4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

4D mikroskopi, C.elegans embriyosunun veya tek hücre düzeyinde başka herhangi bir örneğin tam hücre soyunu yeniden yapılandırmak için değerli bir araçtır. Nomarski optikleri, transgenik hayvanlara veya floresan mikroskobuna ihtiyaç duymadan standart bir mikroskop ve iletilen ışık ile geliştirme sırasında hücre şekli değişikliklerini vurgulamak için kullanılabilir. 4D mikroskop, C.elegans'ta ve memeliler veya doku hücre kültürü gibi diğer sistemlerde hücre döngüsünü, proliferasyonunu, farklılaşmasını ve apoptozunu incelemeye izin verir.

DIC görüntülerinde hücre kökeni izlemesi manuel olarak gerçekleştirilir. Zaman alıcıdır ve tam bir embriyo analizi yapmak için biraz pratik gerektirir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda bir teknisyen olan Begona Ezcurra olacak.

Embriyoları hazırlamadan önce, 4D mikroskobun kayıt sıcaklığını 15, 20 veya 25 santigrat dereceye ayarlayın ve mikroskobu, her yığının başlangıcı arasında 30 saniyelik aralıklarla bir mikron aralıklarla 1.500, 30 odak düzlemi z yığınını kaydedecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, 500 ila 1000 mikrolitre sıvı% 4.5 agar'ı üç milimetre cam tüpe ayırın ve kurumayı önlemek için tüpleri balmumu filmi ile dikkatlice kapatın. Kayıt için ince homojen bir agar pedi hazırlamak için, agar eriyene kadar bir alkol brülörü üzerinde dikkatlice ısıtın ve alikot yapın ve tüpü 80 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin.

Bir cam mikroskop slaytını bir plastik parçasının üzerine yerleştirin ve sürgünün ortasına küçük bir damla erimiş agar yerleştirmek için bir elinizle bir mera pipeti kullanın, ardından hemen diğer elinizi kullanarak çok ince bir agar pedi oluşturmak için agar damlasının üzerine ikinci bir slayt yerleştirin. Embriyoları monte etmek için önce bir seçici kullanarak 5 ila 10 gravid hermafroditi stereo mikroskop altında suyla dolu bir saatçi bardağına aktarın. Hermafrodit nematodlarını kesmek için bir neşter kullanın ve rahimden bir ila dört erken yumurta çıkarın.

Üst sürgüyü agar pedinin üzerinden yavaşça kaydırın ve pedin ortasına erken bir yumurta yerleştirmek için bir kılcal boru kullanın. Yumurta konumunu gerektiği gibi ayarlamak için bir kürdanın ucuna yapıştırılmış bir kirpik kullanın ve fazla suyu çıkarmak için kılcal pipeti kullanın. Agar pedini çevreleyen boşluğun 3/4'ünü suyla doldurmak için bir mikropipet kullanmadan önce, kapak fişini müstahzarın üzerine yavaşça ve eğik bir şekilde örtmek için bir neşter kullanın.

Ardından, uzun kayıt sürelerinde kurumayı önlemek için kapak fişini vazelin ile kapatın. Mühürledikten sonra, slaytı 4D mikroskop tablasına yerleştirin ve embriyoyu odaklamak için düşük büyütme objektifi kullanın. 100X daldırma hedefini seçin ve kondansatörü odaklayın.

Daha yüksek bir sayısal açıklık ve daha yüksek çözünürlük sağlamak için kondansatörün açıklığını tamamen açın ve alan diyaframını kapatın. Bir tarafta aydınlatılan embriyonun üç boyutlu bir görüntüsünü elde etmek için Wollaston prizmasını çevirin, ardından embriyonun diğer tarafta aydınlatılmasının etkisini elde etmek için prizmayı diğer yönde çevirin ve 4D kayda başlayın. 4D filmle kaydedilmiş bir embriyonun hücre soy rekonstrüksiyonu için, köken izleme yazılımını açın ve Dosya ve Yeni proje'yi seçin.

Kayıt sıcaklığına bağlı olarak uygun hücre kökeni şablonunu seçin ve tarama sayısını 1500 olarak ayarlayın. Taramalar arasındaki süre 30 saniyeye, seviye sayısı 30'a ve seviyeler arasındaki mesafe bir mikrona kadardır. Görüntü dosyasını, biçimini ve görüntülerin kaydedildiği dizini seçin.

Görüntülerin tek görüntü olarak mı yoksa çoklu görüntü z yığınları olarak mı kaydedileceğini seçin ve dosya adlandırma ve görüntü formatlarını ayarlayın. Ardından, 4D filmin uygun ışık kanallarını algılamak ve ayarlamak için Kanal işleme etkinleştirildi'ye tıklayın. Hücre kökeni izleme için, hücre kökeni izleme yazılımını başlatın.

Bir video penceresi ve hücre kökeni penceresi görünecektir. Köken penceresinde, köken dalını seçin ve video penceresinde bu hücreye karşılık gelen hücre çekirdeğine tıklayın. İlgilenilen hücreyi zaman içinde uzamsal olarak takip etmek için 4D filmi ileri, geri veya bir seviye yukarı veya aşağı oynatın.

Köken dalında bir nokta oluşturmak ve hücrenin belirli bir zamandaki uzamsal koordinatlarını kaydetmek için periyodik olarak hücre çekirdeğine tıklayın. Sonuç olarak, hücre soy ilerlemeleri ve embriyonun 3D rekonstrüksiyonları mümkündür. Ardından mitozu işaretlemek için dönüş tuşuna basın ve az önce gösterildiği gibi hücre ilerlemesini takip etmek için yavru hücrelerden birini seçin.

Tüm hücre soyunu izlemek veya apoptoz geçirenler gibi belirli ilgili hücreleri takip etmek için embriyonik hücrelerin geri kalanı için analizi tekrarlayın. İlgilenilen mutant soyların kalıplaşmış vahşi tip C.elegans hücre soyu ile karşılaştırılmasına izin vermek. Sonsuz plakalar, yoğuşmayı önlemek için karton kutular içinde inkübe edilir.

Kayıt tamamlandıktan sonra, hücre soyu, gösterildiği gibi soy izleme yazılımı kullanılarak yeniden yapılandırılabilir. Örneğin, bu temsili analizde, izlenen gsr-1 mutant embriyo hücre soyu, C.elegans vahşi tip soy ile karşılaştırıldı. Ve embriyonik gelişim sırasında hücre döngüsünde ilerleyici bir gecikmenin tespiti ortaya çıktı.

Sonuç olarak, mutant embriyolar ara aşamalarda tutuklanırken, vahşi tip embriyolar ilerledi ve sonunda larva olarak yumurtadan çıktı. Ek olarak, apoptoz gibi embriyonik gelişimin diğer önemli özellikleri, 4D mikroskopi kullanılarak dinamik olarak görselleştirilebilir. DIC görüntülerinin köken izlemesi el ile işlenmelidir.

Gelişimin erken aşamalarında görünür ışıkta işaretlenmemiş hücrelerin bir yazılım tarafından işlenmesi, embriyo analizi için doğru değildir. Görüntü tanıma sisteminin görünür ışık mikroskobu alanına uygulanması, gelişim biyolojisi alanında büyük bir ilerleme sağlayacaktır.