Name: Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, fare modelinde bakteriyel endoftalmit için intravitreal enjeksiyon ve enfeksiyon parametrelerinin niceliği yöntemini. Bu teknik, göz içi enfeksiyonların patogenezi ve yeni tedavi etkinliğinin incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Feng Li ve Mark Dittmar (OUHSC P30 Canlı Hayvan Görüntüleme Çekirdek, Dean A. McGee Göz Enstitüsü, Oklahoma City, Tamam, ABD) yardımları için teşekkür ederiz. Araştırmamız Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ve R01EY024140. Araştırmamız ayrıca P30EY21725 (Canlı Hayvan Görüntüleme ve Analizi, Moleküler Biyoloji ve Hücresel Görüntüleme için NIH CORE hibesi) tarafından desteklenmiştir. Araştırmamız ayrıca NEI Vision Science Pre-doctoree programı 5T32EY023202, Presbiteryen Sağlık Vakfı Araştırma Desteği hibesi ve Körlüğü Önlemek Için Araştırma'dan Dean A. McGee Göz Enstitüsü'ne sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir.

Tüm işlemler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ile Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildirim'deki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numaraları 15-103, 18-043 ve 18-087) tarafından onaylanmıştır.
1. Steril cam iğneler
<ol><li>İğne pipetçekmecesini açın.</li>
	<li>Isıtıcı tonuzunu ekran 12,6 gösterene kadar ayarlayın.</li>
	<li>Kapıyı açın ve 5 μL'lik kılcal tüpü üst kelepçe ve ısıtıcı filamenti ile borunun yarısı filamentin altına kadar elle besleyin(Şekil 1A).</li>
	<li>Kapiller tüpün üst kıskaçtaki "V" oluğunda olduğunu doğrulayın. Üst kıskacı sıkın.</li>
	<li>Alt kelepçe açıkken, alt kelepçe üst sınırına ulaşana kadar dikey kaydırağı manuel olarak ayarlayın. Tüpün alt kelepçedeki "V" oluğunda olduğunu doğrulayın. Alt kelepçeyi sıkın.</li>
	<li>Kapıyı kapatın ve 'Hazır' ışığının yandığını onaylayın. Isıtıcıyı ve çekme sırasını başlatmak için Başlat düğmesine basın (Şekil 1B).</li>
	<li>Isı ve yerçekimi kılcal tüpü ayırdıktan sonra ısıtıcının otomatik olarak kapandığından emin olun(Şekil 1C),ve slayt aşağı doğru hareket eder.</li>
	<li>Kapıyı aç. Kılcal tüpün üst kısmını tutarken, üst kelepçeyi sıkın. Üst kılcal tüpü çıkarın ve bir kenara koyun.</li>
	<li>Kılcal tüpü alt kaydırakta tutun ve alt kelepçeyi sıkın. Alt kılcal tüpü çıkarın ve bir kenara koyun.</li>
	<li>Enjeksiyon iğneleri oluşturmak için çekilen kılcal tüp eve yontmak için 0,05 μm alümina aşındırıcı taşlama plakası ile bir mikroelektrot beveler kullanın.</li>
	<li>Pipet, yüzeyi kaplayacak kadar öğütme plakasına yeteri kadar su(Şekil 1D).</li>
	<li>60 rpm'de dönmeye başlayacak şekilde yaveller'ı açın. Çekilen kılcal tüpü "V" oluğundaki pipet kıskaçına yerleştirin. Kelepçeyi sıkın ve pipet kelepçesinin açısını 30°'ye ayarlayın.</li>
	<li>Kapiller tüpün sivri ucunu, öğütme plakasının dönme merkezinden yaklaşık üçte iki uzaklıkta ayarlayın.</li>
	<li>Manipülatörün üst kısmındaki kaba kontrol topuzunu ayarlayarak kenetlenmiş kılcal tüpü düşürün. Kılcal tüpün ucu su yüzeyinin altına kadar uzananve taşlama plakasının aşındırıcı yüzeyine temas edene kadar kılcal tüpü indirmeye devam edin.</li>
	<li>Beveller bağlı mikroskop kullanarak beveling ilerleme izleyin. 5 dakika sonra, taşlama plakası cam iğne yükseltmek için ince kontrol ayarlayın.</li>
	<li>Cam iğneyi çıkarın ve kılcal tüpün ucunu kontrol etmek için 10x büyütmenin altına yerleştirin(Şekil 1E,F).</li>
	<li>Tıkanıklık olmadığından emin olmak için, cam iğneyi bir şırınga üzerindeki pipet tutucuya yerleştirin ve havayı %99 etanoliçeren 1 mL'lik bir tüpe itin. İğnenin ucunda hava kabarcıkları oluşursa, iğnede tıkanıklık yoktur ve mikroenjeksiyon için kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda cam iğnelerin sterilitesini de sağlar.</li>
	<li>Bir kılcal tüp 5 μL sıvı kadar tutabilir. 0,5 μL hacimleri için işaretlemek için iğne üzerindeki mesafeleri hesaplamak için kılcal tüpü 10 bölüme işaretleyin. Gelecekteki hazırlık için 0,5 μL tutan bu mesafeye sahip bir ölçek işaretleyin. 5 μL iğne için, 0,7 mm arayla mesafeler 0,5 μL 'ye eşittir (Şekil 1G).</li>
</ol>2. Bacillus cereus kültürü
<ol><li>Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.</li>
	<li>B. cereus ATCC 14579'un %5 koyun kanı agar plakası üzerinde tek koloni izolasyonu için seri dondurucu stoku ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırılamıştır(Şekil 2A).</li>
	<li>Pipet 5 mL steril Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) 10 mL steril snap-cap tüp içine et suyu(Şekil 2B). Steril bir döngü veya iğne kullanarak, agar plakab.</li>
	<li>Kısa bir süre örneği girdap. Snap-cap tüpünü dönen bir kuluçka makinesine yerleştirin. Sıcaklığı 37 °C'ye ve hızı 200 rpm'ye ayarlayın. 18 saat sonra, kuvözden kültürü çıkarın (Şekil 2B).</li>
</ol>3. Intravitreal enjeksiyon için bakteriyel seyreltme
<ol><li>Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.</li>
	<li>Mikrolitre başına 200 koloni şekillendirme birimi (CFU/μL) elde etmek için bir gecede B. cereus kültürünün hacmini hesaplayın ve 10 mL taze BHI ekleyin. Örneğin, BHI'deki B. cereus'un bir gecede kültürü yaklaşık 2 x 108 CFU/mL'ye kopyalanır ve bu kültür 10 μL'lik gece kültürünü n10 mL taze BHI'ye boruhaline getirerek 200 CFU/μL'ye seyreltilebilir.</li>
	<li>Yeni seyreltilmiş kültürün pipet 1 mL'si 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dönüştürülme. Intravitreal enjeksiyon kadar buz üzerinde bu tüp koruyun. Bakteri kültürünü seyreltme 60 dakika içinde intravitreal enjeksiyon gerçekleştirin.</li>
</ol>4. Fare intravitreal enjeksiyon
<ol><li>Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.</li>
	<li>Ameliyat masasına tıbbi altlıklar yerleştirerek prosedür sitesini hazırlayın.</li>
	<li>Mikroenjektörü açın ve mikroenjektöre bağlı basınçlı hava tankıüzerindeki gaz vanasını açın. Gaz teslimatı yaklaşık 60 psi olana kadar tank regülatörü ayarlayın.</li>
	<li>Mikroenjektörde, ekran Denge'yigösterene kadar Mod'a basın. Denge tuşuna basın ve bilgisayar faresini ameliyat masasına yerleştirin. Paslanmaz çelik pipet tutucuyu enjektörün 'Dolgu/Çıkış' ekindeki boruya bağlayın. Bu tüp her zaman enjektöre bağlıdır.</li>
	<li>Kapiller iğneyi pipet tutucunun diğer ucuna, pipet tutucunun ucunu iğnenin etrafına sıkı vidalayarak yerleştirin.</li>
	<li>Oftalmik mikroskobu açın ve ışığını %50'lik bir yoğunluğa çevirin. Mikroskobu ameliyat masasındaki işlem alanı üzerinde ayarlayın ve mikroskobu istenilen odakta ayarlayın.</li>
	<li>İşlem başlamadan önce, pedal çekme refleksini test ederek farenin yeterince anestezi yediğini doğrulayın. Anestezi için IACUC onaylı protokolünüze uyun.</li>
	<li>Anestezili fareyi, burnu sağa dönük ve sol tarafına yaslanmış tıbbi alt altlara yerleştirin.</li>
	<li>Farz mikroskop tan farenin sağ gözüne bakın ve enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için gözün her iki tarafındaki ters hareket terlerinin maşalarını açarak kapakları açın(Şekil 3C).</li>
	<li>Kapiller iğneyi mikroenjektöre bağlı fare altlığı sola tıklayarak 200 CFU/μL seyreltme ile doldurun(Şekil 3D).</li>
	<li>Sol elile hayvanın başını sabitve göz limbus iğne ucu yerleştirin. İğne yukarı konumda ve 45° açıyla fare gözünü delin, ancak enjekte ederken iğnenin sadece keskin ucunun (~0,5 mm) takıldığından emin olun.</li>
	<li>İğne ucu yerleştirildikten sonra sol elinizi fare başından fare altağına taşıyın ve B. cereus seyreltme 0,5 μL'lik enjekte etmek için fare altlığı sağ tıklayın. Sızıntıyı önlemek için, çıkarmadan önce fare gözü içinde iğne ucu bırakın 2-3 saniye (Şekil 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.</li>
	<li>Forceps bırakın ve bir ısınma pedüzerinde oturan bir kafes içine fare yerleştirin. Bu fareleri anesteziden iyileşene kadar izleyin(Şekil 3F).</li>
	<li>Fareler anesteziden kurtarıldıktan sonra kafesi uygun rafına geri getirin. Eğer fareler elektroretinografi ile retina fonksiyon analizine tabi tutulacaksa, kafesler uygun karanlık adaptasyon için karanlık bir odaya iade edilmelidir.</li>
</ol>5. Hasat tüpü hazırlama
<ol><li>1 mm steril cam boncukları 1,5 mL vidalı kapak tüplerine yerleştirin.</li>
	<li>Kuru bir ortamda bir otoklav bu tüpler sterilize. Tüpleri kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın.</li>
	<li>Steril 15 mL santrifüj tüpüne 10 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.</li>
	<li>Tüpün içine 1 tablet proteaz inhibitörü kokteyl tableti ekleyin. Girdap tarafından karıştırın19,27,29,34,35.</li>
	<li>Pipet 400 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) her otoklav hasat tüpü içine proteaz inhibitörü içeren. Tüpleri etiketle ve buza yerleştirin. (Şekil 4A).</li>
</ol>6. Gözleri hasat
<ol><li>Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.</li>
	<li>CO2 inhalasyonu ile fareyi ötenazi. Ötenaziyi doğrulamak için ikincil bir yöntem kullanın.</li>
	<li>Ötenazili fare kafasını güvenli tutun ve enfekte gözün her iki tarafındaki ince uç terpelerini açın. Gözü itmek için baş doğru itin. Maşalar göz küresinin arkasına bir kez geldikten sonra maşaları birbirine sıkın. Göz küresini ayırmak için forceps'u kafadan çekin (Şekil 4B).</li>
	<li>Hemen etiketli bir hasat tüpü içine göz küresi yerleştirin. Tüpleri en fazla 60 dk buza yerleştirin(Şekil 4C).</li>
</ol>7. Göz içi bakteri sayısı
<ol><li>Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm hasat tüplerinin sıkıca kapalı olduğunu ve doku homogenizer'indeyken dengeli olduğunu doğrulayın(Şekil 5A). Örnekleri homojenize etmek için 1 dakika boyunca doku homogenizer açın. 30'ları bekleyin, sonra bir dakika daha açın. Tüpleri buz üzerine yerleştirin (Şekil 5B,C).</li>
	<li>Homojenin 20 μL'sini 180 μL steril 1x PBS'ye sırayla aktararak her numuneyi 10 kat seyreltin. 10-7 faktörüne ulaşılına kadar seyreltin (Şekil 5D).</li>
	<li>Uygun seyreltme faktörleri ile sıcak, kare BHI plaka her satır etiket. Her seyreltmenin 10 μL'sini üst üste yaklaşık 45°'lik eğik olan üst BHI plakasına aktarın. Numuneneredeyse plakanın altına ulaşana kadar çalıştırın, sonra plakayı düz olarak yerleştirin (Şekil 5E)39.</li>
	<li>Numune BHI agar'a emildiğinde plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın. Koloniler kuvöze yerleştirildikten sonra 8 saat görünür olmaya başlamalıdır.</li>
	<li>B. sereüs kolonilerinin büyümesi bireysel kolonilerin tanımlanmasına engel olmadan önce plakayı kuvözden çıkarın(Şekil 5F).</li>
	<li>Örnekteki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10-100 kolonileri arasında olan satırı sayın. Örneğin, 45 kolonisi olan 10-4 seyreltme fraksiyonu olan bir satır 4,5 x 105 CFU/mL konsantrasyonuna sahip olacaktır.</li>
	<li>Göz başına toplam bakteri sayısını hesaplamak için, gözü homojenize etmek için kullanılan 1x PBS mililitre hacmini temsil eden konsantrasyonu 0,4 ile çarpın. Örneğin, 4.5 x 105 CFU/mL konsantrasyonu 1.8 x 105 CFU B. göz başına cereus çevirir.</li>
</ol>8. Örneklerin korunması
<ol><li>Homojen örnekleri etiketli bir dondurucu kutusuna yerleştirin ve bu kutuyu -80 °C'lik bir derin dondurucuya yerleştirin. Bu örnekler daha sonra ELISA tarafından inflamatuar mediator analizi için kullanılabilir.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak mali bir çatışmaları yok.

Güçlü antibiyotikler, anti-inflamatuar ilaçlar ve vitrektomi cerrahisi durumu bile, bakteriyel endofalmit bir hasta kör olabilir. Klinik çalışmalar endofalmit in incelenmesinde yararlı olmuştur; ancak, endoftalmit deneysel modelleri, bakım standardında ilerlemeye çevrilebilen hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bu da hastalar için daha iyi görsel sonuçlar sağlar.
Fare gözünün vitreus hacmi yaklaşık 7 μL40'tır. Bu küçük hacim sadece sınırlı miktarda malzemenin en...

Bakteriyel endoftalmit inflamasyona neden olan yıkıcı bir enfeksiyondur, ve, düzgün tedavi edilmezse, görme veya körlük kaybına neden olabilir. Endophthalmitis göz iç içine bakteri girişi sonuçları1,2,3,4,5. Bir kez göz, bakteri çoğaltmak, toksinler ve diğer zararlı faktörler üretmek, ve hassas retina hücreleri ve dokularda geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Göz hasarı da inflamasyon neden olabilir, göz iç içine inflamatuar hücre akını yol açan inflamatuar yolların aktivasyonu nedeniyle1,5,6. Endophthalmitis göz içi cerrahisi (post-operatif), göz (post-travmatik) bir delici yaralanma, ya da farklı bir anatomik siteden göze bakterilerin metastatik yayılması (endojen)7,8,9,10aşağıdaki oluşabilir. Bakteriyel endoftalmit için tedaviler antibiyotikler içerir, anti-inflamatuar ilaçlar, veya cerrahi müdahale3,4,11. Bu tedaviler bile, görme veya göz kendisi kaybolabilir. Bakteriyel endoftalmit sonrası görsel prognoz genellikle tedavi nin etkinliğine, sunumdaki görme keskinliğine ve enfekte organizmanın virülansına bağlı olarak değişir.
Bacillus cereus (B. cereus)travma sonrası endoftalmit 7,12neden olan başlıca bakteriyel patojenlerden biridir. B. cereus endophthalmitis olgularının çoğunda hızlı bir seyir izlenir ve bu da birkaç gün içinde körlüğe neden olabilir. B. cereus endophthalmitis özellikleri hızla gelişen göz içi iltihabı, göz ağrısı, görme keskinliği hızlı kaybı, ve ateş içerir. B. sereus yaygın göz enfeksiyonları 2 neden diğer bakterilere göre gözde hızla büyür2,4,12 ve birçok virülans faktörleri sahip. Bu nedenle, başarılı terapötik müdahale için pencere nispeten kısa1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Bu enfeksiyon için tedaviler genellikle diğer daha az öldürücü patojenlerin neden olduğu endophthalmitis tedavisinde başarılı, ancak B. cereus endophthalmitis genellikle önemli görme kaybı muzdarip hastaların% 70'inden fazla sonuçlanır. Buhastaların yaklaşık% 50 enfekte göz7,16,22,23evisceration veya enükleasyon geçmesi . B. cereus endophthalmitis yıkıcı ve hızlı doğası acil ve uygun tedavi için çağırır. Hastalık gelişiminin altında yatan mekanizmaların ayırt son ilerleme müdahale için potansiyel hedefler tespit ettik19,26,27. B. cereus endophthalmitis deneysel fare modelleri enfeksiyon mekanizmaları ayırt ve görme kaybını önleyebilir potansiyel terapötik test yararlı olmaya devam etmektedir.
B. cereus ile farelerin deneysel göz içi enfeksiyonu bakteriyel ve konak faktörleri anlamak için araçsal bir model olmuştur, yanı sıra etkileşimleri, endoftalmit sırasında28. Bu model, bir yaralanma sırasında bakterilerin göze sokulan post-travmatik veya postoperatif bir olayı taklit eder. Bu model son derece tekrarlanabilir ve deneysel tedavilertest etmek ve bakım standart iyileştirmeler için veri sağlamak için yararlı olmuştur1,6,19,29,30. Diğer birçok enfeksiyon modeli gibi, bu model enfeksiyon birçok parametre bağımsız kontrol sağlar ve enfeksiyon sonuçlarının verimli ve tekrarlanabilir incelenmesini sağlar. Son birkaç on yıl içinde tavşan benzer bir model çalışmaları gözde B. cereus virülans faktörlerin etkilerini inceledik2,4,13,14,31. B. cereus mutant suşları bireysel veya birden fazla virülans faktörleri eksik enjekte ederek, hastalık şiddetine bu virülans faktörlerin katkısı postenfeksiyon farklı saatlerde bakteri konsantrasyonu veya görsel fonksiyon kaybı13,14,27,31,32gibi sonuçlar ile ölçülebilir. Buna ek olarak, host faktörler belirli inflamatuar konak faktörleri26,29,33,34,35eksik nakavt fare suşları enfekte tarafından bu modelde incelenmiştir . Model aynı zamanda enfeksiyon dan sonra göze yeni bileşikler enjekte ederek bu hastalık için potansiyel tedavileri test etmek için yararlıdır30,36. Bu yazıda, bir fare gözünü B. cereusile enfekte etmeyi, enfeksiyon sonrası gözü niçin hasat etmeyi, göz içi bakteri yükünü nisbeten ölçmeyi ve hastalığın şiddetinin ek parametrelerini test etmek için numunelerin korunmasını içeren ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>2-20 ve mikro; L pipet</td><td>RANIN</td><td>L0696003G</td><td>NA</td></tr><tr><td>37oC İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bacto Beyin Kalp İnfüzyonu</td><td>BD</td><td>90003-032</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hücre Mikroenjektörü</td><td>MicroData Instrument, Inc.</td><td>PM2000</td><td>NA</td></tr><tr><td>İnce uçlu forseps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cam boncuklar 1.0 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079110</td><td>NA</td></tr><tr><td>İnkübatör Çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>NB-I2400</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikrokapiler Pipetler 5</td><td>Mikrolitre Kimble</td><td>71900-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikro Pipet Beveler</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>NA Mikroskop, Axiostar Plus</td>, <td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikroskop, OPMI Lumera</td><td>, Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td>, <td>BioSpec</td><td>Model 607</td>, <td>NA</td></tr><tr><td>Çok Kanallı pipet, 30-300 ve mikro; L</td><td>Biohit</td><td>15626090</td><td>NA</td></tr><tr><td>Çok Kanallı pipet 5-100 & mikro; L</td><td>Biohit</td><td>9143724</td><td>NA</td></tr><tr><td>İğne / Pipet Çektirme Kopf</td><td></td><td>730</td><td>NA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td></td> 1897315 <td>Moleküler dereceli</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Moleküler sınıf</td></tr><tr><td>Ters etkili forseps</td><td>Katena</td><td>K5-8228</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

bakteriyel endoftalmitin fare modelinde İntravitreal enjeksiyon ve enfeksiyon parametrelerinin niceliği

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

Göz içi bakteriyel enfeksiyonlar görme için bir tehlike vardır. Araştırmacılar, uygun terapötik hedefleri belirlemek ve körlüğü önlemek için ilaçları test etmek için, konak ve bakteriyel faktörleri ve enfeksiyonla ilişkili bağışıklık yanıt yollarını araştırmak için hayvan modellerini kullanırlar. Intravitreal enjeksiyon tekniği organizmalar, ilaçlar veya diğer maddeler doğrudan gözün arka segmentinde vitreus kavite içine enjekte etmek için kullanılır. Burada, fare gözüne enfeksiyonu başlatmak için bu enjeksiyon tekniğini ve göz içi bakterileri ölçme tekniğini gösterdik. Bacillus cereus beyin kalp infüzyon sıvı ortamda 18 saat boyunca büyüdü ve bir konsantrasyon 100 koloni oluşturan birimleri (CFU)/0.5 μL için yeniden askıya alındı. Bir C57BL/6J fare ketamin ve ksilazin kombinasyonu kullanılarak anestezi edildi. Pikolitre mikroenjektör ve cam kılcal iğneler kullanılarak Fare gözünün orta vitreusuna Bacillus süspansiyonunun 0.5°L'si enjekte edildi. Kontralateral kontrol gözüne steril ortam (cerrahi kontrol) enjekte edildi ya da enjekte edilmedi (mutlak kontrol). Enfeksiyon sonrası 10 saat fareler ötenazi yapıldı ve gözler steril cerrahi cımbız kullanılarak hasat edildi ve 400 μL steril PBS ve 1 mm steril cam boncuk içeren bir tüpiçine yerleştirildi. ELISA veya miyeloperoksidaz tahlilleri için tüplere proteinaz inhibitörü eklenmiştir. RNA ekstraksiyonu için uygun lisis arabelleği eklendi. Gözler bir doku homogenizer 1-2 dakika homojenize edildi. Homojenatlar PBS'de 10 kat seri olarak seyreltildi ve agar plakaları üzerine seyreltildi. Homojenlerin geri kalanı ek tahliller için -80 °C'de saklandı. Plakalar 24 saat boyunca kuluçkaya yatırıldı ve göz başına CFU ölçüldü. Bu teknikler fare gözlerinde tekrarlanabilir enfeksiyonlara neden olur ve canlı bakterilerin nicelliğini kolaylaştırır, konak immün yanıt, konak ve bakteriyel gen ekspresyonunun omikleri.

Tekrarlanabilir bir inokül ve intravitreal enjeksiyon prosedürüdoğruluğu üreten mikrobiyal endoftalmit modelleri geliştirmede önemli adımlardır. Burada, Gram-pozitif Bacillus cereuskullanarak intravitreal enjeksiyon prosedürü gösterdi. Beş C57BL6 farenin orta vitreusuna 100 CFU/0.5 μL B. sereus enjekte ettik. 10 saat sonrası enfeksiyon sonrası B. sereus'un göz içi büyümesini yaklaşık 1.8 x 105 CFU/göz olarak gözlemledik. Şekil 1, bakterileri fare gözleri...

Burada bakteriyel endoftalmitin fare modelinde intravitreal enjeksiyon ve sonraki bakteriyel nicel bir yöntem tanımladık. Bu protokol, konak bağışıklık yanıtlarını ve bakteriyel ve konak gen ekspresyonunu ölçmek için genişletilebilir.

Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

Intraocular bacterial infections are a danger to the vision. Researchers use animal models to investigate the host and bacterial factors and immune ...

Protokolümüz, göz içi enfeksiyonunun patogenezini ve yeni tedavi etkinliğini incelemek için mikroorganizma ve terapötik ajanların fare gözüne tekrarlanabilir bir şekilde girmesini sağlar. Tekniğimiz bir fare modelinde göz içi enfeksiyonlarının oluşturulmasını sağlar ve mikroorganizmaların sayısallaştırılmasını, konak immün yanıtları, enfeksiyona bağlı konak ve patojen gen ekspresyonunu ve yeni tedavi etkinliğini kolaylaştırır. Enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesi, iğne açısı ve teslimat bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir ve enfeksiyon parametrelerinin ölçülmesi için uygun bir göz hasadı esastır.Bir biyogüvenlik seviyesi iki tesiste, 10 mililitrelik bir çırpıda kapak tüpüne beş mililitre BHI suyu ekleyin ve tek bir B.cereus kolonisini burgu plaka kültüründen beş mililitre et suyuna aktarmak için steril bir döngü kullanın. Kısa bir girdaptan sonra, numuneyi dakikada 200 devirde 37 santigrat derece döndürülerek 18 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, taze BHI 10 mililitre mikrolitre konsantrasyonu başına 200 koloni oluşturan birimleri kültürü seyreltmek, ve girdap sonra, buz üzerinde 1,5 mililitre mikrosentrifuge tüp için taze seyreltilmiş kültür bir mililitre ekleyin.Intravitreal enjeksiyon için, mikroenjektör açın ve mikroenjektör bağlı basınçlı hava tankı gaz vanasını açın. Ekran Denge'yi gösterene kadar mikroenjektörde Mod'a basın. Denge tuşuna basın ve bilgisayar faresini ameliyat masasına yerleştirin.Paslanmaz çelik pipet tutucuyu enjektördeki dolgu çıkışına bağlı boruya bağlayın ve pipet tutucu konektörünü kapitalı cam kılcal pipet ucu iğnesinin etrafına sıkıca vidalayarak kapiller iğnenin pipet tutucunun diğer ucuna yerleştirilmesini bekleyin. Oftalmik mikroskobu açın ve ışık yoğunluğunu %50'ye ayarlayın Mikroskobu işlem bölgesinin üzerine yerleştirin ve mikroskobu istenilen odakta ayarlayın. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili fareyi sol tarafına, burnu sağa dönük tıbbi alt altlara yerleştirin.Oftalmik mikroskop hedefi ile sağ göz bulun ve enjeksiyon sitesi ortaya çıkarmak için gözün her iki tarafında ters eylem forceps maşa yerleştirin. Hazırlanan kılcal iğneyi seyreltilmiş bakteri solüsyonuyla doldurmak ve başın sol elle emniyete alınması için mikroenjektöre bağlı fareyi sol tıklatın, iğnenin ucunu, eğimli tarafı yukarı, gözün uzuvlarına yerleştirin. İğne 45 derecelik açıyla gözü delin, iğnenin keskin ucunun sadece 0,5 milimetresine takılmaya özen gösteren bir şekilde.İğne ucu takıldıktan sonra, B.cereus çözeltisinin 0,5 mikrolitresini enjekte etmek için fare altlığı üzerinde sağdan sol elinizi kullanın. Sızıntıyı önlemek için, çıkarmadan önce fare gözünün içindeki iğne ucunu 2-3 saniye bekletin, sonra forsepsi bırakın ve göz tek başına yuvaya geri dönecektir. Fareyi tam yedek parçaya kadar izleyerek Bir ısınma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine aktarın.Uygun deneysel uç noktada, bir etiketli proteaz inhibitörü ile desteklenen PBS 400 mikrolitre ekleyin, buz üzerinde göz başına otoklavhasat tüpü ve enfekte gözün her iki tarafında açık ince uçlu pofma yerleştirin. Gözü desteklemek için uçları başın içine doğru itin. Maşalar göz küresinin arkasına gittikten sonra maşaları birbirine sıkın ve göz küresini ayırmak için forcep'leri kafadan uzaklaştırın.Sonra hemen uygun etiketli hasat tüpü içine göz küresi yerleştirin. Numune toplamadan sonraki 60 dakika içinde, kapalı hasat tüplerini bir doku homogenizer'ine yerleştirin ve numuneleri iki dakika homojenizasyon periyodu için homojenleştirin ve arada 30 saniyelik bir dinlenme süresi ile homojenleştirin. Homojenizasyondan sonra, numuneleri buzüzerine yerleştirin ve seyreltme başına 180 mikrolitre PBS'de numuneleri seri olarak seyreltmek için 20 mikrolitre lik homojen aliquot kullanın, ta ki negatif sekize bir kat 10'luk bir faktör ulaşıncaya kadar.Daha sonra, uygun seyreltme konsantrasyonu ile bir kare önceden ısıtılmış BHI plaka her satır etiket ve plaka 45 derecelik bir açıyla yatırılan ile, plakanın üst kısmında tek tek satıriçine her seyreltme 10 mikrolitre ekleyin. Plakayı düz döşemeden önce her numunenin neredeyse tabağın dibine ulaşana kadar çalışmasına izin verin. Örnekler agar'a emildiğinde plakayı 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesine aktarın.Koloniler sekiz saatlik kuluçkadan sonra görünür olmaya başlamalıdır. Örnekteki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10 ila 100 kolonisi olan satırı sayın. Bir yapmış cam iğne ucu inşaat fare gözünün orta vitreus içine bakteri teslim için önemlidir.Bu görüntülerde, Bacillus cereus bir kan agar plaka ve et suyu kültür tüpleri üzerinde büyüyen gösterilir. Bu grafikte gösterildiği gibi beş farklı fare gözünden 10 saat post-enfeksiyon arasında 10 kez 5 ve bir kez 10 arasında yedinci koloni oluşturan bakteri birimleri genellikle tek bir enfekte göz kurtarılabilir. Bu işlemi yaparken hatırlanması gereken en önemli şey fare gözüne uygun bakteri hacmienjekte etmektir.Bu işlemi takiben, histoloji, ELISA tarafından inflamatuar mediatörler ve bu hastalığın patogenezinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için yüksek iş yapma şekli RNA dizilimi ile gen ekspresyonu ile inflamasyonu inceleyebiliriz.

intravitreal-injection-quantitation-infection-parameters-mouse-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, göze intravitreal bir bakteri süspansiyonu enjeksiyonu yoluyla bakteriyel endoftalmiyi (gözün vitreus boşluğuna bakteri istilasından kaynaklanan bir göz içi enfeksiyonu) taklit eden bir fare modeli oluşturma yöntemi açıklanmaktadır. Bu fare modeli, hastalık mekanizmasını incelemeye ve bunun için terapötikleri değerlendirmeye yardımcı olur.

Bakteriyel Endoftalmi Fare Modeli: Farenin Gözüne İntravitreal Bakteriyel Süspansiyon Enjeksiyonu Yoluyla Bakteriyel Endoftalmi Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, Bacillus cereus'un neden olduğu bakteriyel endoftalminin bir fare modelinden elde edilen göz homojenatlarından bakteriyel enfeksiyonun ölçülmesi tekniği açıklanmaktadır. Bu teknik, murin modellerinde konak bağışıklık tepkisini ve bunun konakçıya ve oküler bakteriyel gen ekspresyonuna bağımlılığını incelemeye yardımcı olur.

Bakteriyel Enfeksiyon Kantitasyon Testi: Bakteriyel Endoftalmilerin Fare Modelinde Göz İçi Bakteri Yükünü Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, bulaşıcı sonrası üveiti incelemek için hazırlanmış mikobakteriyel üveitin (PMU) bir fare modelini oluşturma yöntemini gösterir. Daha önce aynı immünojen ile aşılanmış bir farede ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis'in intravitreal enjeksiyonu ile PMU'nun indüksiyonu üzerine, gözdeki kronik inflamasyonun ilerlemesi görüntüleme ve histopatolojik inceleme kullanılarak analiz...

Post-enfeksiyöz üveiti incelemek için astarlanmış mikobakteriyel üveitin bir murin modeli

Bu video, bir fare enfeksiyöz üveit fare modelinde göz iltihabını tespit etmek ve ölçmek için in vivo bir görüntüleme tekniğini göstermektedir. Optik koherens tomografi (OCT) olarak bilinen teknik, hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için gözün yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntülerini üretir.

Bir Fare Modelinde Üveiti Değerlendirmek için Optik Koherens Tomografi Görüntüleme

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Kaynak: Park, S. W., et al. Farelerde Gen Tedavisi için Viral Vektörlerin Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyonu Retinal Pigment Epiteli. J. Vis. Uzm. (2015)Video, bir fare modelinde viral vektörlerin retina pigment epiteline (RPE) subretinal enjeksiyonu için yöntemi açıklamaktadır. Anestezi ve göz hazırlığından hassas lentiviral vektör dağıtımına kadar prosedürü detaylandırarak RPE'de gen entegrasyonunu ve ekspresyonunu sağlar.

Bir Fare Modelinde Viral Vektörlerin Retina Pigment Epiteline Subretinal Enjeksiyonu

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu yazıda, araştırmacının göz içi üveitinin fare modelini oluşturmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz. Daha yaygın olarak deneysel otoimmün üveit (EAU) olarak adlandırılan bu yerleşik model, insan hastalığının birçok yönünü yakalar. Burada, birkaç okuma kullanarak hastalığın ilerlemesinin nasıl indükleneceğini ve izleneceğini açıklayacağız.

Deneysel Otoimmün Üveit: Göz İçi İnflamatuar Bir Fare Modeli

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Bu protokol, farelerde Astarlı Mikobakteriyel Üveit'i (PMU) indükleme adımlarını özetlemektedir. Bu yöntem, fare modeli sisteminde güvenilir ve sağlam oküler inflamasyon üretmeye yardımcı olacak adımları özetlemektedir. Bu protokolü kullanarak, immünolojik, transkriptomik ve proteomik tahlillerle daha ileri değerlendirme için tek hayvanlardan uveitik gözler ve iltihapsız diğer gözler ürettik.

Post-Enfeksiyöz Üveit için Bir Model Olarak Astarlanmış Mikobakteriyel Üveit (PMU)

Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.

Murine Retina'da AAV Transdüksiyon Verimliliğinin Nicelleştirilmesi için Dijital Damlacık PCR Yöntemi

Öğrenin, fare modelinde bakteriyel endoftalmit için intravitreal enjeksiyon ve enfeksiyon parametrelerinin niceliği yöntemini. Bu teknik, göz içi enfeksiyonların patogenezi ve yeni tedavi etkinliğinin incelenmesine olanak tanır.

Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

Daha fazla video keşfet