkaroz çözeltisi buz küplerinin tepsisini dondurucudan çıkarın ve kısmen çözülmek için tezgaha yerleştirin.</li>
	<li>Temiz çift kenarlı jiletlerin yarısını mikrotom içine yerleştirin ve gerekirse kalibre edin. Diseksiyon sırasında kullanılmak üzere jiletin diğer yarısını bir kenara koyun.</li>
	<li>Dilimleme odasına bir karbojen hattı ve sıcaklık probu çalıştırın ve odayı soğutmak için buzla çevrelenin.</li>
	<li>İki tek kullanımlık emici ped ile kaplı temiz bir tezgah veya masa hazırlayın. Tüm diseksiyon aletlerini ve üç parça laboratuvar bandını, transkardiyal perfüzyonun yapılacağı sol ped üzerine dağıtın. NOT: Diseksiyon aletleri arasında küçük Bonn makası, disektör makası, büyük spatula/kaşık, mikrospatula, yeni bıçaklı neşter, spatula, keskin/künt cerrahi makas, büyük doku asaları ve küçük doku asaları bulunur (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Perfüzyon alanının sağındaki diğer emici pedde, 100 mm çapında bir cam Petri kabının kapağına dairesel bir filtre kağıdı yerleştirin. Petri kabının altını kapağın yanına yerleştirin ve kabın her iki parçasına da bir karbojen hattı yerleştirin.</li>
	<li>Küçük bir agar rampasını kesmek için jilet veya neşter kullanın (açılı yüzey boyunca yaklaşık 4 cm, 0,8 cm yüksekliğinde, 2 cm genişliğinde). Rampanın bir parçasını uzun ucundan kesin ve bir agar destek bloğu oluşturmak için ters çevirin. Agar rampasını ve destek bloğunu dilimleme platformuna yapıştırmak ve bir kenara ayırmak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın. NOT: Agar'ın destek bloğu, dilimleme sırasında beynin stabilize etmesine yardımcı olur ve gereksiz dokuları her dilimden ayıracak bir yüzey sağlar (Şekil 1).</li>
</ol>4. Transkardiyal perfüzyon
<ol><li>60 mL kapasiteli şırınnayı, sakkaroz kesme çözeltisi için tezgah tepesinden yaklaşık 18 inç yukarıda bir rezervuar olarak askıya alın (örneğin, dikey bir direk üzerinde üç uçlu döner kelepçe kullanarak). Boruyu rezervuarın dibine takın, boruyu bir rulo kelepçeden geçirin ve tüpün diğer ucunu temiz bir 20 G iğneye bağlayın.</li>
	<li>60 mL'lik rezervuarı yaklaşık 30 mL soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun ve perfüzyonu sürekli kabarcıklamak için bir karbojen hattını sakkaroz rezervuarına yönlendirin. NOT: Sakkarozun herhangi bir sıkışmış kabarcık olmadan boru ve iğneden aktığından emin olun. Akış hızı, iğneden sürekli damlayan sakkaroz akışına sahip olacak kadar hızlı olmalıdır.</li>
	<li>Bir blender kullanarak, donmuş sakkarotu ezin ve buzlu bir bulamaç haline getirin ve bulamacı dağıtmak için büyük spatula / kaşığı kullanın.<ol>
<li>Cam Petri kabı kapağının kenarlarına az miktarda sakkaroz bulamacı yerleştirin. Petri kabının tabanına az miktarda sakkaroz bulamacı ekleyin.</li>
		<li>Perfüzyon sıvısı rezervuarı için kabaca 20-30 mL sakkaroz bulamacı ekleyin, rezervuar çok soğuk, ağırlıklı olarak sıvı sakkarozun bir karışımını içerene kadar 30 mL soğutulmuş sıvı sakkaroz ile iyice karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir odaya yerleştirin. Yaklaşık 2 L/dk'da oksijen akışı ile buharlaştırıcının kadranını çevirerek izoflurane %5 konsantrasyonda teslim edin ve bir zamanlayıcı başlatın. NOT: Dilimlerin ne kadar hızlı elde edildiğini ölçmek için bu zamanlayıcıyı dilimleme boyunca devam ettirin. İşlem mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır, böylece dilimleme tamamlanır ve doku, hayvanın izofluran odasına girmesinin 15-20 dakika içinde arayüz odasında geri kazanılır. Derin anestezi durumunun sağlandığından emin olmak için fareyi izleyin. En az 5 dakika sonra, fare derinden uyuşturulmalı ve parmak sıkışmalarına tepkisiz olmalıdır.</li>
	<li>Fareyi izofluran odasından çıkarmadan hemen önce, Petri kabı kapağını yaklaşık 3-5 mm derinliğe kadar soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun ve Petri kabı tabanını yaklaşık 1,0 cm derinliğe kadar soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Fareyi hızlı bir şekilde sol emici pedine aktarın ve ön ayakları ve kuyruğu sabitlemek için 3 bant parçasını kullanın. Herhangi bir kesi yapılmadan önce farenin tepkisiz olduğundan emin olmak için bir arka ayak parmağı kıstırma gerçekleştirin. Büyük doku tokmaklarını ve cerrahi makası kullanarak, cildi çadırlayın ve sternumun dibinden göğsün üstüne kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Asaları kullanarak sternuma çekin ve diyaframı kesmek için makası kullanın. NOT: Farenin bilincinin yerine gelmemesini sağlamak için farenin ilk konumlandırılması ve diyaframı kesmek için ilk birkaç kesi mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. İşlem boyunca yeterli anestezi derinliğini sağlamak için, perfüzyon sırasında izofluran vermek için fareye bir burun konisi yerlenebilir.</li>
	<li>Her iki taraftaki göğüs kafesini kesmek için makası kullanın, ön ayakla vücudun birleştiği noktaya doğru büyük bir hareketle kesin. Önps ile göğüs kafesinin önünü uzağa ve kafaya doğru sallayın ve ardından büyük makası kullanarak yatay bir kesikle tamamen çıkarın. Büyük tokaları kullanarak kalbi yerinde tutun ve 20 G perfüzyon iğnesini sol ventrikül içine yerleştirin. İğne doğru şekilde konumlandıktan sonra, soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ventrikülü doldurduğu için kalbin sol tarafı hızla solgun olmalıdır.</li>
	<li>Sağ atriyuma kesmek ve kanın dolaşım sisteminden akmasını sağlamak için küçük distör makasını kullanın. Kesiler doğru yapılırsa, kalbe minimum hasar verilmeli ve perfüzyon boyunca pompalama işlemine devam etmelidir. NOT: Yuvarlanmış kağıt parçaları, kalpten kan ve sakkaroz çözeltisini yok etmek ve işlem sırasında perfüzyon iğnesinin görünürlüğünü korumak için kullanılabilir.</li>
	<li>Perfüzyon iğnesinin yerinde kalmasını ve sol ventrikülden düşmemesini sağlayın. Uygun bir akış hızı ve yerleşim ile karaciğer 20-30 sn ile açık tenli / bej bir renge solmaya başlayacaktır.</li>
	<li>30-45 sn'den sonra, farenin kafasını kesmek için büyük makası kullanın. Başı sol elde tutarak, cildi kafatasından uzaklaştırın veya soyun. İyi perfüzyonlu bir hayvanda, kafatası çok solgun olmalı ve beyin, açıkça görülebilen kan damarları olmadan kafatasından çok açık pembe bir renk (beyaza yaklaşan) görünmelidir.</li>
</ol>5. Beyni çıkarın ve dilimleri kesin
<ol><li>Küçük Bonn makasını kullanarak, kafatasının önünde, gözlerin yanında orta çizgiye doğru kafatasından iki yanal kesik yapın. Kafatasının tabanının her iki tarafında iki ek kesik yapın.</li>
	<li>Başı, çoğunlukla soğutulmuş sakkaroz çözeltisine daldırılması gereken cam Petri kabının dibine aktarın. Kafatasının uzunluğu boyunca orta çizgiyi kesmek için küçük Bonn makasını kullanın, alttaki beyin dokusunun hasar görmesini en aza indirmek için makasla yukarı çekerek. Küçük doku asalarını kullanarak, kafatasının her iki tarafını sıkıca kavrayın ve bir kitap açmak gibi beyinden yukarı ve uzağa sallayın.</li>
	<li>Kafatasının kapaklarını açık tutmak ve mikrospatulayı beynin altına koku ampullerinin yanına yerleştirmek için sol elin parmaklarını kullanın. Beyni kafatasından sakkaroza çevirin ve beyin sapını kesmek için mikrospatulayı kullanın. Kalan kan, kürk veya diğer dokuları çıkarmak için beyni yıkayın.</li>
	<li>Beyni cam Petri kabının kapağına aktarmak için büyük spatula / kaşığı kullanın. Çift kenarlı jiletin diğer yarısı daha önce ayrılmışken, önce beyincikleri ve daha sonra koku ampulleri de dahil olmak üzere beynin en ön kısmını çıkarmak için iki koronal kesim yapın (Şekil 1).</li>
	<li>Agar rampasına siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Çok kısa bir süre beyni büyük doku tokmaklarını kullanarak bir kuru filtre kağıdı parçasına yerleştirin ve hemen agar rampasına aktarın, beynin ventral yüzeyini yapıştırıcıya yerleştirin. NOT: Ara hipokampüsün dilimleri için, beyin ön kısmı rampanın eğimine bakan ve arka kısmı bıçağa daha yakın olacak şekilde yönlendirilmelidir. Ventral hipokampüsün dilimleri için, beyni ön ucu rampanın eğiminden aşağı doğru, arka ucu rampanın üstünde, bıçaktan daha uzakta olacak şekilde yönlendirin. Her iki durumda da, beyin rampanın tepesine konumlandırılmalıdır, böylece beynin koronal kesimli yüzeyi ağar destek bloğuna temas etmelidir (Şekil 1).</li>
	<li>Agar ve beyin ile dilimleme platformunu mikrotomların dilimleme odasına yerleştirin ve soğutulmuş sakkaroz çözeltisi ile tamamen daldırın. Bazı sakkaroz bulamacı odaya aktarmak için büyük spatula / kaşığı kullanın, donmuş sakkarozu eritmek için karıştırın ve karışımın sıcaklığını hızla ~ 1-2 ° C'ye düşürün. NOT: Dilimleme boyunca sıcaklık göstergesini izleyin. Sakkaroz çözeltisi 3 °C'nin üzerinde ısınırsa, daha fazla bulamaç ekleyin ve sıcaklığı tekrar düşürmek için karıştırın.</li>
	<li>Mikrotom hızı 0,07 mm/s olarak ayarlanmış 450 μm kalınlığında dilimleri kesin. Her dilim serbest bırakıldığında, önce iki yarımküreyi ayırmak için küçük doku tokalarını ve keskin bir neşteri kullanın ve daha sonra dilim öncelikle hipokampus ve parahippocampal bölgelerden oluşana kadar dokuyu kesin (Şekil 1).</li>
	<li>Dilimleri arayüz kurtarma odasına ayrı ayrı aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın, bu da dilimleri kaplayan sadece ince bir ACSF menisküs ile ACSF'nin arayüzüne ve havaya konumlandıklarından emin olmak için. Odanın kapağını sıkıca kapatın ve dilimlerin 30 dakika boyunca 32 °C'de toparlanmasını sağlar.</li>
	<li>32 ° C'deki ilk geri kazanımdan sonra, arayüz geri kazanım odasını su banyosundan getirin ve manyetik karıştırma çubuğunun oda içinde ACSF dolaşımını teşvik etmesi için yavaş bir hıza ayarlanmış bir karıştırıcıya yerleştirin. Dilimler 90 dakika daha iyileştikçe oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumasını bekleyin. Kurtarma odasının sürekli olarak karbojen ile kabarcıklı olduğundan emin olun ve büyük kabarcıkların dilimlerin altına sıkışmasına izin vermeyin.</li>
</ol>6. Spontan aktivitenin yerel alan potansiyeli (LFP) kayıtlarını gerçekleştirin
<ol><li>Satın alma yazılımını çalıştıran bilgisayar, bilgisayara bağlı monitör, uyarıcılar, mikromanipülatör, sıcaklık kontrolörü, mikroskop ışık kaynağı, mikroskop takılı kamera, mikroelektrod amplifikatör, sayısallaştırıcı ve peristaltik pompa dahil olmak üzere gerekli tüm ekipmanları açarak LFP kayıtlarına hazırlanın. Merkezi bir vakum sistemi kullanıyorsanız, ACSF'yi kayıt odasından çıkaracak vakum hattını hazırlamak için duvar vanasını açın.</li>
	<li>Isıtılmış rezervuarı ACSF ile doldurun, ardından borunun bir ucunu köpüren ACSF içeren 400 mL'lik kabın içine yerleştirin. ACSF'yi 400 mL'lik beherden ısıtılmış rezervuara ve rezervuardan kayıt odasına yönlendirmek için peristaltik pompayı açın. Sıkışan kabarcıkları serbest bırakmak için boruya dokunun veya kıstırın.</li>
	<li>Kayıt odasından geçen ACSF akış hızının hızlı (~ 8-10 mL / dk) olduğundan emin olmak için peristaltik pompayı ayarlayın. ACSF'nin kayıt odasının merkezinde 32 °C olduğundan emin olmak için bir sıcaklık probu kullanın. NOT: ACSF peristaltik bir pompa kullanılarak kayıt odasına teslim edilirse, yüksek debi akış hızında önemli bir dalgalanmaya neden olabilir. Boruya entegre edilmiş bir dizi boş şırıngdan oluşan basit bir titreşim sönümleyici kullanılarak tutarlı akış hızları elde edilebilir (Şekil 2).</li>
	<li>Isıtılmış filament çekerek borosilikat cam kılcal damarlardan stimülasyon ve kayıt pipetleri hazırlayın. Çekme protokolü, stimülasyon veya yerel alan potansiyel kayıt elektrotları için 2-3 MOhm direncine sahip pipetler verecek şekilde yapılandırılmalıdır.</li>
	<li>Stimülasyon pipetlerini ACSF ile 1 M NaCl ve LFP pipetlerle doldurun.</li>
	<li>ACSF akışını duraklatmak için boruyu kısaca sıkıştırın ve pompayı kapatın. Lens kağıdının bir köşesini kavramak için ince forseps kullanarak bir dilimi kayıt odasına aktarın, dilim lens kağıdına yapışır. Lens kağıdını yerleştirin ve dilim aşağı bakacak şekilde kayıt odasına dilimleyin, ardından dilimi kayıt odasına batırarak lens kağıdını "soyun". Dilimi bir arp kullanarak sabitleyin. NOT: Harps, U şeklinde paslanmaz çelik veya platin ve ince naylon filament kullanılarak önceden yapılmış veya laboratuvarda yapılabilir.</li>
	<li>Manuel mikromanipülatöre NaCl dolgulu bir stimülasyon pipeti yerleştirin ve pipet ucunu yavaşça dilimin yüzeyine (örneğin stratum radiatum tabakasında) yaklaşık 30-45° açıyla ilerletin. Pipet ucu dokuya girdikten sonra, pipeti yavaşça ileri doğru ilerletin ve dilim içindeki aksonlara gereksiz yere zarar verebilecek yanal veya dikey yöndeki büyük hareketlerden kaçının. Pipet ucunu dilime en az 50-100 μm derinliğe yerleştirin ve dilimleme sırasında yüzeye yakın hücrelerin zarar görmesini önleyin.</li>
	<li>Motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucusuna ACSF dolu bir LFP pipet yerleştirin. Ağız basıncını veya bir stopcock valfi ve pipet tutucuya kısa bir boru uzunluğu ile bağlanmış 1 mL şırınna kullanarak çok hafif bir pozitif basınç uygulayın. NOT: İlgi sinyallerini kaydetmek için LFP pipetlerini dilim içinde konumlandırın: keskin dalga dalgalanmaları durumunda, stratum piramitine (SP) bir LFP pipeti ve stratum radiatumunda (SR) ikinci bir pipet yerleştirilmelidir. Bu yapılandırma, SR'deki negatif keskin dalganın ve SP'deki yüksek frekanslı dalgalanma salınımının eşzamanlı kayıtlarına izin verir (Şekil 3).</li>
	<li>Mikromanipülatör kullanarak, LFP pipetinin ucunu yaklaşık 30-45 ° 'lik bir açıyla ilgi alanına (örneğin, CA1 piramidal hücre tabakası) yavaşça ilerletin. Pipet ucunu dilime en az 50-100 μm derinliğe yerleştirin ve dilimleme sırasında yüzeye yakın hücrelerin zarar görmesini önleyin. LFP pipeti ilerletirken, alma yazılımını kullanarak sürekli olarak küçük bir voltaj testi darbesi sunun ve elektrot direncinde ani bir artış meydana gelen bir artışa dikkat edin. Bu, pipetin tıkandığını veya bir hücreye bastırıldığını gösterebilir.</li>
	<li>LFP pipet ilgi alanına konumlandıktan sonra, pipet tutucusuna bağlı boru üzerindeki vanayı açarak pozitif basıncı dikkatlice serbest bırakın.</li>
	<li>LFP'yi aynı anda ikinci bir konuma kaydetmek için, 6.8–6.10 adımlarını ikinci bir pipet ve mikromanipülatörle yineleyin.</li>
	<li>Pipetin seri direncini düzeltmek için alım yazılımındaki köprü dengesi işlevini kullandıktan sonra yerel alan potansiyelinde spontan aktiviteyi kaydetmek için mevcut kelepçe konfigürasyonunda mikroelektrod amplifikatörü kullanın. Spontan SWR'ler SP tabakasının hücre dışı potansiyelinde pozitif sapmalar olarak görünecektir (Şekil 3).</li>
	<li>Uyarılmış alan potansiyellerini kaydetmek için, NaCl dolu stimülasyon pipeti aracılığıyla kısa (200 abd) kare voltaj darbesi sağlamak için sayısallaştırıcıya bağlı uyarıcıları kullanın. Bir dizi tepki genliğini çağrıştıracak şekilde stimülasyon gerilim kadranını ayarlayın.</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.

Doku sağlığını teşvik etmek ve spontan doğal ağ aktivitesinin ortaya çıkmasını desteklemek için tasarlanmış bu dilimleme protokolünde birkaç adım vardır: fare transkardiyel olarak soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile perfüzyona sahiptir; yatay-entorhinal korteks (HEC) dilimleri ara veya ventral hipokampustan 450 μm kalınlığında kesilir; dilimler ısıtılmış ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde iyileşir; kayıt sırasında dilimler ACSF ile 32 ° C'ye ısıtılır ve batık bir kayıt odasında çift yü...

Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.
Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,2,3,4,5'tesalınımlar olarak görülebilen vivo yüksek senkron nüfus aktivitesi oluşturur. Beyin dilimi yöntemleri, bu nöronal ağ salınımlarının altında kalan hücresel ve devre mekanizmaları hakkında fikir edinmek için yararlanmıştır. Maier ve ark.'ın temel çalışmaları, keskin dalga dalga komplekslerinin (SWR' ler) ventral hipokampus6,7dilimlerinde kendiliğinden ortaya çıkabileceğini göstermiştir. Birden fazla araştırmacının sonraki çalışmaları, hipokampus8,9,10'un ağ durumunu düzenlemede nöromodülatörlerin rolü ve daha önce in vivo11'deki davranış sırasında aktif olan nöronal toplulukların in vitro yeniden aktasyonlarını yönlendiren sinaptik mekanizmalar da dahil olmak üzere SWR'lerin birçok yönünü yavaş yavaş aydınlattı. Beyin dilimi deneyleri ayrıca gama aralığı salınımı (30-100 Hz), bellek kodlamasını desteklediğine ve12 , 13'ü geri çağırdığına inanılan ayrı bir hipokampal ağ durumu hakkında fikir sağlamıştır. Son olarak, hipokampüsün ve ilişkili yapıların temporal lob epilepsisinin patofizyolojisyolojislerindeki merkezi rolünü kabul eden14,15, araştırmacılar epileptiform aktivitenin neslini ve yayılmasını araştırmak için hipokampal dilim preparatlarını kullanmıştır. Carter ve arkadaşları, kronik epileptik hayvanlardan hazırlanan kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerinin kendiliğinden in vitro16'daepileptikform akıntılar oluşturabileceğini göstermiştir. Daha sonra Karlócai ve arkadaşları, hipokampal dilimlerde epileptiform deşarjların altında yatan mekanizmaları, değiştirilmiş iyon konsantrasyonlarına sahip modifiye yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mg2+ veya yükseltilmiş K+azaltılmış) veya eklenen ilaçlar (4AP veya gabazin)17kullanarak araştırdı.
Araştırmacılar anahtar şekillerde farklılık gösteren çok sayıda hipokampal dilim yaklaşımı geliştirmiştir: (1) dilimde bulunan hipokampüsün bölgesi (dorsal, orta veya ventral); (2) entorhinal korteks gibi ekstrahippocampal dokuların varlığı veya yokluğu; (3) dilimleri kesmek için kullanılan yönlendirme (koronal, sagittal, yatay veya eğik); ve (4) dilimlemeden sonra dokunun tutulduğu koşullar (ACSF'ye tamamen batırılmış veya ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde tutulur).
Hangi dilimleme yaklaşımının kullanılacağı deneysel amaç tarafından belirlenmelidir. Örneğin, sualtı koşullarında tutulan dorsal hipokampüsün enine veya koronal dilimleri intrahippocampal devre ve sinaptik plastisitenin araştırılması için çok etkili bir şekilde kullanılmıştır18,19,20. Bununla birlikte, bu tür preparatlar kendiliğinden ventral hipokampus 21,22,23'tendilimler kadar kolay ağ salınımları oluşturmaz. Kalıcı SWR aktivitesi durumu dorsal ve ventral hipokampus24'tenenine dilimlerde tetanik stimülasyon ile indüklenebilir, spontan SWR'ler ventral dilimlerde daha kolay gözlenir7,25.
Dorsal ve ventral hipokampus arasındaki doğal fizyolojik ve anatomik ayrım, hem in vivo hem de in vitro26yapılan çalışmalarla desteklenmektedir. Sıçanlardaki kayıtlar, sırt ve ara hipokampus boyunca güçlü bir şekilde tutarlı teta ritimleri ortaya çıkardı, ancak ventral bölge ile hipokampüsün geri kalanı arasında zayıf tutarlılık27. Vivo'daki SWR'ler sırt ve ara hipokampus arasında kolayca yayılırken, ventral hipokampustan kaynaklanan SWR'ler genellikle yerel kalır28. Sırt ve ara hipokampusta bulunan CA3 piramidal nöronlardan kaynaklanan ilişkisel projeksiyonlar, hipokampüsün boyuna ekseni boyunca uzun mesafeler yansıtır. Ventral bölgelerden kaynaklanan CA3 projeksiyonları nispeten yerel kalır ve bu nedenle dilimleme işlemi sırasında kopma olasılığı daha düşüktür29,30. Bu nedenle ventral dilimler, popülasyon senkron oluşturmak için gerekli yinelenen ağı daha iyi koruyabilir. Ventral dilimlerin in vitro spontan ağ aktiviteleri üretme eğilimi, daha dorsal bölgelere kıyasla piramidal nöronların daha yüksek içsel uyarılmazlığını veya ventral hipokampusta daha zayıf GABAerjik inhibisyonu yansıtabilir31. Gerçekten de, ventral hipokampal dilimler epileptiform aktiviteye daha duyarlıdır32,33. Bu nedenle, spontan fizyolojik8,9,11,24 veya patolojik16,34,35,36 ağ salınımlarının birçok çalışması geleneksel olarak yatay bir dilimleme yaklaşımı kullanmıştır, bazen fronto-oksipital yönde hafif bir açı ile, ventral hipokampus enine düzlemine paralel doku dilimleri verir.
Dilimdeki birçok hücre kesileceği için ağ bağlantısı, dilimleme yordamı tarafından kaçınılmaz olarak etkileniyor. Dilim ve hazırlıkta tutulan dokunun açısı ve kalınlığı, ilgi çekici devrelerdeki bağlantıyı optimize etmek için düşünülmelidir. Birçok çalışma, fizyolojik veya patolojik ağ salınımları bağlamında iki yapı arasındaki etkileşimleri araştırmak için yatay kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerini (HEC) kullanmıştır. Roth ve arkadaşları, SWR aktivitesinin HEC dilimi37aracılığıyla yayılmasını göstermek için hipokampüsün CA1 alt alanı ve medial entorhinal korteksin V katmanından çift kayıt gerçekleştirdi. Epileptiform aktivitenin birçok çalışması, epileptiform deşarjların corticohippocampal ağ 16,35 ,36,38üzerinden nasıl yayıldığını araştırmak için HEC dilim hazırlığını kullanmıştır. Bozulmamış corticohippocampal döngünün korunmasının spontan SWR'ler, epileptikform deşarjlar veya gama salınımları için bir ön koşul olmadığını belirtmek önemlidir; ağ salınımları, dorsal veya ventral hipokampüsün enine dilimlerinde, bağlı parahippocampal dokular21 , 22 , 23,25,39, 40,41ile üretilebilir. Hipokampal dilimlerdeki ağ salınımlarının spontan üretimi için daha önemli bir faktör, daha kalın bir dilim (400-550 μm) CA2 / CA3 tekrarlayan ağ21, 22 ,25'te daha fazla bağlantıyıkoruyacağından,her dilimin kalınlığı olabilir.
Açılı yatay HEC dilimleri (fronto-oksipital yönde yaklaşık 12 ° açı ile kesilmiş) corticohippocampal döngü11, 16,34,35,42fonksiyonel bağlantısını incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür açılı preparatlar spontan ağ aktivitesi için gerekli değildir43,44,45. Bununla birlikte, açılı bir dilimleme düzleminin kullanılması, araştırmacının aşağı veya yukarı doğru bir açı uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak, ventral veya ara hipokampüsün enine yönelimli lamelini en iyi şekilde koruyan dilimleri seçici olarak yapmasına izin verir (Şekil 1). Bu yaklaşım kavramsal olarak papatheodoropoulos ve ark., 2002 tarafından kullanılan benzerdir, kim her hipokampus ücretsiz parçaladı ve daha sonra tüm dorsal-ventral eksen boyunca enine dilimler oluşturmak için bir doku helikopteri kullandı21. Ventral ve dorsal-ara hipokampus arasındaki yukarıda belirtilen fonksiyonel ayrımlar ışığında, araştırmacılar deneyler tasarlarken veya sonuçları yorumlarken dilimlerin anatomik kökenini göz önünde bulundurmalıdır. Dilimleme işlemi sırasında bir agar rampası kullanmak, tercihen ara veya ventral hipokampustan dilimler üretmenin basit bir yoludur.
Hipokampal dilimler, batık bir bölmede (doku tamamen ACSF'ye batırılmış olarak) veya arayüz tarzı bir odada (örneğin, Oslo veya Haas odası, dilimler yalnızca ince bir akan ortam filmiyle kaplanmış olarak) muhafaza edilebilir. Arayüz bakımı, nöronal sağkalımını destekleyen ve yüksek düzeyde internöral aktiviteye izin veren dokunun oksijenlenmesini arttırır. Geleneksel olarak, batık kayıt koşulları, ağ düzeyinde salınımların istikrarlı bir şekilde ifade edilmesi için yeterli doku oksijenasyonu sağlamayan daha yavaş bir ACSF akış hızı kullanır. Batık hipokampal dilimlerde karbachol kaynaklı gama salınımları sadece geçici olarak46,47, gözlenirken, arayüz kayıt odalarında10, 48,49' da sıkıca tutulabilirler. Bu nedenle, karmaşık spontan aktivite in vitro ile ilgili birçok çalışma, keskin dalga dalgalanma kompleksleri 6 ,7, 8,9,10,25,37, gama salınımları 10 , 13 ve epileptiform aktivite16,38,45,47'yi araştırmak için arayüz kayıt odalarına güvendi.
Batık tarzdaki bir kayıt odasında, tek tek hücreleri görselleştirmek ve kayıtlar için sağlıklı görünen hücreleri seçici olarak hedeflemek için daldırma mikroskobu hedefi kullanılabilir. Batık preparat ayrıca hücresel milieu üzerinde ince kontrol sağlar, çünkü dalgıçlık ilaçların veya diğer bileşiklerin dokuya hızlı bir şekilde difüzyonunu kolaylaştırır. Bu nedenle, kararlı ağ salınımlarının batık koşullar altında sürdürüldüğü değiştirilmiş bir metodoloji güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Bu yaklaşım, hipokampal dilimlerin dokuya oksijen beslemesini artırmak için yüksek acsf (~ 6 mL / dk) akış hızına sahip değiştirilmiş bir sualtı kayıt odasına transfer etmeden önce birkaç saat boyunca basitleştirilmiş bir arayüz tarzı tutma odasında iyileştiği Hájosveark.'ınçalışmasıyla örneklenmiştir. Bu koşullar altında, yüksek düzeyde internöron aktivitesi ve kararlı spontan ağ salınımları su altında bir kayıt odasında tutulabilir. Bu değiştirilmiş yaklaşım, araştırmacıların görsel olarak yönlendirilmiş tam hücre yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmelerini ve morfolojik olarak tanımlanmış hücre tiplerinin karbachol kaynaklı gama salınımlarına katkısını karakterize etmelerini sağlar12. SWR'ler, ACSF11,48,49hızlı akış hızına sahip batık hipokampal dilimlerde de kendiliğinden oluşabilir. Maier ve arkadaşları, batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir arayüz odasında kurtarılan hipokampal dilimlerin güvenilir bir şekilde spontan SWR'ler sergilediğini, oysa batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir behere batırılmış olarak kurtarılan dilimlerin daha küçük uyarılmış alan tepkileri, daha düşük spontan sinaptik akım seviyeleri gösterdiğini ve sadece çok nadiren spontanSWR'lersergilediğini göstermiştir 43 . Schlingloff ve arkadaşları, parvalbumin ifade eden sepet hücrelerinin spontan SWR44'ünneslindeki rolünü göstermek için bu geliştirilmiş metodolojiyi kullandı.
Aşağıdaki protokol, yatay hipokampal dilimlerdeki kendiliğinden aktif nöronların arayüz koşullarında kurtarılabileceği ve daha sonra farmakolojik veya optogenetik manipülasyonlar ve görsel olarak yönlendirilmiş kayıtlar için uygun bir su altında kayıt odasında tutulabileceği bir dilimleme yöntemi ssunuyor.

<table><tbody><tr><td>3D yazıcı</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>Akut beyin dilimi kuluçka tutucu</td><td>NIH 3D Baskı Değişimi</td><td>3DPX-001623</td><td>ChiaMing Lee tarafından tasarlanmıştır, https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td></tr><tr><td>Adenozin 5&prime;-trifosfat magnezyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl öğütülmüş peletler</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Becton, Dickinson</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit</td><td>Alfa Aesar</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>beher (250 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>beher (400 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>blender</td><td>Oster</td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>Bonn makas, küçük</td><td>becton, Dickinson</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>filamentli borosilikat cam kılcal damarlar (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm, uzunluk 10 cm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Ateşle cilalanmış kılcal damarlar tercih edilir.</td></tr><tr><td>kalsiyum klorür çözeltisi (1 M)</td><td>G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>kamera</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>sıkıştırılmış karbojen gazı (%95 oksijen / %5 karbondioksit)</td><td>Airgas</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>basınçlı oksijen</td><td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>sabit voltaj izole stimülatör</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>lameller (22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td> Hassas veri toplama yazılımı <td>için ideal olarak fırçalama formunu kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir eşdeğer yazılım (örn. pClamp) işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Dell Precision T1500 Tower İş İstasyonu Masaüstü</td><td>Dell</td><td>N/A</td><td>Katalog numarası belirli bir bilgisayara bağlıdır - herhangi bir bilgisayar, elektrofizyoloji edinme yazılımını çalıştırabildiği sürece çalışacaktır.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>dijital zamanlayıcı</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4 kanallı İzlenebilir zamanlayıcı</td></tr><tr><td>tek kullanımlık emici pedler</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>disektör makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>çift kenarlı tıraş bıçağı</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>çift otomatik sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>çift yüzeyli veya laminer akışlı optimize edilmiş kayıt odası</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bu protokolde sunulan oda özel yapımdır. Ticari bir eşdeğeri, Warner Instruments'tan RC-27L olacaktır.</td></tr><tr><td>ekipman rafı</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70 "</td><td>Bir raf kesinlikle gerekli değildir, ancak elektrofizyolojiyi düzenlemek için kullanışlıdır</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetieter) - N, N, N ', N'-teetraasetik asit (EGTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>ince ölçekli</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204DR</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>cam petri kabı (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5 birinci sınıf; -trifosfat sodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>buz kovaları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>izofluran buharlaştırıcı</td><td>Genel Anestezik Hizmetleri</td><td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>lens kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>ışık kaynağı</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür çözeltisi (1 M)</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>manyetik karıştırma çubukları</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-56</td><td>Katalog numarası, karıştırma çubuğunun boyutuna bağlı olacaktır.</td></tr><tr><td>mikromanipülatör</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör (manuel)</td><td>Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>mikrospatula</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>monitör</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B Mikroelektrot Amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>MultiClamp 700B, baş kısımları, pipet tutucular ve bir model hücresi içermelidir.</td></tr><tr><td>N- (2-Hidroksietil) piperazin-N & prim; - (2-etansülfonik asit), (HEPES)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>iğne (20 gauge, 1.5 uzunluğunda)</td> <td>Becton, Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>naylon filament</td><td>YLI Wonder Görünmez İplik</td><td>212-15-004</td><td>boyut 0.004. Bu kedi. # Amazon.com</td></tr><tr><td>naylon ağdan</td><td>Warner Instruments Corporation</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>perstaltik pompa</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatin di(tris) tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>pipet tutucular</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>platin tel</td><td>Dünya Hassasiyeti</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>polilaktik asit (PLA) filament</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>potasyum glukonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>potasyum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>tıraş bıçağı</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>makaralı kelepçe</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>14041</td><td></td></tr><tr><td>ölçekli</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>neşter kolu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>dilim arp</td><td>Warner</td><td>SHD-26GH / 2</td><td></td></tr><tr><td>sodyum bikarbonat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat monobazik susuz</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>spatula</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>spatula/kaşık, büyük</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>steril neşter bıçakları</td><td>Tüy</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>karıştırıcı / sıcak plaka</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>musluk vanaları, 1</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>vana vanaları, 3</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>sakaroz</td><td>Acros Organics</td><td>AC177142500</td><td></td></tr><tr><td>döner kelepçeler için destek</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi makas, keskin/künt</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>şırınga (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>şırınga (Luer-Lok ucu ile 60 mL)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>üç uçlu kelepçe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>doku forsepsleri, büyük</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>doku forsepsleri, küçük</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>transfer pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>boru</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 inç, OD 3/16 inç</td></tr><tr><td>boru</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 inç, OD 1/4 inç</td></tr><tr><td>vakumlu gres</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>titreşimli bıçak mikrotomu</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>faraday kafesli titreşim sönümleme masası</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>hacimsel şişe (1 L)</td><td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>hacimsel şişe (2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>ılık su banyosu</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

spontan hipokampal ağ aktivitesini araştırmak için akut fare beyin dilimlemeyi

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Akut kemirgen beyin dilimlemesi, elektrofizyoloji, mikroskopi ve farmakoloji kullanarak tek hücreli çözünürlükle sinir devrelerinin organizasyonu ve işlevi hakkında fikir edinmek için çekişli deneysel bir yaklaşım sunar. Bununla birlikte, in vitro deneylerin tasarımında önemli bir husus, farklı dilim preparatlarının in vivo olarak gözlemlendiği gibi doğal sinirsel aktivite kalıplarını ne ölçüde yeniden özetlediğidir. Sağlam beyinde, hipokampal ağ, uyanık tüketici durumlar veya REM olmayan uyku sırasında meydana gelen keskin dalga dalgalanma komplekslerinin (SWR' ler) örneklediği gibi, hayvanın davranışsal durumunu yansıtan yüksek oranda senkronize popülasyon aktivitesi oluşturur. SWR'ler ve diğer ağ aktivitesi biçimleri, uygun koşullar altında izole hipokampal dilimlerde kendiliğinden ortaya çıkabilir. Hipokampal ağ aktivitesinin araştırılmasına güçlü beyin dilimi araç setini uygulamak için, doku sağlığını ve hipokampal ağ içindeki fonksiyonel bağlantının korunmasını optimize eden bir yaklaşım kullanmak gerekir. Fareler transkardiyal olarak soğuk sakkaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüzyona edilir. Hipokampus içeren yatay dilimler, sinaptik bağlantıyı korumak için 450 μm kalınlığında kesilir. Dilimler arabirim stili bir bölmede kurtarılır ve kayıtlar için batık bir odaya aktarılır. Kayıt odası, dilimin oksijenlenmesini iyileştirmek için yapay beyin omurilik sıvısının yüksek akış hızında çift yüzeyli süperfüzyonu için tasarlanmıştır. Bu protokol, karmaşık ve spontan ağ aktivitesinin in vitro araştırılmasına uygun sağlıklı doku sağlar.

Burada, bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Bir arayüz tutma odasında kurtarmadan sonra (Şekil 1C), dilimler tek tek su altında bir kayıt odasına aktarılır (Şekil 2B). Kayıt odası, peristaltik bir pompa kullanılarak karbojen doymuş ACSF ile birlikte verilir (Şekil 2A). Pompa ilk olarak ACSF'yi bir tutma kabından ısıtılmış bir hazneye çeker. Karbojen hatları, ortamın sürekli oks...

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Araştırmacılar bu protokolü kullanarak, akut fare beyin dilimi preparatlarında hipokampal ağ salınımlarının altında yatan mekanizmaları araştırabilirler. Bu hazırlıkta, kayıtlar, farmakolojik ve optogenetik tekniklerin uygulanmasına ve tek hücreli kayıtların görüntülenmesine olanak tanıyan, spontan ağ salınımları oluşturan dilimler halinde batık koşullar altında gerçekleştirilir. Transkardiyal perfüzyon için, fareyi izofluran odasından çıkarmadan hemen önce, bir Petri kabı kapağını üç ila beş milimetre soğutulmuş sükroz çözeltisi ile doldurun ve Petri kabının tabanını yaklaşık bir santimetre soğutulmuş sükroz çözeltisi ile doldurun.Anestezi uygulanmış fareyi hızlı bir şekilde sol emici pede aktarın ve ön ayakları ve kuyruğu sabitlemek için üç parça bant kullanın. Büyük doku forsepsleri ve cerrahi makas kullanarak cildi örtün ve sternumun altından göğsün üstüne kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Sternumu yukarı çekmek için forsepsleri kullanın ve diyaframı kesmek için makası kullanın.Ön ayağın vücutla buluştuğu noktaya doğru tek bir büyük hareketle her iki taraftaki göğüs kafesini kesmek için makası kullanın ve göğüs kafesinin ön tarafını başa doğru konumlandırmak için forsepsleri k

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

Bu video, hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaya odaklanarak, farelerden yatay hipokampal beyin dilimleri hazırlamak için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. İşlem, beynin dikkatlice ikiye bölünmesini ve sabitlenmesini, dilimleme için bir vibratom kullanılmasını ve karbojene bir sıvı ile optimal doku koşullarının korunmasını içerir, bu da daha fazla deney için hazır hipokampal beyin dilimleri ile sonuçlanır.

Yatay Fare Hipokampal Beyin Dilimlerinin Elde Edilmesi

Video, fare hipokampal-entorinal korteks dilimlerinde yerel alan potansiyelini (LFP) kaydetme prosedürünü gösterir. Hipokampusun CA3 stratum radiatumunda elektriksel stimülasyon sağlanır, bu da CA1 stratum pyramidale'deki postsinaptik potansiyelde değişikliklere neden olur. Yerel alan potansiyeli olarak adlandırılan CA1 nöronlarının membran potansiyelindeki birleşik değişim kaydedilir.

Fare Hipokampal-Entorinal Korteks Dilimlerinde Yerel Alan Potansiyelinin Kaydedilmesi

Biz nöronların CA1-CA3 dizi koruyan bir in vitro katlanmamış hipokampus geliştirdik. Nüfuz mikro elektrot dizisi ile birlikte, sinir aktivitesi hem uzunlamasına hem de enine yönlerde izlenebilir. Tüm hipokampta yayılma aynı anda kaydedilebilir Bu yöntem hippocampal slice preparatlarda fazla avantajlar sağlamaktadır.

Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Biz postitudinal hipokampal beyin dilimleri ve uzunlamasına konumlandırılmış kayıt ve stimülasyon elektrotlar in vivo hücre dışı postinaptik potansiyelleri uyandırmak ve göstermek için kullanılan kayıt ve stimülasyon elektrotlar uzunlamasına interlamellar CA1 boyunca uzun vadeli sinaptik plastisite.

Elektrofizyolojik Alan Kaydı ile Interlamellar Hipokampus CA1'de Uzun Süreli Sinaptik Plastisitenin Araştırılması

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Öğrenin fare beyin dilimleme yöntemiyle hipokampal ağ salınımlarını incelemeyi. Bu protokol spontan keskin dalga dalgalanması aktivitesini koruyarak elektrofizyolojik kayıtlar yapmanızı sağlar.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Daha fazla video keşfet