MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde
23 Şubat 2021
MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.
MS2 benzeşimlilik saflaştırma RNA dizilimi veya MAPS ile birleştiğinde bakterilere ilgi gösteren herhangi bir RNA'nın tüm hedef milyonlarını tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu teknoloji, düzenleme mekanizmasından bağımsız olarak her türlü sRNA ortaklarının tanımlanmasını mümkün kılar. SRNA'ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu, konak hücrelerdeki bakterilerin üretimini, biyofilm oluşumunu ve hayatta kalmasını daha iyi anlamaya yardımcı olacak ve sonuçta stafilokok enfeksiyonlarına karşı savaşacaktır.
Bu protokol herhangi bir patojenik veya patojenik olmayan gram pozitif bakteriye uygulanabilir. Prosedürü gösteren Noemie Mercier, Dr. Pascal Romby'nin laboratuvarından bir doktora öğrencisi. Başlamak için, üç mililitre BHI ortamında pCN51 P3 MS2 sRNA veya pCN51 P3 MS2 plazmidleri taşıyan bir suş kolonisi yetiştirin ve kopyalarda mikrolitre eritromisinin başına 10 mikrogram ile desteklenmiştir.
Her bir gece kültürünü 0,05'in 600'üne ulaşmak için eritromisinin takviye edildiği 50 mililitre taze BHI ortamında seyreltin. Kültürleri 37 santigrat derecede büyütün ve altı saat boyunca 180 RPM'de sallanın. Her kültürü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın, dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın veya peletleri buzda tutun ve doğrudan mekanik hücre lizisi yapın.
Mekanik hücre lizizini gerçekleştirmek için, beş mililitre tampon A'da peletleri yeniden depolar ve yeniden biriktirilen hücreleri 3,5 gram silika boncuklu 15 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri mekanik bir hücre liziz cihazına yerleştirin ve saniyede dört metrede 40 saniyelik bir döngü çalıştırın. Tüpleri 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, sonra süpernatantı kurtarın ve buzda tutun.
Süpernatantın açık olduğundan emin olun, değilse santrifüjü tekrarlayın. Sütun ucunu çıkarın, ardından bir sütun rafı içine bir kromatografi sütunu koyun ve sütunu ultra saf suyla yıkayın. 300 mikrolitre amiloz reçinesi ekleyin ve sütunu 10 mililitre tampon A.Seyreltin 1, 200 mbp-MS2 proteini ile altı mililitre tampon A'da yıkayın ve sütuna yükleyin.
Sütunu 10 mililitre arabellek A.Next ile yıkayın, MS2 benzeşim temizleme gerçekleştirin. Hücre lisatını sütuna yükleyin ve akış fraksiyonunu temiz bir toplama tüpünde toplayın. Sütunu 10 mililitre tampon A ile üç kez yıkayın ve yıkama fraksiyonunu toplayın, ardından sütunu bir mililitre tampon E ile elüte edin ve elution fraksiyonunu iki mililitrelik bir mikrotüpte toplayın.
Toplanan tüm fraksiyonları RNA çıkarma işlemine kadar buzda tutun. RNA ayıklama için her kesirden bir mililitre kullanın. RNA'ya bir hacim fenol ekleyin ve kuvvetlice karıştırın, ardından karışımı 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin.
Üst fazı temiz bir iki mililitre mikrotüpe aktarın. Bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin ve santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın, ardından üst fazı yeni bir tüpe aktarın. pH 5.2'de 2.5 cilt 100% soğuk etanol ve 0.1 hacim üç azı dişi sodyum asetat ekleyin ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökelti yapın.
Ertesi gün, tüpleri 16.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Etanol'ü bir pipetle yavaşça çıkarın, peletin rahatsız olmamasına dikkat edin. Beş dakika boyunca 500 mikrolitre % 80 soğuk etanol ve santrifüj ekleyin.
Etanol'ü yavaşça pipetle atarak atın, ardından peletin çalışma modunda beş dakika boyunca vakum konsantratörü kullanarak kurutun. Peletin uygun miktarda ultra saf suda yeniden süzün. Bu protokol S.aureus'taki RsaC targetome'u incelemek için kullanıldı.
MAPS teknolojisi kullanılarak RsaC ile doğrudan etkileşime giren birkaç mRNA tespit edildi ve oksidatif stres ve metalle ilgili yanıtlardaki önemli rolünü ortaya koydu. MS2 sRNA yapılarını doğrulamak ve ifade kalıplarını görselleştirmek için, hücreler BHI ortamında iki, dört ve altı saatlik büyümeden sonra hasat edildi. RNA çıkarıldı ve RsaC'ye özgü DIG probu kullanılarak Kuzey leke analizi yapıldı.
Endojen RsaC seviyesi altı saatlik büyümeden sonra önemli ölçüde artmıştır. Daha da önemlisi, MS2-RsaC 544 ve MS2-RsaC 1, 116 seviyesi altı saatte endojen RsaC ile karşılaştırılabilirdi. Benzeşim saflaştırması yapıldı ve RNA'lar, sadece MS2 etiketini ve MS2-RsaC 544 yapısını ifade eden mutant RsaC suşunu ifade eden vahşi tip suştaki ham özüt, akış ve elution fraksiyonlarından çıkarıldı.
1, 116 nükleotid uzun endojen RsaC, elütion fraksiyonunda zenginleştirilmiştir, ancak uzunluğu ve karmaşık ikincil yapısı nedeniyle özellikle benzeşim sütunu ile etkileşime girdi. MS2-RsaC 544, elüsyon fraksiyonunda yüksek oranda zenginleştirilmiş ve MS2-MBP füzyon proteini tarafından başarıyla korunduğunu göstermiştir. Biyoinformatik bir analiz, MS2 sRNA ve MS2 kontrolü arasındaki kat değişimine göre putatif mRNA hedeflerini ortaya koydu ve bu da sodA'nın ilk putatif hedef olduğunu gösterdi.
Ms2 benzeşim saflaştırması, SODA'nın MS2 kontrolüne kıyasla MS2-RsaC 544 ile verimli bir şekilde birlikte zenginleştiğini gösterdikten sonra Kuzey blot analizi SODA'ya özgü DIG probu gerçekleştirdi. Bu protokolü denerken, MS2 etiketinin eklenmesinin sRNA onayını, kararlılığını veya işlevini etkileyebileceğini unutmayın. Bu dikkatle izlenmelidir.
MAPS, sRNA-RNA hedefleri eşleştirmesinin anlık görüntüsünü sağlar. Daha fazla deneysel doğrulama işlevlerini çözecektir. Bu teknik, herhangi bir bakteride sRNA düzenleyici ağlar oluşturmak için güçlü bir aracı temsil eder.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
MAPS teknolojisi, özellikle Gram-pozitif bakterilerde, spesifik düzenleyici RNA'ların in vivo hedefomunun belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, RNA ortaklarını birlikte saflaştırmak ve tanımlamak için MS2-afinite saflaştırması ve RNA dizileme kullanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Mikrobiyoloji
- RNA Biyolojisi
Arka Plan
- sRNA bağımlı düzenleyici ağların anlaşılması, bakteriyel davranışların incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- RNA partnerlerinin belirlenmesi, virülans faktörleri ve biyofilm oluşumu hakkında bilgi sağlayabilir.
- MAPS teknolojisi, sRNA partnerlerinin bağımsız olarak tanımlanmasına olanak tanır.
- Bu protokol, hem patojenik hem de patojenik olmayan Gram-pozitif bakteriler için uygulanabilirdir.
Çalışmanın Amacı
- Bakterilerde sRNA bağımlı düzenleyici ağları karakterize etmek.
- Bakterilerin konak hücreler içindeki hayatta kalma mekanizmalarına dair anlayışı geliştirmek.
- Stafilokokal enfeksiyonlara karşı stratejiler geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- RNA dizileme ile eşleştirilmiş MS2-afinite saflaştırması.
- Bakteriyel suşların eritromisin içeren BHI besiyerinde büyütülmesi.
- Analiz için sRNA ve partnerlerinin birlikte saflaştırılması.
- Dizileme teknikleri aracılığıyla RNA partnerlerinin tanımlanması.
Ana Sonuçlar
- Gram-pozitif bakterilerde sRNA partnerlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Virülans ve sağkalımı etkileyen düzenleyici ağlar hakkında bilgiler.
- Protokolün, Dr. Pascal Romby'nin laboratuvarından bir doktora öğrencisi tarafından gösterimi.
- Bakteriyel enfeksiyonlarla mücadealedeki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- MAPS teknolojisi, RNA etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- sRNA ağlarını anlamak, daha iyi terapötik stratejilerin geliştirilmesini sağlayabilir.
- Bu yöntem, çeşitli bakteri türlerine uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
MAPS teknolojisi, Gram-pozitif patojenlerde küçük düzenleyici RNA'ların kapsamlı targetome haritalamasını sağlayarak antimikrobiyal keşiflerde hedef doğrulamasını destekler. Virülansı ve hayatta kalmayı etkileyen sRNA-mRNA etkileşimlerini ortaya çıkararak, erken aşama antibakteriyel programlar için mekanistik risk azaltma sağlar. Bu yaklaşım, terapötik müdahale için sRNA hedeflerinin önceliklendirilmesinde öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gram-pozitif bakterilerdeki terapötik hipotezleri netleştirmek için sRNA bağımlı düzenleyici ağların sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Biyolojik risk azaltma ve fonksiyonel hedef doğrulamayı desteklemek için sRNA hedefomlarının anlık görüntüsünü sağlar.
- Bilimsel Değer: sRNA aktivitesini oksidatif stres ve metal yanıt yollarıyla ilişkilendirerek sodA gibi olası mRNA hedeflerini tanımlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir hedef tanımlamasını sağlamak için birlikte saflaştırılmış fraksiyonlardan kantitatif RNA sekanslama çıktıları üretir.
- Operasyonel Değer: Amiloz reçinesi üzerindeki MS2-MBP füzyonu yoluyla yakalamayı standartlaştırarak, Gram-pozitif suşlar genelinde analiz ölçeklenebilirliğini destekler.
- Bilimsel Değer: Spesifik RNA etkileşimlerini spesifik olmayanlardan ayırt etmek için zenginleştirme metrikleri (örneğin, elüsyon fraksiyonu) sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: sRNA regulonlarını, Staphylococcus aureus'daki virülans faktörü üretimi ve biyofilm oluşumu gibi fenotipik çıktılarla ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: sRNA aktivitesini enfeksiyonla ilgili stres yanıt yollarıyla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Bilimsel Değer: Northern blot gibi ortogonal yöntemlerle sRNA hedeflerini doğrulayarak riskle uyumlu ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
MAPS, özellikle RNA tabanlı regülasyonu hedefleyen antibakteriyel programlar için, hedef belirlemeden öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Tanımlanmış büyüme koşulları altında in vivo RNA etkileşim ağlarını haritalayarak sRNA fonksiyonunun hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Sekanslama ile uyumlu standartlaştırılmış lizis, afinite yakalama ve RNA ekstraksiyon iş akışları aracılığıyla analiz hazırlığına imkan tanır.
- Analitikler: Takip çalışmaları için yüksek güvenilirlikli hedefleri önceliklendirmek amacıyla MS2-sRNA ve kontrol fraksiyonları arasındaki kat sayı değişim ölçümlerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: sRNA hedefomlarını konakçı sağkalım mekanizmalarıyla ilişlendirerek anti-infektif stratejilerin preklinik validasyonuna bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Patojenik ve patojenik olmayan Gram-pozitif türler genelinde sRNA hedefom profillemesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: sRNA hedef belirlemede öngörülebilir güven, transkripsiyon sonrası düzenlemedeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Bakteriyel lizatlarda RNA-protein etkileşimi yakalamanın standartlaştırılması, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Antimikrobiyal hedef seçiminde daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Zenginleştirme verileri ve fenotipik korelasyona dayalı olarak sRNA hedeflerinin risk ayarlı önceliklendirmesi.
Uygulama Hususları
- Moleküler klonlama, bakteriyel kültür ve RNA işlemleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mekanik lizis altyapısı, kromatografi sistemleri ve RNA dizileme yetenekleri gereklidir.
- Konstrükt tasarımı (örneğin MS2-sRNA füzyonları) ve ekspresyon doğrulaması için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Çeşitli Gram-pozitif modellere uygulandığında, sRNA stabilitesi ve ikincil yapı için adaptasyon değerlendirmeleri gereklidir.
- Pratik sınırlama: Potansiyel non-spesifik etkileşimler nedeniyle, olası hedeflerin özgünlüğünü onaylamak için ortogonal doğrulama (örneğin Northern blot) gereklidir.
