Rhesus Macaque Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu, Proliferasyonu ve Farklılaşması

Adipoz kaynaklı kök hücre izolasyonu ve proliferasyonu, çeşitli aşağı akış uygulamaları ve deneysel teknikler için kullanılabilecek çok sayıda kök hücre üretir. Bu protokolde farklılaşmış adipositler için başlıca amaçlanan kullanım, insülin ile uyarılmış glikoz alımı, lipogenez ve uyarılmış lipoliz gibi metabolik testlerdir. Başlamak için, biyogüvenlik başlığını ve tüm aletleri dezenfekte ederek steril bir çalışma ortamı yaratın.

Pipet, yaklaşık 10 mililitre beş PBS tamponunu dört adet 100 milimetrelik hücre kültürü kabına yerleştirir. 50 gramlık bir yağ örneğini bulaşıklardan birine aktarın ve beş PBS içeren diğer bulaşıklara sırayla aktararak dört kez yıkayın. Daha sonra yıkanmış yağ dokusunu temiz bir 100 milimetre kültür kabına aktarın ve makas veya steril forseps kullanarak iyice kesin.

Kıyılmış dokunun bir ila üç santimetrelik bir bölümünü, 13 mililitre kollajenaz tamponu içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Toplam 15 mililitre hacim sağlamak için kültür kabından kalan dokuyu iki mililitre kollajenaz tamponu ile durulayın. Numuneyi 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın ve tüpü 30 ila 60 dakika boyunca bir rocker üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Enzim aktivitesini nötralize etmek için, inkübasyondan sonra tüpe 10 mililitre ADSC büyüme ortamı ekleyin ve herhangi bir doku agregasını ayırmak için bir pipetle iyice karıştırın. Sıvı kısmı, katı dokuyu bırakarak yeni bir steril 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Yedi mililitre iki PBS kullanarak dokuyu üç kez yıkayın ve sıvıyı yeni tüpe aktarın.

Daha sonra, tüpü beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin ve peleti rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatantı dikkatlice çıkarın. Peleti bir mililitre 1X kırmızı kan hücresi veya RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra tüpe beş mililitre ADSC büyüme ortamı ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın ve süpernatanı çıkarmak için santrifüj yapın.

Son yıkamadan sonra, peleti iki mililitre ADSC büyüme ortamında yeniden askıya alın ve 70 mikronluk bir hücre süzgecinden steril 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Süzgeci ilave iki mililitre ortamla durulayın ve süspansiyonun dört mililitresini steril bir 100 mililitrelik kültür kabına aktarın. Kültür kabında toplam 10 mililitre hacim toplamak için konik tüpü üç mililitre orta ile iki kez durulayın.

Yüzen hücreleri kontrol etmek için toplanan hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında 10X büyütmede gözlemleyin. Hücreleri 24 saat boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit ve% 100 bağıl nemde inkübe edin. Kültür ortamının sterilitesini sağlamak için, yalnızca ortam içeren bir plaka ekleyin.

24 saat sonra, hücre yapışmasını kontrol etmek için hücreleri ters mikroskop altında görüntüleyin. Hücreler% 80 ila% 90 birleşene kadar ortamı her 48 saatte bir ılık ortamla çıkarın ve değiştirin. Proliferasyon için, büyüme ortamını akan ADSC hücrelerinden çıkarın ve iki mililitre steril oda sıcaklığı PBS ile iki kez yıkayın.

PBS'yi aspire edin ve plakanın tüm yüzey alanını kaplayan her kültür plakasına iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Plakayı yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, ardından tripsinizli hücreleri zorla pipetleme ile mekanik olarak yerinden çıkarın. İki mililitre ADSC büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri yavaşça karıştırın.

Hücreleri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın, plakadan maksimum hücre geri kazanımını sağlamak için çanağı ek iki mililitre ortamla durulayın. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin ve hücre peletini elde etmek için süpernatantı boşaltın. Hücre peletini milyon hücre başına beş ila altı mililitre ADSC büyüme ortamında yeniden askıya alın.

Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve metin yazısında açıklandığı gibi plakalayın. Hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri steril oda sıcaklığı PBS ile durulayın, ardından 10 mililitre ADSC farklılaşma ortamı ekleyin. Ortamı yaklaşık 14 ila 21 gün boyunca her üç günde bir değiştirin.

40X büyütmede ters çevrilmiş mikroskop altında lipit damlacıklarının varlığı için hücreleri gözlemleyin. Olgun adipositler genellikle 14 gün sonra görülür. Kaplama gününde, ADSC'ler yapışkan değildi ve kültürde yüzüyordu.

Hücreler 72 saat sonra% 80 oranında kaynaştı ve adiposit farklılaşması için hazırdı. 14 günlük ADSC farklılaşmasından sonra, olgun adipositler 40X büyütme altında gözlenen güçlü adipojenik özellikler sergiledi. 14. günde, hücreler boyandı ve lipit damlacığı görselleştirmesi için Yağ Kırmızı O ve BODIPY ile sabitlendi.

Diferansiye adipositler 20X büyütme altında gözlenebilir. Bu protokolü denerken, steril bir çalışma ortamının sağlıklı izolasyon, yeterli genişleme ve yağ türevi kök hücrelerin verimli bir şekilde farklılaşması için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bu hücreler araştırmamızın ana odak noktası olan glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz gibi çeşitli metabolik testler için kullanılabilir.

Bu teknik, kronik alkol ve SIV'nin adiposit metabolik kapasitesini nasıl etkilediğinin araştırılmasına izin verir.