Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

DNP destekli MAS NMR spektroskopisinin duyarlılığı, sağlam hücrelerin içindeki proteinleri endojen konsantrasyonlarında karakterize etmemizi sağlar. Bu uygulama dikkatli bir numune kullanımı gerektirir. Bazı morfolojiler korunur ve hücreler, bu protokol kullanılarak kriyojenik olarak spektrometreye aktarıldıklarında yaşayabilirler.

Soğuk rotorun devreye sokulması nem ve buz birikmesine neden olabilir, bu da numunenin dönmesini mekanik olarak önleyebilir. Bu gösteri, kriyojenik transferi güvenle gerçekleştirmek için deneylere rehberlik edecektir. Başlamak için, kapağın altına ve kriyojenik şişenin altına bir parça mendil veya kağıt havludan yapılmış bir yastık yerleştirin.

3.2 milimetre safir rotoru, işaretli ucu şişenin altına bakacak şekilde, kağıt mendille doldurulmuş kriyojenik şişeye yerleştirin. Şişeyi kontrollü bir soğutma kabına yerleştirerek rotoru yavaşça dondurun ve kabı en az üç saat boyunca 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi sıvı nitrojenle doldurulmuş küçük bir termosa aktarın.

Numuneyi spektrometre tesisine taşımak için termosu kullanın. Kuru, ısı yalıtımlı, geniş ağızlı bir köpük vakum şişesini 500 mililitre ila bir litre sıvı nitrojen ile doldurun. Kriyojenik şişeyi transfer şişesinden alın ve atmosferden korumak için sıvı nitrojen yüzeyinin hemen üzerinde tutun.

Kriyojenik şişeyi, şişenin ağzı hafifçe aşağı bakacak şekilde tutarken, kapağı sökün ve rotorun sıvı nitrojen banyosuna kaymasına izin verin. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü sıvı nitrojene batırarak önceden soğutun. Sıvı nitrojen banyosunun yüzeyinin altında, rotoru, tahrik ucu tüpün altına bakacak ve işaretler açıklığa bakacak şekilde mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın.

Rotoru içeren tüpü sıvı nitrojen altında boynundan tutmak için cımbız kullanın. İkinci bir cımbızla, NMR numune tutucuyu, mikrosantrifüj tüpüne göre dar bir açıyla eğimli sıvı nitrojen yüzeyinin üzerinde tutun. Rotoru NMR numune tutucudan NMR spektrometresine aktarmak için, çıkar düğmesine basarak kriyo kabinini fırlatma moduna getirin.

NMR numune tutucunun açık ucunu, hala sıvı nitrojen yüzeyinin altındayken mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Rotorun numune tutucuya düşmesini sağlamak için hem mikrosantrifüj tüpünü hem de NMR numune tutucuyu kaldırın. Rotor kenara takılırsa, numune tutucuyu ve tüpü sallayın.

Rotoru havadan korumak için boş mikrosantrifüj tüpünü NMR numune tutucunun üzerine bırakın. Diğer boş numune tutucuyu probdan çıkarın ve yere koyun. Rotoru içeren NMR numune tutucuyu diğer elinize aktarın.

Ardından mikrosantrifüj tüpünü çıkarın ve hemen probun içine yerleştirin. Kriyo kabinini çalıştıran kişiye basması, durdurması, çıkarması ve takması için sinyal verin. Yatağı ayarlayarak ve akış basıncını sürerek numuneyi istenen eğirme hızına döndürün.

Geniş ağızlı bir köpük vakum şişesine bir litre sıvı nitrojene 500 mililitre dökün ve banyoyu spektrometrenin altına yerleştirin. Bir parça kağıt mendil içeren boş kriyojenik şişeyi sıvı nitrojen banyosuna batırın. Tahrik ve yatak gazı akışını azaltarak eğirme hızını sıfır kilohertz'e düşürün ve fırlatma moduna geçerek rotoru çıkarın.

Fırlatma modunu açık tutarken, numune tutucuyu probdan çıkarın ve rotoru doğrudan sıvı nitrojen içeren geniş ağızlı köpük şişeye bırakın. Önceden soğutulmuş cımbız kullanarak, rotoru sıvı nitrojen yüzeyinin altındaki önceden soğutulmuş kriyojenik şişeye aktarın. Kriyojenik flakon kapağını sıvı nitrojene batırarak önceden soğutun.

Rotoru ve sıvı nitrojeni içeren şişeyi banyodan çıkarın ve tüpü önceden soğutulmuş kapakla kapatın. Kriyojenik şişeyi sıvı nitrojene tekrar batırın. Numune, daha uzun süreli sıvı nitrojen deposuna aktarılabilir veya daha fazla analiz için hemen ambalajından çıkarılabilir.

Memeli hücrelerinin önceden dondurulmuş örneklerinin NMR spektrometresine kriyojenik olarak yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca canlılığı destekler. Bu protokolü kullanarak, MAS NMR'den sonra memeli hücrelerinin tripan mavisi geçirgenliği, herhangi bir sıcaklık değişimine maruz kalmayan hücrelerinkine benzer. Hücreler yavaş dondurulursa, yerleştirilmeden önce oda sıcaklığına ısıtılırsa, hücresel canlılık %10'un altına düşerBu arada, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin kriyojenik yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca hücre canlılığını destekler.

Protokolü denerken, numunenin ısınmadan önce proba sokulabilmesi için numuneyi çıkarmak ve döndürmek için yardım isteyin, böylece spektrometrenin haftalarca soğuyacağından emin olarak proba nem girmediğinden emin olun. Bu protokol, donarak söndürülmüş reaksiyonlar veya sıkışmış reaksiyon ara maddelerinin karakterizasyonu ve protein katlanması gibi sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sisteme uygulanabilir.