Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme
September 1st, 2020
Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.
DNP destekli MAS NMR spektroskopisinin duyarlılığı, sağlam hücrelerin içindeki proteinleri endojen konsantrasyonlarında karakterize etmemizi sağlar. Bu uygulama dikkatli bir numune kullanımı gerektirir. Bazı morfolojiler korunur ve hücreler, bu protokol kullanılarak kriyojenik olarak spektrometreye aktarıldıklarında yaşayabilirler.
Soğuk rotorun devreye sokulması nem ve buz birikmesine neden olabilir, bu da numunenin dönmesini mekanik olarak önleyebilir. Bu gösteri, kriyojenik transferi güvenle gerçekleştirmek için deneylere rehberlik edecektir. Başlamak için, kapağın altına ve kriyojenik şişenin altına bir parça mendil veya kağıt havludan yapılmış bir yastık yerleştirin.
3.2 milimetre safir rotoru, işaretli ucu şişenin altına bakacak şekilde, kağıt mendille doldurulmuş kriyojenik şişeye yerleştirin. Şişeyi kontrollü bir soğutma kabına yerleştirerek rotoru yavaşça dondurun ve kabı en az üç saat boyunca 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi sıvı nitrojenle doldurulmuş küçük bir termosa aktarın.
Numuneyi spektrometre tesisine taşımak için termosu kullanın. Kuru, ısı yalıtımlı, geniş ağızlı bir köpük vakum şişesini 500 mililitre ila bir litre sıvı nitrojen ile doldurun. Kriyojenik şişeyi transfer şişesinden alın ve atmosferden korumak için sıvı nitrojen yüzeyinin hemen üzerinde tutun.
Kriyojenik şişeyi, şişenin ağzı hafifçe aşağı bakacak şekilde tutarken, kapağı sökün ve rotorun sıvı nitrojen banyosuna kaymasına izin verin. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü sıvı nitrojene batırarak önceden soğutun. Sıvı nitrojen banyosunun yüzeyinin altında, rotoru, tahrik ucu tüpün altına bakacak ve işaretler açıklığa bakacak şekilde mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın.
Rotoru içeren tüpü sıvı nitrojen altında boynundan tutmak için cımbız kullanın. İkinci bir cımbızla, NMR numune tutucuyu, mikrosantrifüj tüpüne göre dar bir açıyla eğimli sıvı nitrojen yüzeyinin üzerinde tutun. Rotoru NMR numune tutucudan NMR spektrometresine aktarmak için, çıkar düğmesine basarak kriyo kabinini fırlatma moduna getirin.
NMR numune tutucunun açık ucunu, hala sıvı nitrojen yüzeyinin altındayken mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Rotorun numune tutucuya düşmesini sağlamak için hem mikrosantrifüj tüpünü hem de NMR numune tutucuyu kaldırın. Rotor kenara takılırsa, numune tutucuyu ve tüpü sallayın.
Rotoru havadan korumak için boş mikrosantrifüj tüpünü NMR numune tutucunun üzerine bırakın. Diğer boş numune tutucuyu probdan çıkarın ve yere koyun. Rotoru içeren NMR numune tutucuyu diğer elinize aktarın.
Ardından mikrosantrifüj tüpünü çıkarın ve hemen probun içine yerleştirin. Kriyo kabinini çalıştıran kişiye basması, durdurması, çıkarması ve takması için sinyal verin. Yatağı ayarlayarak ve akış basıncını sürerek numuneyi istenen eğirme hızına döndürün.
Geniş ağızlı bir köpük vakum şişesine bir litre sıvı nitrojene 500 mililitre dökün ve banyoyu spektrometrenin altına yerleştirin. Bir parça kağıt mendil içeren boş kriyojenik şişeyi sıvı nitrojen banyosuna batırın. Tahrik ve yatak gazı akışını azaltarak eğirme hızını sıfır kilohertz'e düşürün ve fırlatma moduna geçerek rotoru çıkarın.
Fırlatma modunu açık tutarken, numune tutucuyu probdan çıkarın ve rotoru doğrudan sıvı nitrojen içeren geniş ağızlı köpük şişeye bırakın. Önceden soğutulmuş cımbız kullanarak, rotoru sıvı nitrojen yüzeyinin altındaki önceden soğutulmuş kriyojenik şişeye aktarın. Kriyojenik flakon kapağını sıvı nitrojene batırarak önceden soğutun.
Rotoru ve sıvı nitrojeni içeren şişeyi banyodan çıkarın ve tüpü önceden soğutulmuş kapakla kapatın. Kriyojenik şişeyi sıvı nitrojene tekrar batırın. Numune, daha uzun süreli sıvı nitrojen deposuna aktarılabilir veya daha fazla analiz için hemen ambalajından çıkarılabilir.
Memeli hücrelerinin önceden dondurulmuş örneklerinin NMR spektrometresine kriyojenik olarak yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca canlılığı destekler. Bu protokolü kullanarak, MAS NMR'den sonra memeli hücrelerinin tripan mavisi geçirgenliği, herhangi bir sıcaklık değişimine maruz kalmayan hücrelerinkine benzer. Hücreler yavaş dondurulursa, yerleştirilmeden önce oda sıcaklığına ısıtılırsa, hücresel canlılık %10'un altına düşerBu arada, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin kriyojenik yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca hücre canlılığını destekler.
Protokolü denerken, numunenin ısınmadan önce proba sokulabilmesi için numuneyi çıkarmak ve döndürmek için yardım isteyin, böylece spektrometrenin haftalarca soğuyacağından emin olarak proba nem girmediğinden emin olun. Bu protokol, donarak söndürülmüş reaksiyonlar veya sıkışmış reaksiyon ara maddelerinin karakterizasyonu ve protein katlanması gibi sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sisteme uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, örnek bütünlüğünü ve canlılığını koruyarak, dondurulmuş örneklerin manyetik rezonans (MR) sondasına kriyojenik aktarımını ayrıntılarıyla açıklamaktadır. Rotoru spektrometreye sokarken nem birikim sorununa odaklanır ve hücrelerin deney boyunca işlevsel özelliklerini korumalarını sağlar.
Ana Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Dinamikli nükleer polarizasyon (DNP) MR spektroskopisi
- Biyolojik araştırmalarda örnek taşıma
- Deneysel prosedürler sırasında hücre canlılığı
Arka Plan
- Tamamlayı hücrelerde proteinleri incelemek için DNP'nin önemi
- Kriyojenik transfer sırasında nem ve buz birikimi sorunları
- Protokol boyunca hücresel canlılığın korunmasının önemi
Kullanılan Yöntemler
- Termal yalıtımlı bir sistem kullanarak dondurulmuş örneklerin kriyojenik taşınması
- Biyolojik sistem olarak memeli hücreleri
- Nükleer manyetik rezonans (MR) teknolojisi
Ana Sonuçlar
- MR deneyi sırasında hücre canlılığının başarılı bir şekilde korunması
- Trypan mavisi geçirgenliği, soğutulmuş ve soğutulmamış hücrelerde benzer canlılık gösterdiğini işaret eder
- Protokol, örnek taşıma için kriyojenik yöntemlerin etkinliğini doğrular
Sonuçlar
- Çalışma, örneklerin MR sondralarına yerleştirilmesi için etkili kriyojenik yöntemler gösterir
- Bu protokol, sıcaklığa duyarlı örnekler içeren biyolojik deneylerin güvenilirliğini artırır
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cryogenic sample handling enables preservation of cellular integrity for dynamic nuclear polarization NMR studies of intracellular proteins at endogenous concentrations. This approach supports target validation in native cellular environments by maintaining viability through low-temperature transfer. The protocol addresses a key bottleneck in applying high-sensitivity NMR to drug discovery workflows requiring mechanistic de-risking of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by characterizing proteins inside intact cells at physiological concentrations.
- Operational Value: Preserves cellular viability during NMR experiments, reducing false negatives from sample degradation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through structural data obtained under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, atom-level readouts of protein-ligand interactions in cryopreserved cellular systems.
- Operational Value: Standardizes sample introduction to minimize variability from ice accumulation or moisture interference.
- Assay Readiness: Enables reproducible preparation of frozen rotor samples for high-sensitivity DNP-MAS NMR screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural biology with preclinical validation by maintaining sample integrity across workflows.
- Disease-Relevant System: Applicable to mammalian cell models used in target validation and pathway elucidation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on structural data from viable, endogenous-state samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling structural characterization after target identification and before lead optimization, particularly for intracellular targets requiring native-cell context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing atomic-resolution data on proteins in viable cells.
- Screening: Ensures assay reproducibility through controlled cryogenic transfer that prevents moisture-related spinning failures.
- Analytics: Generates quantitative structural and dynamic measurements that inform target confidence and ligand-binding assessments.
- Translational Research: Maintains continuity from cellular target validation to preclinical models by preserving sample integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for cryogenic handling of temperature-sensitive biological samples across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via structural data from intact, viable cells.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in sample transfer, reducing experimental failure from moisture or ice buildup.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable mechanistic data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility in native cellular environments.
Implementation Considerations
- Expertise in cryogenic sample handling and NMR probe operation.
- Access to controlled-rate cooling equipment, liquid nitrogen dewars, and thermally insulated transfer flasks.
- Standardization of transfer procedures across teams to ensure consistent sample integrity.
- Adaptation considerations for different rotor types or cell lines while maintaining low-temperature chain.
- Practical limitation: Requires rapid execution to prevent warming during transfer, necessitating trained personnel coordination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Cryopreservation of Mammalian Cells in an NMR Rotor
1:25
Cryogenic Transfer of a Frozen Sample into the NMR Spectrometer
3:48
Cryogenic Removal of the Sample from the NMR Spectrometer
5:02
Results: Cryogenic Insertion of a Pre-frozen Sample of Mammalian Cells Results in Cellular Intactness Similar to Never-frozen Mammalian Cell Samples
5:47
Conclusion
