Name: MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin MAPS teknolojisiyle gram-pozitif bakterilerde sRNA düzenleyici ağlarını karakterize etme yöntemini. MS2-benzeşim saflaştırma ve RNA dizileme kullanılarak RNA ortakları belirlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH ve ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, PR) tarafından desteklendi. Ayrıca labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 ve ANR-17-EURE- 0023 (PR) çerçevesinde, gelecekteki program için yapılan yatırımların bir parçası olarak ANR tarafından yönetilen devletten fon olarak yayınlanmıştır. DL, 753137-SaRNAReg sayılı Marie Skłodowska-Curie Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklendi. E. Massé Lab'deki çalışmalar, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH Ekibi Grant R01 GM092830-06A1'den verilen hibelerle desteklenmiştir.

1. Tamponlar ve ortamlar
<ol><li>MAPS denemeleri için aşağıdaki arabellekleri ve ortamları hazırlayın: - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 ve 1 mM DTT) - Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltoz, %0,1 Triton, 1 mM MgCl2 ve 1 mM DTT) - RNA yükleme tamponu (8 M ürede %0,025 ksilen siyanol ve %0,025 bromofenol mavisi) - Beyin Kalbi İnfüzyonu (BHI) ortamı (12,5 g baldır beyni, 10 g pepton, 5 g sığır kalbi, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 ve 1 L için 2 glikoz) - Lysogeny Et Suyu (LB) ortamı (10 g pepton, 5 g maya özü ve 1 L için 10 g NaCl)</li>
	<li>Kuzey blot tahlilleri için aşağıdaki arabellekleri hazırlayın: - Blokaj çözeltisi (1x maleik asit ve% 1 bloke reaktif) - Hibridizasyon çözeltisi (P formamid, 5x SSC, %7 SDS, %1 bloke çözeltisi ve %0,2 N-lauryl sarkozin, 50 mM sodyum fosfat). Çözünecek ajitasyon ile ısıtın. DİkKAT: Her ürünle ilgili güvenlik önlemlerine dikkat edin. - 1 M sodyum fosfat (58 mM sodyum fosfat dibasik ve 42 mM sodyum fosfat monobasik) - Salin, sodyum sitrat (SSC) tampon, 20x konsantre (3 M NaCl ve 300 mM trisyot sitrat)</li>
</ol>2. Güvenlik sorunları 
<ol><li>Seviye 2 muhafaza laboratuvarında uygulanabilir patojenik bakterileri içeren tüm adımları uygulayın. NOT: Lizizden sonra dışarıya sadece hücre özleri alınabilir (adım 5).</li>
	<li>Laboratuvar önlüğü ve eldiven giy.</li>
	<li>Bileklerin kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Biyolojik güvenlik kabinini (Sınıf II) bir dezenfektan çözeltisi ile temizleyin.</li>
	<li>Bakterilere maruz kalan katı atıkları uygun biyomedikal depo gözüne atın.</li>
	<li>Kontamine sıvı içeren şişeleri bir dezenfektan çözeltisi ile tedavi edin. Sonra, bir lavaboya atın.</li>
	<li>Ellerinizi ve bileklerinizi sabunla dikkatlice yıkayın ve seviye 2 muhafaza laboratuvarından ayrılmadan önce laboratuvar önlüğü çıkarın.</li>
</ol>3. Plazmid yapımı 
NOT: Klonlama amacıyla, öncelikle endojen sRNA'nın sınırlarını belirlemek çok önemlidir. pCN51-P3 ve pCN51-P3-MS2 plazmidleri Tomasini ve ark. P3 promotörü, sRNA'nın hücre yoğunluğuna bağlı bir şekilde yüksek şekilde ifadesini sağlar (yani, bakteriler büyümenin sabit aşamasına girdiğinde). Bu büyüme aşamasında birçok stafilokok sRNA'sı birikir.
<ol><li>Yüksek kaliteli bir DNA polimeraz ve bir PCR makinesi kullanarak sRNA dizisini PCR ile güçlendirin. Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin ve daha fazla bilgi için Garibyan ve Avashia (2013)31'i okuyun.</li>
	<li>Belirli astarları tasarlamak için aşağıdaki şablonları kullanın: <img alt="Equation 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61731/text12.png"> ve ileri ve ters astarlar için sırasıyla 5'-CGCGGATCC(N)-3'. NOT: Bu oligonükleotidler, MS2 sırasını (kalın olarak) ilgi çekici sRNA'nın 5' ucuna birleştirmeyi sağlar. Pst I ve BamHI kısıtlama siteleri (altı çizili) amfiloni pCN51-P3 plazmid27'yeklonlamak için MS2-sRNA yapının 5' ve 3' ekstremitelerinde eklenir. (N) gene özgü diziye (15-20 nükleotit) karşılık gelir.</li>
	<li>Üreticinin önerilerine göre uygun tamponda 2 U Pst I ve 1 U BamHI ile MS2-sRNA PCR ürününün 1 μg pCN51-P3 plazmidini ve 1 μg'sını sindirin. </li>
	<li>37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın ve PCR saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sindirilen pCN51-P3 plazmid (300 ng) ve MS2-sRNA amplicon'u (vektör için molar oran:insert = 1:3) 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın. Ligasyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için Revie ve ark. (1988)32'ye bakın. Her tüpe 1 μL Ligase Tamponu ve 10 U T4 Ligase ekleyin. Ultra saf su ile hacmi 10 μL'ye ayarlayın.</li>
	<li>En az 2 saat boyunca 22 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Donmuş DH5α kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine 50 μL ligasyon karışımı ekleyin. Plazmid dönüşümü ve kimyasal olarak yetkin hücreler hakkında daha fazla bilgi edinmekiçin Seidman ve ark.</li>
	<li>Buzda 30 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Isı bloğu veya su banyosu kullanarak dönüşüm tüpünün ısı şoku (42 °C'de 45 sn).</li>
	<li>900 μL LB orta ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ampisilin (100 μg/μL) ile desteklenmiş bir LB agar plakasındaki bakteriyel süspansiyonun plakası 100 μL. NOT: pCN51-P3 vektörü, yalnızca pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini taşıyan E. coli klonlarını seçmeyi sağlayan bir ampisilin direnç genini kodlar.</li>
	<li>Bir plazmid DNA miniprep kiti kullanarak ampisilin (100 μg/μL) varlığında yetişen bir gecede bakteri kültüründen (5 mL) pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sanger'ın34'ü sıralayarak aşağıdaki astar olan 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3' ile yapıyı doğrulayın.</li>
	<li>pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini DC10B kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. 3.7 ile 3.11 arasında olan adımları yineleyin.</li>
	<li>pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini çıkarın (bkz. adım 3.12) ve 1-5 μg plazmid DNA'yı bir elektroporasyon aparatı kullanarak HG001 ΔsRNA elektro-uyumlu S. aureus hücrelerine dönüştürün. Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin. Grosser ve Richardson (2016)35'i okuyarak elektro-rekabetçi S. aureushazırlama yöntemleri hakkında daha fazla bilgiedinin. DİkKAT: Bu adım patojenik bakterilerin işlenmesini içerir (bkz. adım 2).
</li>
	<li>900 μL BHI orta ekleyin ve 3 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Santrifüj 1 dakika 16.000 x g. Üstnatant atın.</li>
	<li>Peletin 100 μL BHI'de yeniden süzülür ve eritromisin (10 μg/μL) ile desteklenmiş BHI agar plakalarındaki bakteri süspansiyonu plakalayın. NOT: pCN51-P3 vektörü ayrıca, yalnızca pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini taşıyan S. aureus klonlarını seçmeyi sağlayan bir eritromisinin direnç genini kodlar.</li>
</ol>4. Bakteri hasadı
DİkKAT: Bu adım patojenik bakterilerin işlenmesini içerir (bkz. adım 2).
<ol><li>PCN51-P3-MS2-sRNA veya pCN51-P3-MS227 plazmidlerini taşıyan bir suş kolonisini, mükerrer olarak eritromisinin (10 μg/μL) takviyeli 3 mL BHI ortamında büyütün.</li>
	<li>Her bir gece kültürünü 50 mL (≈1/100) taze BHI ortamında seyreltin ve 0,05'lik bir OD600nm'ye ulaşmak için eritromisinin (10 μg/μL) takviyesini yaptırın. 250 mL sterilize şişe kullanın (5:1 şişe-orta oranı). NOT: Orta ve büyüme koşulları çalışılan sRNA'nın ifade modeline göre ayarlanmalıdır.</li>
	<li>37 °C'de kültürleri 6 saat boyunca 180 rpm'de sallayarak büyütün.</li>
	<li>Her kültürü 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>4 °C'de 15 dakika boyunca 2.900 x g'da santrifüj. Üstnatant atın.</li>
	<li>Peletleri buzda tutun ve doğrudan mekanik hücre lizisi (adım 5) yapın veya peletleri -80 °C'de dondurup saklayın.</li>
</ol>5. Mekanik hücre lizisi 
DİkKAT: Aşağıdaki adımlar buz üzerinde yapılmalı ve tamponlar 4 °C'de olmalıdır. Eldiven kullanın ve örnekleri RNases'ten korumak için tüm önlemleri alın.
<ol><li>5 mL Tampon A'da peletleri (adım 4,6) yeniden dirsintir.</li>
	<li>Yeniden depolanan hücreleri 3,5 g silika boncuk (0,1 mm) ile 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Tüpleri mekanik hücre liziz cihazına yerleştirin(bkz. Malzeme Tablosu). 40 sn'lik bir döngüyü 4,0 m/s'de çalıştırın. NOT: Hücreleri kırmak için bir döngü yeterli değilse, numuneleri buzda tutarken cihazın 5 dakika soğumasını bekleyin. Ardından, 40 sn'lik bir döngüyü 4.0 m/ s'de tekrarlayın. Hücre lizizinin verimliliği, üst tabak BHI-agar plakasına kaplanarak test edilebilir.</li>
	<li>15 dakika boyunca 15.700 x g'da santrifüj. Üst saltantayı kurtarın ve buzda tutun.</li>
</ol>6. Sütun hazırlama
DİkKAT: Amiloz reçinesinin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Gerekirse, sütunu bir uç kapakla kapatın. Benzeşim saflaştırmasına başlamadan önce tüm çözümleri hazırlayın.
<ol><li>Sütun rafı içine kromatografi sütunu koyun (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sütun ucunu çıkarın ve kolonu ultra saf suyla yıkayın.</li>
	<li>300 μL amiloz reçinesi ekleyin.</li>
	<li>Sütunu 10 mL Tampon A ile yıkayın.</li>
	<li>1.200 pmol MBP-MS2 proteinini 6 mL Tampon A'da seyreltin ve sütuna yükleyin.</li>
	<li>Sütunu 10 mL Tampon A ile yıkayın.</li>
</ol>7. MS2 benzeşim saflaştırması (Şekil 1)
<ol><li>Hücre lisatını sütuna yükleyin. NOT: Toplam RNA 'yı (adım 8) çıkarmak ve Kuzey lekesi (adım 9) ve transkriptomik (adım 10) analizini yapmak için hücre lisatının 1 mL'lik kısmını (Ham özü, CE) tutun.</li>
	<li>Akış fraksiyonunu (FT) temiz bir toplama tüpünde toplayın.</li>
	<li>Sütunu 10 mL Tampon A ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Sütunu 1 mL Tampon E ile yağlayın ve elution fraksiyonunu (E) 2 mL mikrotüpte toplayın.</li>
	<li>Toplanan tüm fraksiyonları RNA ekstraksiyonu (adım 8) kadar buzda tutun veya daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de dondurun.</li>
</ol>8. Toplanan fraksiyonların RNA ekstraksiyonu (CE, FT, W ve E)
<ol><li>RNA ekstraksiyonu için her kesirden 1 mL (FT ve W dahil) kullanın.</li>
	<li>1 hacim fenol ekleyin. Kuvvetlice karıştırın. DİkKAT: Fenol uçucu ve aşındırıcıdır, dikkat edin ve duman kaputunun altında güvenli bir şekilde çalışın.</li>
	<li>20 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Üst fazı temiz bir 2 mL mikrotüple aktarın.</li>
	<li>1 hacim kloroform/izoamil alkol (24:1) ekleyin ve 8,3 ila 8,4 adımlarını tekrarlayın. DİkKAT: Duman kaputunun altında güvenle çalışın.</li>
	<li>2,5 hacim soğuk etanol% 100 ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (NaOAc) pH 5,2 ekleyin.</li>
	<li>-20 °C'de gece çökelt. NOT: Yağış, etanol/kuru buz banyosunda 20 dakika veya -80 °C'de 2 saat boyunca da yapılabilir.</li>
	<li>4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmemeye dikkat ederken bir pipetle etanol'u yavaşça çıkarın. DİkKAT: RNA peleti her zaman görünmez ve bazen etanol varlığında gevşektir.</li>
	<li>500 μL% 80 soğuk etanol ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Etanol yavaşça pipetleme ile atın. Peletin vakum konsantratör kullanarak kurulayın, çalışma modunda 5 dk.</li>
	<li>Peletin uygun hacimde (15-50 μL) ultra saf suda yeniden sulansın. Peletin daha sonra kullanılmak üzere -20 °C'de dondurulması.</li>
	<li>Spektrofotometre/florometre kullanarak RNA miktarını (260 nm) ve kaliteyi (260/280 ve 260/230 dalga boyu oranları) değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin. NOT: 3-4 μg genellikle elüsyon fraksiyonunda (E) elde edilir. Bu esas olarak test edilen koşullara bağlıdır.</li>
</ol>9. Ms2 benzeşim saflaştırmasının Kuzey blot36 ile analizi
<ol><li>10 μL ultra saf suda 5 μg RNA CE, FT, W fraksiyonları ve 500 ng E fraksiyonunu seyreltin ve 10 μL RNA yükleme tamponu ile karıştırın.</li>
	<li>90 °C'de 3 dk kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Numuneleri 20 mM guanidiyum tiyosiyanat ile desteklenmiş% 1 agarose jel kuyusuna yükleyin ve jeli 4 °C'de TBE 1x tamponda 100-150 V'da çalıştırın. Daha fazla bilgi için Koontz (2013)37'ye bakın.</li>
	<li>RNA'ları bir nitroselüloz membran üzerinde vakum transferi ile 1 saat veya bir gecede kapillarite transferi için aktarın. NOT: Kapillarite yöntemi büyük RNA'lar için daha etkilidir.</li>
	<li>Membrandaki UV çapraz bağlantı RNA'ları (254 nm'de 120 mJ) ultraviyole çapraz bağlantı kullanarak.</li>
	<li>Membranı, RNA tarafı yukarı bakacak şekilde bir melezleme şişesi içine yerleştirin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış 10-20 mL hibridizasyon çözümü ekleyin. 68 °C'de 30 dk kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözeltiyi atın ve sRNA'ya özgü probun 1 μL'si ile desteklenmiş 10-20 mL taze hibridizasyon çözeltisi ekleyin. 68 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın. NOT: DIG etiketli RNA probu, DIG RNA etiketleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergelerine uyularak sentezlenmiştir. Alternatif olarak, radyolabelled prob kullanılabilir.</li>
	<li>Membranı 10-20 mL yıkama çözeltisi 1 (2x SSC ve% 0.1 SDS) ile 20 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Membranı 68 °C'de 15 dakika boyunca 10-20 mL yıkama çözeltisi 2 (0,2x SSC ve% 0,1 SDS) ile yıkayın. Bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>20 °C'de en az 30 dakika boyunca 10-20 mL blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Çözeltiyi atın ve alkali fosfataz için konjuge edilmiş poliklonal anti-digoksigenin antikoru (1/1000) ile desteklenmiş blokaj çözeltisinin 10-20 mL'lik kısmını ekleyin. 20 °C'de 30 dk kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Membranı 10-20 mL yıkama çözeltisi 3 (1x maleik asit ve% 0.3 Ara 20) ile 20 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın. Bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Membranı algılama çözeltisinin 10-20 mL'si (0,1 M Tris HCl ve 0,1 M NaCl pH 9,5) ile 20 °C'de 5 dk ile kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Membranı plastik bir filme koyun ve substratla ıslatın (bkz. Malzeme Tablosu). Karanlıkta 5 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Zarı plastik bir filme kapatın. Zarı otoradyografi kasetine koy.</li>
	<li>Membranı özel karanlık odada bir otoradyografi filmine maruz bırak. NOT: Sergi süresi, birkaç saniyeden dakikaya kadar sinyal gücüne bağlıdır.</li>
	<li>Açığa çıkan filmi otomatik olarak gelişen bir cihazda ortaya çıkarmak.</li>
</ol>10. Numunelerin RNA dizilimi için hazırlanması 
NOT: Bu adım yalnızca E ve CE kesirlerinden çıkarılan RNA'larla ilgilidir.
<ol><li>Her numuneye 10 μL 10x DNase tamponu ve DNase I (1 U/μg işlenmiş RNA) ekleyin. 100 μL'lik son hacim için su ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>RNA'ları daha önce açıklandığı gibi ayıklayın ve arındıryın (adım 8.2 ila 8.11).</li>
	<li>RNA peletini 20 μL ultra saf suda yeniden hissedi. NOT: Kalan DNA'nın varlığı PCR ve spesifik astarlar (örneğin, 16S geni) kullanılarak kontrol edilebilir.</li>
	<li>Mikroakışkan bazlı elektroforez analiz sistemi kullanarak RNA miktarını ve kalitesini değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: 1 μg genellikle DNase tedavisinden sonra elüasyon fraksiyonunda (E) elde edilir.</li>
	<li>Ribozomal RNA'ları bakteriyel bir rRNA tükenme kiti ile çıkarın. NOT: Büyük ve bol miktarda RNA (yani rRNA'lar) benzeşim sütunuyla özel olarak etkileşime girme eğilimindedir. Bu adımı gerçekleştirmek için 500 ng çıkarılmış RNA gereklidir.</li>
	<li>Yine mikroakışkan bazlı elektroforez analiz sistemi kullanarak RNA miktarını ve kalitesini değerlendirin.</li>
	<li>CDNA kütüphane hazırlık kiti kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek 10-20 ng ribodepleted RNA ile cDNA kütüphaneleri hazırlayın.</li>
	<li>Elde edilen kitaplıkları bir sıralama aleti kullanarak sıralayın (örneğin, tek uçlu, 150 bp; bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Örnek başına 5-10 milyon okuma genellikle yeterlidir.</li>
</ol>11. RNAseq veri analizi (Şekil 2)
<ol><li>FastQ sıralama dosyalarını sıralama platformundan indirin.</li>
	<li>Roscoff biyolojik istasyonunun(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)Galaxy örneğine erişim ve giriş yapın. NOT: Bahsedilen her algoritma arama çubuğu kullanılarak kolayca bulunabilir. Her araç için bir kullanım kılavuzu sağlanır. DİkKAT: Gerekli araçların sürümü genel Galaxy server38.</li>
	<li>Veri Al simgesine tıklayın ve ardından Bilgisayarınızdan Dosya Yükle 'yetıklayın. Her MS2 denetiminin ve MS2-sRNA örneklerinin FastQ sıralama dosyasını karşıya yükleyin. Ayrıca FASTA referans genom dosyasını ve GFF ek açıklama dosyasını yükleyin.</li>
	<li>FastQC Okuma Kalitesi raporlarını çalıştırın (Galaxy Sürüm 0.69). NOT: Bu araç ham dizilerin kalite değerlendirmesini sağlar (örneğin, kalite puanı, adaptör dizilerinin varlığı).</li>
	<li>Adaptör dizilerini ve düşük kaliteli okumaları önemli ölçüde kaldırmak için Trimmomatic esnek okuma kırpma aracını (Galaxy Sürüm 0.36.6) çalıştırın. Kitaplık hazırlama için kullanılan bağdaştırıcı sıralarını belirtin (örneğin, TruSeq 3, tek uçlu). Aşağıdaki Trimmomatic işlemlerini ekleyin: SLIDINGWINDOW (Baz sayısı=4; Ortalama kalite=20) ve MINLEN (En az okuma uzunluğu=20).</li>
	<li>FastQC Okuma Kalitesi raporlarını (Galaxy Sürüm 0.69) tekrar çalıştırın.</li>
	<li>Bowtie2'yi çalıştırın - harita referans genoma karşı okur (Galaxy Sürüm 2.3.2.2). Varsayılan ayarlarla (çok hassas yerel) okumaları eşlemek için geçmişteki Genom Başvurusu FASTA dosyasını kullanın. NOT: Bowtie2 aracı tarafından oluşturulan BAM dosyası Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) kullanılarak görselleştirilebilir. İlişkili BAI dosyası da gerekli olacaktır.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, BAM veri kümesi (Galaxy Sürüm 2.0) için istatistikleri derleyen Flagstat'ı çalıştırın.</li>
	<li>GFF ek açıklama dosyasındaki okuma çakışan özellikleri hizalayan htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) çalıştırın. Kesişim (boş olmayan) modunu kullanın.</li>
	<li>Htseq-count çözümlemesinden tüm ham sayım dosyalarını tek bir Zip dosyasına arşivle.</li>
	<li>Verileri karşılaştırmak için SARTools DESeq2'yi çalıştırın (Galaxy Sürüm 1.6.3.0). Ham sayım dosyalarını içeren Zip dosyasını ve denemeyi açıklayan sekmeyle ayrılmış bir dosya olan tasarım dosyasını sağlayın. Tasarım dosyasını oluşturmak için sağlanan yönergeleri dikkatle izleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs%3A+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li>
<li>Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li>
<li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li>
<li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524(2020).</li>
<li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li>
<li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies%3A+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506(2020).</li>
<li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CopraRNA+and+IntaRNA%3A+predicting+small+RNA+targets%2C+networks+and+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).</li>
<li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li>
<li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li>
<li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li>
<li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li>
<li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li>
<li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li>
<li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10(2007).</li>
<li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone%2C+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li>
<li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProQ%2FFinO-domain+proteins%3A+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li>
<li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
<li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA%3A+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li>
<li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li>
<li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li>
<li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Reseaerch%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li>
<li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li>
<li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IntaRNA+2.0%3A+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li>
<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gram-pozitif bakteriler için değiştirilmiş bir protokol MAPS'in ilk protokolü, E. coli20 , 30model organizmasında sRNA interactom'u incelemek için geliştirilmiştir. Burada, fırsatçı insan patojeni S. aureus'ta sRNA'ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu için uygun olan ve patojenik olsun olmasın diğer Gram-pozitif bakterilere kesinlikle aktarılabilir olan değiştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.
<p class="jove_co...

Çoğu bakteri genomunda yüzlerce, belki de binlerce küçük düzenleyici RNA (sRNA) tanımlanmıştır, ancak bunların büyük çoğunluğunun işlevleri tanımlanmamıştır. Genel olarak, sRNA'lar kısa kodlama dışı moleküllerdir, bakteriyel fizyolojide önemli roller oynarlar ve dalgalanan ortamlara adaptasyon1,2,3. Gerçekten de, bu makromoleküller metabolik yolları, stres yanıtlarını ve aynı zamanda virülans ve antibiyotik direncini etkileyen çok sayıda karmaşık düzenleyici ağın merkezinde yer almaktadır. Mantıksal olarak, sentezleri belirli ortam uyaranları (örneğin, besin açlığı, oksidatif veya membran gerilmeleri) tarafından tetiklenir. Çoğu sRNA, kısa ve bitişik olmayan baz eşleştirme yoluyla transkripsiyon sonrası düzeyde birden fazla hedef mRNA düzenler. Genellikle çeviri başlatma bölgeleri için ribozomlarla rekabet ederek çeviri başlatmayı önlerler4. sRNA:mRNA dublekslerinin oluşumu da genellikle belirli RNa'ların işe alınmasıyla hedef mRNA'nın aktif olarak bozulmasına neden olur.
Bir sRNA targetome'nin karakterizasyonu (yani, hedef RNA'larının tüm kümesi), müdahale ettiği metabolik yolların ve cevap verdiği potansiyel sinyalin tanımlanmasını sağlar. Sonuç olarak, belirli bir sRNA'nın işlevleri genellikle targetomundan çıkarılabilir. Bu amaçla, IntaRNA ve CopraRNA5,6,7gibi siliko tahmin araçlarında birkaç tane geliştirilmiştir. Özellikle putatif sRNA ortaklarını belirlemek için sıra tamamlayıcılığına, eşleştirme enerjisine ve potansiyel etkileşim sitesinin erişilebilirliğine güvenirler. Bununla birlikte, tahmin algoritmaları, RNA refakatçileri8'in alt optimal etkileşimleri veya her iki ortağın birlikte ifadesini tercih etme gibi temel eşleştirmeyi etkileyen tüm faktörleri entegre etmez. Doğal sınırlamaları nedeniyle, tahmin araçlarının yanlış pozitif oranı yüksek kalır. Çoğu deneysel büyük ölçekli yaklaşım, etiketli bir RNA bağlayıcı protein (RBP)6,9ile etkileşime giren sRNA:mRNA çiftlerinin birlikte saflaştırılmasına dayanmaktadır. Örneğin, Ligation ve dizileme ile RNA Etkileşimi (RIL-seq) yöntemi, Escherichia coli10 , 11'dekiHfq ve ProQ gibi RNA refakatçileriyle birlikte saflaştırılmış RNA dublekslerinitanımladı. UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) adı verilen benzer bir teknoloji, E. coli12,13'teki RNase E- ve Hfq ilişkili sRNA'lara uygulandı. Srna aracılı regülasyonda SRNA aracılı düzenlemede Hfq ve ProQ'nun iyi tanımlanmış rollerine rağmen 8,14,15, sRNA tabanlı regülasyon S. aureus16 , 17,18gibi çeşitli organizmalarda RNA refakatçisiz gibi görünmektedir. RNases ile ilişkili RNA dublekslerinin saflaştırılması Waters ve iş arkadaşları13tarafından gösterildiği gibi mümkün olsa bile, RNases hızlı bozulmalarını tetikledikçe bu zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, MS2 Benzeşim Saflaştırması RNA Dizilimi (MAPS) yaklaşımı19,20 ile birleştiğindebutür organizmalarda sağlam bir alternatif oluşturur.
Yukarıda belirtilen yöntemlerin aksine, MAPS tüm etkileşime giren RNA'ları yakalamak için yem olarak belirli bir sRNA kullanır ve bu nedenle bir RBP'nin katılımına dayanmaz. Tüm süreç Şekil 1'de tasvir edilir. Kısacası, sRNA 5' ile ms2 kat proteini tarafından özel olarak tanınan MS2 RNA aptamer ile etiketlenmiştir. Bu protein, amiloz reçinesi üzerinde hareketsiz hale getirmek için maltoz bağlayıcı protein (MBP) ile kaynaştırılır. Bu nedenle, MS2-sRNA ve RNA ortakları benzeşim kromatografi sütununda tutulur. Maltoz ile elüsyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA'lar yüksek verimli RNA dizilimi ve ardından biyoinformatik analiz kullanılarak tanımlanır (Şekil 2). MAPS teknolojisi sonuçta in vivo meydana gelen tüm potansiyel etkileşimlerin etkileşimli bir haritasını çizer.
MAPS teknolojisi başlangıçta patojenik olmayan Gram-negatif bakteri E. coli21'deuygulanmıştır. Dikkat çekici bir şekilde MAPS, hem RyhB hem de RybB sRNA'ları ile özellikle etkileşime giren ve teşvik edici olmayan koşullarda mRNA hedeflerini düzenlemek için herhangi bir sRNA transkripsiyonal gürültüyü önleyen tRNA türevi bir parçanın tanımlanmasına yardımcı oldu. Bundan sonra MAPS, DsrA 22 , RprA 23 , CyaR 23ve GcvB24( Tablo1)gibi diğer E. coli sRNA'larına başarıyla uygulanmıştır. DAHA ÖNCE BILINEN HEDEFLerİ ONAYLADI MAPS, bu iyi bilinen sRNA'ların targetome'larını genişletti. Son zamanlarda, MAPS Salmonella Typhimurium'da gerçekleştirildi ve SraL sRNA'nın rho mRNA'ya bağlandığını, transkripsiyon sonlandırma faktörü25için kodlama yaptığını ortaya koydu. Bu eşleştirme sayesinde SraL, rho mRNA'yı Rho'nun kendisi tarafından tetiklenen erken transkripsiyon sonlandırmasından korur. İlginçtir ki, bu teknoloji sRNA'larla sınırlı değildir ve tRNA türevi bir parça 26 ve mRNA22'nin 5'çevrilmemiş bir bölgesinin kullanılmasıyla örneklenen her türlü hücresel RNA'ya uygulanabilir (Tablo 1).
MAPS yöntemi patojenik Gram-pozitif bakteri S. aureus19'ada uyarlanmıştır. Özellikle, liziz protokolü, Gram negatif bakterilerden daha kalın bir hücre duvarı nedeniyle hücreleri verimli bir şekilde kırmak ve RNA bütünlüğünü korumak için yaygın olarak değiştirilmiştir. Bu uyarlanmış protokol zaten RsaA27, RsaI28 ve RsaC29'un interactom'ınıçözdü. Bu yaklaşım, bu SRNA'ların hücre yüzeyi özelliklerinin düzenleyici mekanizmaları, glikoz alımı ve oksidatif stres yanıtlarındaki önemli rolü hakkında fikir verdi.
2015 yılında E. coli'de geliştirilen ve uygulanan protokol son zamanlarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır30. Burada, patojenik olmayan veya patojenik (güvenlik önlemleri) olsun, Gram-pozitif (daha kalın hücre duvarı) bakterilerdeki sRNA düzenleyici ağları incelemek için özellikle uygun olan değiştirilmiş MAPS protokolünü sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>2 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNA miktarı ve kalitesi</td></tr><tr><td>250 mL kültür şişesi</td><td>Dominique Dutscher</td><td>2515074</td><td>Bakteriyel kültürler</td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td>Kültür santrifüjleme</td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>20821.321</td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması</td></tr><tr><td>Allegra X-12R Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Bakteriyel peletleme</td></tr><tr><td>Ampicilin (amp)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Amiloz reçinesi</td><td>Yeni İngiltere BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2-afinite saflaştırma</td></tr><tr><td>Anti-dioksigenin AP Fab parçası</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>Otoradyografi kaseti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>Plazmid yapımı</td></tr><tr><td>BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) Et suyu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Bloke edici reaktif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>Kuzey blot tahlilleri (substrat)</td></tr><tr><td>Santrifüj 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırma</td></tr><tr><td>DIG-RNA etiketleme karışımı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11277073910</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>DNaz tedavisi</td></tr><tr><td>Eritromisin (ery)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>FastPrep cihazı</td><td>MP Biyomedikal</td><td>116004500</td><td>Mekanik lizis</td></tr><tr><td>Guanidyum Tiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>Kuzey blot tahlilleri</td></tr><tr><td>Hibridizasyon tüpleri</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>İzoamil alkol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/6960/08</td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması</td></tr><tr><td>LB (Lizojeni Et Suyu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Lysing Matrix B Bulk</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>Mekanik lizis</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporatör</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>Plazmid yapısı</td></tr><tr><td>Milli-Q su cihazı</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Ultrasaf su</td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>RNA/DNA miktarı ve kalitesi</td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Dominique Dutsher</td><td>10600002</td><td>Kuzey blot tahlilleri</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>Temizleme ve dekontaminasyon</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Carl Roth</td><td>38.2</td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırma</td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Plazmid yapısı</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>MS2-MBP üretimi</td></tr><tr><td>Poly-Prep kromatografi kolonu</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2-afinite saflaştırma</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>Plazmid yapısı</td></tr><tr><td>Qubit 3 Florometre</td><td>İnvitrojen</td><td>15387293</td><td>RNA miktarı</td></tr><tr><td>RNAPro Çözümü</td><td>MP Biyomedikal</td><td>6055050</td><td>Mekanik lizis</td></tr><tr><td>ScriptSeq Komple Kit</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>cDNA kütüphanelerinin hazırlanması</td></tr><tr><td>Spektrofotometre Genesys 20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>Bakteri kültürleri</td></tr><tr><td>SpeedVac Savant vakum cihazı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DNA120</td><td>RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>Northern blot tahlilleri</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>Plazmid yapısı</td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borat-EDTA)</td> <td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>Kuzey leke testleri</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Plazmid yapısı</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>X-ışını film işlemcisi</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr><tr><td>X-ışını filmleri Süper RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>Kuzey leke tahlilleri</td></tr></tbody></table>

ms2-benzeşim saflaştırma gram-pozitif bakterilerde rna dizilimi ile birleştiğinde

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Yaşamın bakteriyel etki alanı arasında küçük düzenleyici RNA'lar (sRNA'lar) yaygın olsa da, birçoğunun işlevleri özellikle mRNA hedeflerini belirlemenin zorluğu nedeniyle kötü karakterize edilmeye devam etmektedir. Burada, ms2-benzeşim saflaştırma RNA Dizileme (MAPS) teknolojisi ile birleştiğinde, belirli bir sRNA in vivo tüm RNA ortaklarını ortaya çıkarmayı amaçlayan değiştirilmiş bir protokol açıkladık. Genel olarak, MS2 aptamer, ilgi çekici sRNA'nın 5' ekstremitesine kaynaşmıştır. Bu yapı daha sonra in vivo olarak ifade edilir ve MS2-sRNA'nın hücresel ortaklarıyla etkileşime girmesini sağlar. Bakteri hasadından sonra hücreler mekanik olarak yutmuş. Ham ekstrakt, daha önce maltoz bağlayıcı proteine kaynaşmış MS2 proteini ile kaplanmış amiloz bazlı bir kromatografi sütununa yüklenir. Bu, MS2-sRNA'nın ve etkileşimli RNA'ların özel olarak yakalanmasını sağlar. Efüzyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA'lar yüksek verimli RNA dizilimi ve daha sonra biyoinformatik analiz ile tanımlanır. Aşağıdaki protokol Gram-pozitif insan patojeni Staphylococcus aureus'ta uygulanmıştır ve prensip olarak herhangi bir Gram-pozitif bakteriye transpoze edilebilir. Özetlemek gerekirse, MAPS teknolojisi, belirli bir sRNA'nın düzenleyici ağını derinlemesine keşfetmek için etkili bir yöntem oluşturur ve tüm targetome'unun bir anlık görüntüsünü sunar. Bununla birlikte, MAPS tarafından tanımlanan putatif hedeflerin hala tamamlayıcı deneysel yaklaşımlarla doğrulanmış olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.

Temsili sonuçlar, RsaC targetome'nin S. aureus29 'daki çalışmasındankaynaklanmaktadır. RsaC alışılmadık bir 1.116 nt uzunluğunda sRNA'dır. 5' ucu birkaç yinelenen bölge içerirken, 3' ucu (544 nt) yapısal olarak bağımsızdır ve mRNA hedefleriyle tahmin edilen tüm etkileşim alanlarını içerir. Bu sRNA'nın ekspresyişi manganez (Mn) az olduğunda indüklenmiştir, bu da sıklıkla konak immün yanıtı bağlamında karşılaşılan bir durumdur. MAPS teknolojisini kullanarak, RsaC ile doğrudan etkileşime gir...

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MS2 benzeşimlilik saflaştırma RNA dizilimi veya MAPS ile birleştiğinde bakterilere ilgi gösteren herhangi bir RNA'nın tüm hedef milyonlarını tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu teknoloji, düzenleme mekanizmasından bağımsız olarak her türlü sRNA ortaklarının tanımlanmasını mümkün kılar. SRNA'ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu, konak hücrelerdeki bakterilerin üretimini, biyofilm oluşumunu ve hayatta kalmasını daha iyi anlamaya yardımcı olacak ve sonuçta stafilokok enfeksiyonlarına karşı savaşacaktır.Bu protokol herhangi bir patojenik veya patojenik olmayan gram pozitif bakteriye uygulanabilir. Prosedürü gösteren Noemie Mercier, Dr. Pascal Romby'nin laboratuvarından bir doktora öğrencisi. Başlamak için, üç mililitre BHI ortamında pCN51 P3 MS2 sRNA veya pCN51 P3 MS2 plazmidleri taşıyan bir suş kolonisi yetiştirin ve kopyalarda mikrolitre eritromisinin başına 10 mikrogram ile desteklenmiştir.Her bir gece kültürünü 0,05'in 600'üne ulaşmak için eritromisinin takviye edildiği 50 mililitre taze BHI ortamında seyreltin. Kültürleri 37 santigrat derecede büyütün ve altı saat boyunca 180 RPM'de sallanın. Her kültürü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri dört sant

ms2-affinity-purification-coupled-with-rna-sequencing-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

A ribozomal RNA (rRNA) azalması protokolü sivrisinek bağırsak metatranscriptome RNA-seq mesajcı RNA (mRNA) zenginleştirmek için geliştirilmiştir. Çıkarma yoluyla rRNA kaldırmak için kullanılan örnek belirli rRNA probları, sivrisinek ve onun bağırsak mikropları oluşturulmuş. Protokol performans rRNA yaklaşık olarak% 90-99 arasında kaldırma neden olabilir.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

Mikrobiyal topluluğu karakterize etmek, çevresel mikrobiyolojide uzun süredir devam eden bir hedef olmuştur. Yeni nesil dizileme yöntemleri artık mikrobiyal toplulukların minimum maliyet ve iş gücü ile benzeri görülmemiş bir derinlikte karakterizasyonuna izin veriyor. Burada, bir tezgah üstü dizileyici kullanarak bakteriyel 16S ribozomal RNA genlerini dizileme yaklaşımımızı detaylandırıyoruz.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve moleküler teknikler (16S rRNA gen dizilimi), rutin teşhiste nadir görülen bakteriyel patojenlerin tanımlanmasına izin verir. Bu protokolün amacı, daha doğru ve güvenilir verilere yol açan her iki tekniğin kombinasyonunda yatmaktadır.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin MAPS teknolojisiyle gram-pozitif bakterilerde sRNA düzenleyici ağlarını karakterize etme yöntemini. MS2-benzeşim saflaştırma ve RNA dizileme kullanılarak RNA ortakları belirlenir.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Daha fazla video keşfet