Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

Protokolümüz, göz içi enfeksiyonunun patogenezini ve yeni tedavi etkinliğini incelemek için mikroorganizma ve terapötik ajanların fare gözüne tekrarlanabilir bir şekilde girmesini sağlar. Tekniğimiz bir fare modelinde göz içi enfeksiyonlarının oluşturulmasını sağlar ve mikroorganizmaların sayısallaştırılmasını, konak immün yanıtları, enfeksiyona bağlı konak ve patojen gen ekspresyonunu ve yeni tedavi etkinliğini kolaylaştırır. Enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesi, iğne açısı ve teslimat bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir ve enfeksiyon parametrelerinin ölçülmesi için uygun bir göz hasadı esastır.

Bir biyogüvenlik seviyesi iki tesiste, 10 mililitrelik bir çırpıda kapak tüpüne beş mililitre BHI suyu ekleyin ve tek bir B.cereus kolonisini burgu plaka kültüründen beş mililitre et suyuna aktarmak için steril bir döngü kullanın. Kısa bir girdaptan sonra, numuneyi dakikada 200 devirde 37 santigrat derece döndürülerek 18 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, taze BHI 10 mililitre mikrolitre konsantrasyonu başına 200 koloni oluşturan birimleri kültürü seyreltmek, ve girdap sonra, buz üzerinde 1,5 mililitre mikrosentrifuge tüp için taze seyreltilmiş kültür bir mililitre ekleyin.

Intravitreal enjeksiyon için, mikroenjektör açın ve mikroenjektör bağlı basınçlı hava tankı gaz vanasını açın. Ekran Denge'yi gösterene kadar mikroenjektörde Mod'a basın. Denge tuşuna basın ve bilgisayar faresini ameliyat masasına yerleştirin.

Paslanmaz çelik pipet tutucuyu enjektördeki dolgu çıkışına bağlı boruya bağlayın ve pipet tutucu konektörünü kapitalı cam kılcal pipet ucu iğnesinin etrafına sıkıca vidalayarak kapiller iğnenin pipet tutucunun diğer ucuna yerleştirilmesini bekleyin. Oftalmik mikroskobu açın ve ışık yoğunluğunu %50'ye ayarlayın Mikroskobu işlem bölgesinin üzerine yerleştirin ve mikroskobu istenilen odakta ayarlayın. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili fareyi sol tarafına, burnu sağa dönük tıbbi alt altlara yerleştirin.

Oftalmik mikroskop hedefi ile sağ göz bulun ve enjeksiyon sitesi ortaya çıkarmak için gözün her iki tarafında ters eylem forceps maşa yerleştirin. Hazırlanan kılcal iğneyi seyreltilmiş bakteri solüsyonuyla doldurmak ve başın sol elle emniyete alınması için mikroenjektöre bağlı fareyi sol tıklatın, iğnenin ucunu, eğimli tarafı yukarı, gözün uzuvlarına yerleştirin. İğne 45 derecelik açıyla gözü delin, iğnenin keskin ucunun sadece 0,5 milimetresine takılmaya özen gösteren bir şekilde.

İğne ucu takıldıktan sonra, B.cereus çözeltisinin 0,5 mikrolitresini enjekte etmek için fare altlığı üzerinde sağdan sol elinizi kullanın. Sızıntıyı önlemek için, çıkarmadan önce fare gözünün içindeki iğne ucunu 2-3 saniye bekletin, sonra forsepsi bırakın ve göz tek başına yuvaya geri dönecektir. Fareyi tam yedek parçaya kadar izleyerek Bir ısınma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine aktarın.

Uygun deneysel uç noktada, bir etiketli proteaz inhibitörü ile desteklenen PBS 400 mikrolitre ekleyin, buz üzerinde göz başına otoklavhasat tüpü ve enfekte gözün her iki tarafında açık ince uçlu pofma yerleştirin. Gözü desteklemek için uçları başın içine doğru itin. Maşalar göz küresinin arkasına gittikten sonra maşaları birbirine sıkın ve göz küresini ayırmak için forcep'leri kafadan uzaklaştırın.

Sonra hemen uygun etiketli hasat tüpü içine göz küresi yerleştirin. Numune toplamadan sonraki 60 dakika içinde, kapalı hasat tüplerini bir doku homogenizer'ine yerleştirin ve numuneleri iki dakika homojenizasyon periyodu için homojenleştirin ve arada 30 saniyelik bir dinlenme süresi ile homojenleştirin. Homojenizasyondan sonra, numuneleri buzüzerine yerleştirin ve seyreltme başına 180 mikrolitre PBS'de numuneleri seri olarak seyreltmek için 20 mikrolitre lik homojen aliquot kullanın, ta ki negatif sekize bir kat 10'luk bir faktör ulaşıncaya kadar.

Daha sonra, uygun seyreltme konsantrasyonu ile bir kare önceden ısıtılmış BHI plaka her satır etiket ve plaka 45 derecelik bir açıyla yatırılan ile, plakanın üst kısmında tek tek satıriçine her seyreltme 10 mikrolitre ekleyin. Plakayı düz döşemeden önce her numunenin neredeyse tabağın dibine ulaşana kadar çalışmasına izin verin. Örnekler agar'a emildiğinde plakayı 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesine aktarın.

Koloniler sekiz saatlik kuluçkadan sonra görünür olmaya başlamalıdır. Örnekteki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10 ila 100 kolonisi olan satırı sayın. Bir yapmış cam iğne ucu inşaat fare gözünün orta vitreus içine bakteri teslim için önemlidir.

Bu görüntülerde, Bacillus cereus bir kan agar plaka ve et suyu kültür tüpleri üzerinde büyüyen gösterilir. Bu grafikte gösterildiği gibi beş farklı fare gözünden 10 saat post-enfeksiyon arasında 10 kez 5 ve bir kez 10 arasında yedinci koloni oluşturan bakteri birimleri genellikle tek bir enfekte göz kurtarılabilir. Bu işlemi yaparken hatırlanması gereken en önemli şey fare gözüne uygun bakteri hacmienjekte etmektir.

Bu işlemi takiben, histoloji, ELISA tarafından inflamatuar mediatörler ve bu hastalığın patogenezinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için yüksek iş yapma şekli RNA dizilimi ile gen ekspresyonu ile inflamasyonu inceleyebiliriz.