Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Yöntem, bakterilerin nano ölçekli çalışmalarına izin verir. Antimikrobiyal dirençteki kimyasal değişiklikler hakkında bize ayrıntılı bilgi sağlar. Bu nedenle, AMR ve ilaç geliştirme konusundaki anlayışımıza katkıda bulunabilir.

Bakterilerin nano ölçekli boyutu, kimyalarını araştırabilen mevcut araştırma araçlarını önemli ölçüde sınırlar. AFM-IR, hücre altı düzeyde bile tahribatsız, gözlemciden bağımsız bir şekilde yapmamıza izin verir. Yöntem, antimikrobiyal direnç hakkında bir fikir vererek, yeni antimikrobiyaller için moleküler hedeflerin belirlenmesine ve test edilmesine yardımcı olabilir.

Bakterilere ek olarak, AFM-IR bir dizi hücreyi, dokuyu ve hatta virüsü araştırabilir. AFM-IR görüntüleme için bir numune hazırlamak için, ilgilenilen bakterileri uygun kültür koşulları altında uygun ortamda büyüttükten sonra, bakterileri bir cam tüpe aktarılmak üzere kolonilerin üstünden dikkatlice almak için steril bir halka kullanın. Tüpe bir mililitre ultra saf su ekleyin ve toplanan bakteri peleti tüpün dibinde artık görünmeyene kadar bir ila iki dakika girdaplayın.

Hazırlanan çözelti ile McFarland standartları arasında görsel karşılaştırma yaparak çözeltinin kaba bulanıklığını tahmin edin. Bakteriyel süspansiyonun bulanıklığı çok düşük görünüyorsa, çözeltinin kaba bulanıklığı 0.5 ve 1 McFarland standartlarıyla karşılaştırılabilir olana kadar daha fazla bakteri eklemeye ve girdaba devam edin. Bakterileri santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı bir pipetle dikkatlice aspire edin.

Bakteri hücresi peletini girdap ile bir mililitre ultra saf suda yeniden süspanse edin ve bakterileri başka bir santrifüjleme ile çökeltin. Bakterileri az önce gösterildiği gibi üç defaya kadar yıkadıktan sonra, süpernatanı aspire edin ve deney substratına beş mikrolitre hücre eklemeden önce peleti en az iki dakika vorteksleyin. İstenen kalınlık tek tabakalı veya tek tek bakteri ise, biriktirdikten hemen sonra, alt tabakaya 20 ila 100 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve çözeltiyi bir pipet ucuyla hafifçe karıştırın.

Numune havayla kuruduğunda, alt tabakayı bir AFM metal numune diskine monte etmek için çift taraflı yapışkan bant kullanın. AFM-IR spektroskopi cihazını bir analize hazırlamak için, yazılımı ve lazeri açtıktan sonra Başlat'a basın ve lazer deklanşörünün açık konumda olduğunu onaylayın. Bu işlem sırasında, Aşama Başlatma penceresi açılacaktır.

Başlatma işlemi tamamlandığında, Başlat ve Tamam'a tıklayın. Mümkünse, cihazı nitrojenle temizlemek için nitrojen akışını açın ve sabit bir nem seviyesi elde etmek için nitrojen tahliyesini ayarlayın. Dikkatlice, ucu zarar vermeden numuneyi numune haznesine yerleştirin ve yazılımda Yükle'ye tıklayın. Örneği yüklemek için sihirbazı takip edin, her adımda uca ve örneğe odaklanın.

Ardından, etkileşime girmeden örneğe yaklaşmak için Yaklaşım'a tıklayın. Örneği eklemeden önce Araçlar, IR Arka Plan Kalibrasyonu ve Yeni'yi seçin. Açılır pencerede, analizin amacına göre çözünürlüğü ve spektral aralığı ayarlayın ve eş ortalamaları ve arka planları ortalama değerlere ayarlayın.

Etkinleştir'i seçin. Açılan pencerede, başlangıç ve bitiş parametrelerini ayarlayın ve Kabul Et ve Al'a tıklayın. Arka plan verileri alındığında Kaydet'i tıklatın.

İpucu örnekle ilişkilendirmek için Etkileşimde Bulun'u tıklayın. Sistem, doğrudan temas tespit edilene kadar numune yüzeyine yaklaşacaktır. Ucu ilgilenilen bir ölçüm noktasına taşımadan önce yüzeyi görselleştirmek üzere başlangıçta daha geniş alanlı, düşük uzamsal çözünürlüklü bir AFM görüntüsü almak için Tara'ya tıklayın.

Kızılötesi lazeri, numunenin emeceği bir dalga numarasına hizalamak için, numunenin emeceği dalga numarasını Dalga Numarası alanına girin ve Genliğe Karşı Frekans grafiğinde en az bir net tepe gözlemlenmesi IR.At Başlat'a tıklayın. Sapmaya Karşı Zaman grafiği periyodik bir dalga formu göstermelidir. Bantların konumlarını belirlemek üzere geleneksel bir kızılötesi bakteri spektrumu seçmek için Optimize Et'e tıklayın ve spektrumu, çeşitli spektral bölgelerden çeşitli dalga sayısı değerlerinde sıcak noktaları optimize etmek için kullanın.

Seçilen dalga sayısı değerleri için kızılötesi noktalar optimize edildiğinde, spektral çözünürlüğü ve aralığı ve eş ortalamaların sayısını tanımlayın ve AFM-IR spektrumunu toplamak için Al'a tıklayın. Seçilen bir dalga sayısı değeri için bir yoğunluk dağılımı görüntüsü toplamak için, tek bir AFM-IR spektrumu kaydettikten sonra, seçilen örnek alanının bir AFM görüntüsünü kaydedin ve AFM-IR görüntüleme için dalga sayısı değerlerini seçin. Lazerin IR noktasının seçilen dalga sayısı değerleri için optimize edildiğini onaylayın ve görüntü alanının X ve Y yönlerindeki veri noktalarının sayısını ayarlayın.

Genel penceresinde, lazer gücünü ayarlayın. AFM Scan (AFM Tarama) penceresinde, tarama hızını tanımlayın. Ardından IR Imaging Enable (IR Görüntülemeyi Etkinleştir) kutusunu işaretleyin ve görüntülemeye başlamak için Tara'ya tıklayın.

Seçilen dalga sayısındaki sinyalin yoğunluğunun AFM-IR'si, o alandan gelen AFM verileriyle eş zamanlı olarak toplanacaktır. Bu protokol, tek hücrelerden tek katmanlara ve çok katmanlara kadar bir substrat üzerinde bir dizi bakteri hücresi dağılımının elde edilmesini sağlar. Protokol, canlı bakterilerdeki dinamik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.

Örneğin, S.aureus hücre bölünmesi sırasında bir septum oluşumunda. Septumun AFM-IR spektrumu, hücre alanından toplanan AFM-IR spektrumlarına kıyasla 1, 240 ve 1.090 santimetrede daha yüksek nispi bant yoğunluğu ile karakterize edildi, bu da septumun hücre duvarı bileşenlerinin karbonhidrat ve fosfodiester gruplarından oluştuğunu düşündürdü. Protokol, direncin gelişmesinden kaynaklanan kimyasal bileşimdeki farklılıkları incelemek için de kullanılabilir.

Bu temsili analizde görüldüğü gibi, vankomisin aralıklı direnci ile vankomisine duyarlı S.aureus hücreleri arasında morfolojik bir fark ölçülmemiştir. Bununla birlikte, AFM-IR spektrumlarının ve bunların ikinci türevlerinin değerlendirilmesi, dirençli suştaki hücre duvarı bileşenlerinden karbonhidrat ve fosfodiester gruplarıyla ilişkili bantların nispi yoğunluğunda, duyarlı muadili ile karşılaştırıldığında net bir artış olduğunu ortaya koydu. Temiz bir numune hazırlamak önemlidir, bu nedenle ortam katkısını baştan azaltmaya ve birden fazla yıkamadan tamamen çıkarmaya özen gösterin.

AFM-IR tahribatsız bir teknik olduğundan, numune daha sonra kimyaları hakkında ücretsiz bilgi sağlayabilen boyama veya konfokal iyon spektroskopisi gibi diğer tekniklerle incelenebilir.