Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mikroçevrim, sürekli değişen sitokinler, ligand konsantrasyonu ve bileşimi de dahil olmak üzere son derece karmaşık ve dinamik bir dinamik sağlar. Benzer bir kültür ortamı yaratmak, kök hücre farklılaşması, immün yanıtlar ve çip platformlarında organların gelişimi gibi karmaşık yaşam makineleri üzerinde in vitro çalışmalar için çok önemlidir. Ancak, pipetleme gibi geleneksel biyomedikal yaklaşımları kullanarak nanolitre hacmi ve milisaniye doğruluk kimyasal sinyalleri üretmek ve sunmak zordur.

Zorlukların üstesinden gelmek için, dinamik kombinatoryal ve sıralı sinyal girişlerinin alternatif görüntü alma üretimine sahip bir kültür platformu yüksek talep görüyor. Bu protokolde, bir mikroakışkan cihazın tasarım ve imalat prosedürü sunulmuştur. Önerilen mikroakışkan çip, 1500 kültür ünitesi, gelişmiş peristaltik pompalar dizisi ve yerinde karıştırma modülünden oluşur.

Platformun tek hücreli iki boyutlu hücre popülasyonları ve üç boyutlu sinir küreleri üzerinde yapılan çalışmalar için uygun olduğunu gösteriyoruz. Çip üzerindeki karmaşık ve dinamik çevresel koşulların nöral kök hücre farklılaşması ve kendini yenileme üzerinde büyük etkileri vardır. Tasarım ve imalat prosedürlerinin detayı aşağıdaki gibidir.

Çip tasarımı AutoCAD yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Plaka tutucunun boyutunu mikroskop üzerine sığdırmak için, mikroakışkan çip yaklaşık yedi ila beş santimetre büyüklüğündedir ve 1.500 kültür odasından oluşur. Önemli özelliklerden biri, sekiz akış kanalı ve 200 mikrometre genişliğinde kontrol kanalından oluşan peristaltik pompaya sahip olmasıdır.

Kontrol ve akış kanalı arasındaki örtüşen alandaki artış, Stephen Quake tarafından 2002 yılında önerilen peristaltik pompaya kıyasla 16 kat artarak yaklaşık 15 nanolitre sıvıya ve pompalama döngüsü başına artmaktadır ve çip üzerinde paralel olarak 1.500 bağımsız çevresel koşulun korunması ihtiyacını karşılamaktadır. Cihazın bir diğer önemli parçası, kesmesiz kültür ortamını koruyabilen iki katmanlı bir kültür odasıdır. İstenmeyen kesme stresi, üst katmandan hızlı bir şekilde yönlendirilerek önlenir.

Hücreler, dokular ve önemli koşullu ortam alt katmanda el değmemiş kalır. Sayısal simülasyon, sıvılar kültür odalarından yönlendirildiğinde soldan sağa doğru yönlendirildiğini göstermektedir. kesme kuvvetleri etkili bir şekilde önlenebilir.

İkinci hücre başına 10 milimetre giriş akış hızında veya mikrometre boyutunda doku bile kültür ünitesinin dibinde bozulmadan kalır. UV litografi kullanarak replika kalıplama veya silikon gofret imal ettik. Yüksekliği 25 mikrometre, ağırlığı 100 mikrometre olan akışkan kanallar SU-8 3025 negatif fotoresist kullanılarak üretilmektedir.

75 mikrometre ve 150 mikrometre yüksekliğindeki kültür odaları SU-8 3075 fotoresist kullanılarak imal edilmiştir. AZ50X pozitif fotoresist, iyi bir bağlantı sağlamak için kontrol kanallarıyla örtüşen yuvarlak şekilli kuyu özellikleri için kullanılır. Mikroakışkan çipi üretmek için, desenli ve boş silikon gofretler öncelikle TMCS ile tedavi edildi.

Farklı miktarlarda PDMS 10 ila 1 monomer katalizör oranı, eksi 0,85 megapaskal vakum odasında bir ila iki saat boyunca iyice karıştırıldı ve debubbled edildi. Kontrol katmanı PDMS'nin 2.200 RPM'de spin kaplaması ile elde edildi. Silikon gofretler daha sonra inkübatöre aktarıldı ve 80 santigratta 60 dakika inkübe edildi.

Özelleştirilmiş optik cihaz ve plazma gravür makinesi kullanılarak farklı katmanlar hizalandı ve birbirine bağlandı. Giriş delikleri daha sonra 80 santigratta iki saat daha termal bağlanmadan sonra delindi. Çip, aynı boyutta 96 kuyu plakası olan PDMS kaplı bir kapak fişine bağlandı ve kullanımdan önce 80 santigrat derecede en az 12 saat kürlendi.

Operasyon için, kontrol kanalları plastik borular aracılığıyla minyatür pnömatik solenoid valflere bağlandı. Tüm penumatic kuyuların tornalama grafik kullanıcı arayüzü aracılığıyla özel bir MATLAB programı tarafından kontrol edildi. Şınav PDMS membran vanalarının optimum kapatma basınçları, tipik olarak 25 ila 30 PSI arasında değişen her çip için ayrı ayrı belirlendi.

Tüm kuyular serisini dinamik olarak kombinatoryal ve sıralı girişler çip üzerinde üretilebilir. Hücreler % 80 izdiahta hasat edildi ve kültür ortamı DMEM ile mililitre başına yaklaşık 10 ila 6 güç yoğunluğunda yeniden kullanılmaya başlandı ve daha sonra çözelti içeren hücreye basınç uygulanarak çipe yüklendi. Hem yapışan hem de nöro kök hücrelerin süspansiyon kültürü için hücreler toplandı ve küreler doğrudan çipe yüklendi.

Görüntü alımı için otomatik çeviri aşamasına sahip ters mikroskop ve dijital tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera kullanılmıştır. Aşama ve görüntü alımı yazılım aracılığıyla kontrol edildi, sol üst köşeyi ve sağ alt köşe odalarını seçme noktaları olarak gösterir ve 4x objektif lens ile ön görüntülemeyi elde etmek için çeviri aşamasını düzenli olarak noktalara taşır. 4x objektif lensi 20x ile değiştirin ve ışık yoğunluğu, zaman vesaire dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini ayarlayın.

Ardından, her odanın konumunu 13'e 15 oda matrisi bırakarak veya program tarafından otomatik olarak tanımlanacak şekilde seçim noktalarını bulun. Odaların koordinatlarının belirlenmesiyle, çeviri aşaması X, Y, Z odak düzleminin ince ayarlanabileceği her odaya taşınır. Görüntüleme döngüsünün aralığını ve süresini ayarlayın.

Yolu kaydedin ve görüntülemeye başlayın. Bu sistem, brightfield'daki nöral kök hücre farklılaşması ve nöral kök hücre küre oluşumu sürecinin floresan alanı gibi çeşitli hedef dinamik izleme için kullanılabilir. Veri analizi.

Özel MATLAB programını kullanarak nd2'deki biçimi Tif olarak değiştirin. Ve verileri puanlara göre bölün. Analiz edilecek nesne hücre veya dokudur.

Analize eşik, nesne boyutu, gürültü boyutu girin. Veya en uygun parametreler için adım adım çözümlemeyi seçebilirsiniz. Ve sonra tüm verileri analiz ediyorum.

Sonucu MAT biçiminde kaydettikten sonra, sonuçları veya izlemeleri çizmek için çizimi kullanarak. Bu yazıda, canlı hücre mikroçevrim dinamik kontrolü için fotolithografi teknolojisine dayanan yüksek verimli mikroakışkan çip sisteminin ve kültürünün protokolünü tanımladık. Pdms membran vanalarının kapanma basıncı ve sıvının odaya paralel olarak spin kontrolü gibi dikkatlice kontrol edilmesi gereken bazı parametreleri de tanımladık.

Geleneksel hücre in vitro kültüründe hücre kültürü ortamının tedavisi manuel olarak gerçekleştirilir, bu da zaman alıcıdır ve zahmetli ve sıvı dolu standart kontrol kolay değildir. Özellikle dakikalarca çözüm. Girdi üretme, bağışıklık ilaç konsantrasyonu ve büyük tüketim gibi bazı sorunlar vardır.

Bununla birlikte, mikroakışkan sistemimizi kullanarak, sabit doz tek sıvı eşit miktarda tek tip konsantrasyonda uyarıcı olarak tekrarlamak, aynı zamanda farklı kültür odalarındaki farklı kültürleri karşılaştırmak mümkündür. Bazı minyatür zamansal çözünürlük geri uyaranları ile ve sıvıyı düzenleyerek çözünürlüğü yedekleyen farklı. Buna ek olarak, sistemimiz basit işlemlerle çok sayıda karşılaştırmalı deneysel sonuç elde edebilir.

Sistemimiz difüzyon prensibine dayanır, hücresel mikroçevrimde minimum mekanik bozukluk yaratır. Daha kararlı hücresel mikroçevrim yongaları için, arabellek katmanının listesini kültür katmanının derinliği olarak artırabilir veya orta değişimin giriş sıvısını azaltabilirsiniz, yani basıncı azaltabilirsiniz, bu da hücre davranışı üzerine araştırma için burada olacaktır. Bu çalışmanın sadece 3T3 ve NSC hücrelerinin kültürünü incelediği fark edilmelidir.

Diğer hücreler veya hücre çizgileri için, kültür koşulları onu ayarlamak için parametrelerimizle karşılaştırılabilir.