Murine Modelinde Miyokard İnfarktüsünden Sonra MSC Yüklemeli Enjekte Edilebilir Hidrojellerin intramiyokardiyal Transplantasyonu

Bu yöntem, enfarktüslü kalplerde nakledilen hücrelerin düşük retansiyonu ve hayatta kalması için düşük uygulanabilirlik gibi mevcut kötüleşen kardiyak tedavideki temel sorunların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu sorunu ele almak için, bu yöntem, miyokard infraksiyonundan sonra kardiyak doku onarımını ve rejenerasyonunu araştırmak için mükemmel bir platform olan bir murin modelinde enjekte edilebilir hidrojeller kullanarak kök hücrelerle intramiyokard naklini incelemek için güvenilir bir teknik sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in-situ çapraz bağ örtülü enjekte edilebilir hidrojeller kullanılarak intramiyokard transplantasyonu sonrası nakledilen kök hücrelerin tutulmasını ve sağkalımını iyileştirmek için uygun bir yöntem olmasıdır.

Bu hidrojeller, sadece kök hücrelerin değil, aynı zamanda büyüme faktörlerinin, genetik materyallerin ve enfarktüslü kalp dokularındaki terapötik etkilerini en üst düzeye çıkarmak için ilaçların verilmesi gibi kalp dokusu mühendisliği için çeşitli fırsatlar sunar. İn vitro deney prosedürünü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma teknolojisi uzmanı olan Eunmi Lee olacak. Eun-Hye Park ve Eunhwa Seong araştırma teknolojisi uzmanları, in-vivo deneyler için prosedürü gösterecekler.

Mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri 100 milimetrelik bir kültür kabında 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, tabağı DPBS ile iki kez yıkayın ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede bir mililitre tripsin ikamesi ile inkübe edin. Daha sonra hücrelere dokuz mililitre kültür ortamı ekleyin ve bunları üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.

Elde edilen süpernatanı atın. Hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi ile seyreltin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.

MSC'leri mililitrede 10 ila yedinci hücrelerin bir katı yoğunluğa yeniden süspanse edin ve bunları bir mililitrelik bir tüpe aktarın. PBS'de% 6.25 GH'lik bir konjuge çözelti hazırlayın ve iki şişeye ayırın. Daha sonra GH çözeltilerini mililitre HRP başına altı mikrogram veya% 0.07 hidrojen peroksit ile karıştırın.

Hücre süspansiyonunu 1000 kez G'de kısaca santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı dikkatlice aspire edin. Daha sonra hücre peletini GH çözeltisi A ile karıştırın. MSC'leri GH çözeltisi A ve GH çözeltisi B'ye çift şırınganın her iki tarafına yükleyin. Kombine GH çözeltilerinin 300 mikrolitresini, mililitre başına 5 milyon hücrelik bir nihai yoğunlukta MSC'lerle sekiz kuyulu bir odacıklı slayt üzerine yerleştirin.

Yerinde hidrojel oluşumu ve ardından enzimatik çapraz bağlama yoluyla MSC kapsüllemesinden sonra, %10 FBS ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyon içeren 700 mikrolitre DMEM ekleyin. Slaytı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Ameliyattan önce, epilasyon kremi kullanarak fare göğsünü boşaltın ve cildi iyotla sterilize edin.

Fareyi bir ameliyat masasına yerleştirin ve mekanik ventilasyon yoluyla ek oksijen sağlamak için trakeaya bir kateter yerleştirerek entübe edin. Cerrahi makas kullanarak cildi nazikçe kesin. Daha sonra mikro makasla interkostal kaslara nüfuz edin.

Açık göğüs boşluğunu korumak için ikinci ve üçüncü sol kaburgaları 5-O ipek sütür kullanarak ayırın. Sol ön inen koroner arteri 8-0'lık bir iğne tutucu kullanarak dikkatlice bağlayın. polipropilen sütür ve elektrokoter kullanarak sütürü kesin. Ön sol ventrikül duvarında ani bir renk değişikliği gözlemleyin.

Miyokard enfarktüsünü indükledikten sonra, enfarktüs sınır bölgesindeki iki farklı noktaya 10 mikrolitre MSC yükleme GH solüsyonu enjekte edin. Açılan göğüs boşluğunu eski haline getirin ve 5-0 dikiş kullanarak kasları ve cildi kapatın. Trakeal tüpü çıkarın ve kurtarma sırasında fareyi kızılötesi lambanın altındaki bir kafese yerleştirin.

Kardiyak duvar kalınlığı, oda boyutu ve fraksiyonel kısalma elde etmek için bir ekokardiyografi yapın ve LV ön duvarı, LV iç duvarı ve LV arka duvarı için karşılık gelen çizgileri ölçün. İn vivo transplantasyondan önce, GH hidrajellerinde MSC'lerin proliferasyonu ve sağkalımı, 3D in vitro canlı ölü hücre boyama testi ile doğrulandı. Temsili görüntüler, GH hidrojelleri içindeki dallı ağları gösteren yeterli MSC proliferasyonu sergiledi.

MSC'lerin kapsamlı bir çok hücreli 3D yapısı 14. günde açıkça gözlendi, bu da GH hidrojellerinin kapsüllenmiş hücreler için uygun bir mikro ortam sağlayabileceğini gösteriyor. Miyokard infarktüsünün indüksiyonundan sonra, MSC yüklemeli GH hidrojeller intramiyokardiyal olarak peri-enfarktüs bölgelerine nakledildi. MSC'ler ve jel, enfarktüslü bölge içinde uygun şekilde sürdürüldü.

MSC'ler GH hidrojellere iyi bir şekilde entegre edildi. MSC yükleme GH hidrojellerinin terapötik etkilerini doğrulamak için, kardiyak fonksiyon ve yapıdaki değişiklikler, transplantasyondan sonraki 28. günde ekokardiyografi ve histolojik analiz ile değerlendirildi ve farklı tedavi grupları arasında karşılaştırıldı. Temsili ekokardiyografi, MSC jel ile tedavi edilen grupta fraksiyonel kısalma, ejeksiyon fraksiyonu ve son sistolik hacim dahil olmak üzere kardiyak fonksiyonlarda iyileşme gösterdi.

Ek olarak, histolojik analiz, MSC jel ile tedavi edilen grupta diğer gruplara göre daha az fibroz, daha kalın enfarktüslü duvarlar ve daha küçük bir enfarktüs boyutu sergiledi, bu da bu protokolün LV yeniden şekillenmesini önemli ölçüde azalttığını gösteriyor. Bu tekniği kullanarak, murin modelinde miyokard enfarktüsü sonrası uzun süreli kök hücre kullanımı ve çoğalması elde ettik ve kardiyak yapı ve fonksiyonda önemli bir iyileşme sağladık. Bu teknik, büyük hayvanlarda kullanım için ve kardiyak doku onarımı ve rejenerasyonu sağlayarak enfarktüs sonrası kalp yetmezliğinin önlenmesi için yeni bir strateji olarak klinik çeviriye genişletilebilir.