4 Boyutlu (x, y, z ve φ) Hiperspektral FRET Görüntüleme ve Analizi Kullanılarak Canlı Hücrelerde 3 Boyutlu cAMP Dağılımlarının Ölçümü

Bu protokol, FRET veya döngüsel AMP sinyallerini tek tek hücrelerde üç uzamsal boyutta ölçmek ve görselleştirmek için bir yöntem sağladığı için önemlidir. Döngüsel AMP dağılımları, yanal olarak değil, eksenel olarak da gerçekleşebilir ve bu dağılımları örneklemek için FRET döngüsel AMP görüntü verilerinin üç boyutta elde edilmesi önemlidir. Görüntüleme gününde, ılık Tyrodes bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar tampon oluşturur ve ilgilenilen transfekte edilmiş hücrelerle birlikte bir hücre odasına oturmuş bir örtü kızağı monte eder.

Sızıntıyı önlemek için haznenin üst kısmını bir montaj contası ile sabitleyin ve kapak sürgüsünün altındaki fazla ortamı veya yapışkan hücreleri çıkarmak için hassas bir görev sileceği kullanın. Hücre odasına 800 mikrolitre çalışma tamponu ve dört mikrolitre beş milimolar nükleer etiket ekleyin ve odayı beş ila 10 saniye boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra hücre odasını oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyon için alüminyum folyo ile örtün.

Hücreleri görüntülemek için, spektral detektör ile donatılmış bir konfokal mikroskopta 60X suya daldırma objektifini seçin ve objektife bir damla su ekleyin. Yüklenen hücre odasını mikroskop tablasına yerleştirin ve uygun filtre setini seçmek için filtre düğmesini ayarlayın. Floresan geniş alan modunu seçin ve FRET döngüsel AMP sensörünü ifade eden hücreleri içeren bir görüş alanı seçmek için göz merceklerini kullanın.

Görüntüleme yazılımını açın, konfokal modu seçin ve lazer kilitleme düğmesinin kilidini açın. A1 ayarlar menüsünü açın. 405 ve 561 nanometre lazer çizgilerine karşılık gelen kutuları işaretleyin ve bu spektral algılamaları SD, çözünürlüğü 10 ve kanalları 32 olarak ayarlayın.

Dalga boyu aralığını ayarlamak için başlangıç ve bitiş dalga boyu değerlerini seçin. Grup atlama simgesini seçmek için A1 Ayarlar menüsünü açın. 15 numara kutusunu seçin ve Tamam'a tıklayın. Lazer yoğunluklarını 405 nanometre lazer için yüzde sekize ve 561 nanometre lazer için yüzde ikiye ayarlayın.

Dedektör kazancını 149'a ve iğne deliği yarıçapını 2.4 Airy disk birimine ayarlayın. Tarama hızını saniyede 25 spektral kareye ayarlayın ve tek yönlü tarama yönünü seçin. Sayıyı dört ve tarama boyutunu 1024 x 1024 olarak ayarlayın.

z-stack alım parametrelerini tanımlamak için Görünüm, Alım Kontrolü ve ND Alımı'na tıklayın ve ND dosyasını kaydetmek için açılır pencereye dosya hedefini ve adını girin. Z serisi kutusunu tıklayın ve canlı bir görüntüleme penceresi açmak için A1 Plus Ayarlar penceresinde Canlı'yı tıklayın. Önizleme penceresine bakarken hücrelere odaklanmak için odak düğmesini ayarlayın.

Hücrenin üst kısmını seçmek için mikroskop üzerindeki odak düğmesini ayarlayın ve mevcut konumu en üst olarak ayarlamak için ND Edinme penceresinde Üst'e tıklayın. Hücrenin altını seçmek için mikroskop üzerindeki odak düğmesini ayarlayın ve mevcut konumu alt olarak ayarlamak için Alt'a tıklayın. Adım boyutu için bir mikrometre girin.

Z-tarama yönü için Top Bottom'u seçin ve bir z-yığını almak için çalıştır'a tıklayın. Z-yığını alımı tamamlandığında, hücreleri rahatsız etmeden ilgilenilen reaktifi hazneye nazikçe eklemek için bir pipet kullanın. 10 dakika sonra dosya adını değiştirin ve ikinci bir z-stack görüntüsü alın.

Görüntülemeden sonra, spektral z-yığını görüntüleriyle aynı dosya adlarına sahip yeni klasörler oluşturun ve ilgilenilen spektral görüntü dosyasını açın. File, Import/Export (Dosya), Import/Export (İçe/Dışa Aktarma) ve Export ND Document (ND Belgesini Dışa Aktar) seçeneklerini tıklatın. Açılır pencerede, yeni oluşturulan klasörü, dosya türü için TIFF'i, her kanal için Mono görüntüsünü seçin ve bit derinliğini koruyun.

Tek tek dosyaları klasöre aktarmak ve doğrusal spektral karıştırma yazılımını açmak için dışa aktar'a tıklayın. Doğrusal Karıştırmayı Açma'yı açın. m dosyasını açın ve Çalıştır'a tıklayın.

Dışa aktarılan TIFF dosya dizisini içeren klasörü bulup seçin ve dalga boyu ve z dilimi penceresini açmak için Tamam'a tıklayın. Klasörden z dilimi ve kanal numarası olmayan ilk dosyanın dosya adını kopyalayın ve Görüntü adını girin kutusunun ilk adımına yapıştırın, Dalga boyu bantlarının sayısını girin kutusuna kanal sayısını girin ve Z dilimlerinin sayısını girin kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından açılır pencerede, Dalga Boyuna göz atın ve seçin. mat dosyasını açın ve Aç'a tıklayın.

Kitaplığa göz atın ve seçin. mat dosyasını yeni açılır pencerede tıklatın ve dilim karıştırmayı başlatmak için tekrar Aç'a tıklayın. FRET verimliliğini hesaplamak için multiFRRCF'yi açın.

m programlama komut dosyasını açın ve Yeniden dilimlenecek kaç klasör varsa kutusuna analiz edilecek deneysel denemelerin sayısını girin. Tamam'a tıklayın. Karıştırılmamış klasörleri seçmek için göz atın ve yeniden Tamam'ı tıklatın. Yeni açılır pencerede, ölçeklendirme faktörünü 12,4'e, eşiği 56'ya, X, Y ve Z frekansını sırasıyla beş, beş ve bir ve yumuşatma algoritmasını Gauss olarak ayarlayın.

Ardından FRET ölçümlerini ve yeniden dilimlemeyi gerçekleştirmek için Çalıştır'a tıklayın. FRET verimliliğini döngüsel AMP seviyeleriyle eşleştirmek için Mapping_FRET açın. Efficiency_to_cAMP_concentration. m dosyasını açın ve Çalıştır'a tıklayın.

İlk gri tonlamalı FRET görüntüsüne gidip seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, döngüsel AMP sinyallerinin dağılımını üç boyutlu olarak incelemek için FRET döngüsel AMP görüntülerini açın. Bu görüntülerde, başlangıçta ve forskolin tedavisinden 10 dakika sonra konfokal mikroskopi kullanılarak elde edilen sahte renkli ham hiperspektral görüntü verilerinin üç boyutlu görünümleri gözlenebilir. Bu analizde, bir alıcı florofor tamamen foto tahrip edildi ve bire bir stokiyometri ile donör ve alıcının spektral imzalarının elde edilmesine izin verildi.

Boya floroforunun saf spektrumunu elde etmek için bir nükleer boya ile etiketlenmiş transfekte edilmemiş hücreler kullanıldı. Verici, alıcı ve nükleer boya floroforlarının spektrumlarının birleştirilmesi, üç bileşenli bir kütüphanenin oluşturulmasına izin verir. Burada, üç arka plan spektral imzasının kaynakları gözlemlenebilir.

Bu sinyaller numune içinde eşit olmayan bir şekilde dağıtılmasına ve basitçe çıkarılamamasına rağmen, bu sinyallerin spektral imzalarını spektral kütüphaneye eklemek ve sinyalleri ayırmak için doğrusal karıştırmayı kullanmak, bu kafa karıştırıcı sinyalleri FRET verimliliklerini hesaplamadan önce verici ve alıcı sinyallerden çıkarmak için bir yaklaşım sağlar. Altı bileşenli spektral kitaplık daha sonra eksenel görüntüdeki her dilim için doğrusal spektral karıştırma işlemi gerçekleştirmek için kullanılabilir. Burada, farklı XY düzlem dilimlerinde FRET verimliliği ve döngüsel AMP seviyelerindeki değişiklikler, forskolin tedavisinden 10 dakika sonra temel koşullar ile koşullar arasında bir karşılaştırma yapılmasına izin vererek gözlemlenebilir.

Bu teknik, hem hücrelerde hem de dokularda diğer raportörlerin FRET verimliliğini üç boyutta ölçmek için de kullanılabilir.