Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Bu protokolün önemi, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmasıdır. Bu tekniğin temel avantajı, COMSTAT'ın manuel olarak çalıştırılmasıyla ilişkili öznel varyasyonları ortadan kaldırmaya yardımcı olmasıdır, bu da sonuçta araştırma merkezleri arasında deneylerin standardizasyonunu ve şeffaflığını kolaylaştırır. Pseudomonas aeruginosa kültürlerini görüntülemek için, plakayı uygun lazer uyarma dalga boyları ve filtre setleri ile donatılmış konfokal bir mikroskop sahnesine yerleştirin.

Ayrıca, 0,3 mikrometrelik artışlarla alt tabakadan her bir biyofilm segmentinin tepesine kadar en az altı katmanlı z-yığını görüntüsü yakalamak için 20 ila 25x suya daldırma lensi kullanın. Ardından, COMSTAT analizi için görüntüleri OME-TIFF olarak kaydedin. Tüm görüntüler alındığında, COMSTAT2 paketini ImageJ'de açın ve masaüstünde bir kaynak klasör oluşturun.

Klasöre tek bir OME-TIFF ekleyin ve kaynak klasörden OME-TIFF'i açın. Biyokütle içermeyen boş katmanları silin. Dosyayı ImageJ'ye içe aktarmak için Dosya, İçe Aktar ve Görüntü Sırası'nı seçin.

Kaynak klasörü açmadan bulun ve vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Bir sıra seçenekleri penceresi görünecektir, Tamam'a tıklayın. Alt tabaka yığının en üstünde olacak şekilde biyofilmin yönünü çevirmek için Görüntü, Dönüştür ve Z'yi Çevir'i seçin. Görüntü özelliklerini tanımlamak için Görüntü ve Özellikler'i seçin, bir kaynak penceresi görünecektir.

Uzunluk birimini mikron olarak belirtin, voksel derinliğini 0,3 olarak tanımlayın ve Tamam'a tıklayın. Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin. Eşik penceresinde görüntü eşiğini ayarlamak için, maksimum eşik değerini manuel olarak ayarlamak üzere alt kaydırıcıyı en sağa konumlandırın ve minimum eşiği ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın. Ardından, yığın boyunca arka plan gürültüsünün yeterince giderildiğinden emin olmak için her katmanda gezinmek için görüntü penceresindeki kaydırıcıyı kullanın ve daha düşük eşik değerini düzeltmek için Ayarla'yı seçin.

Eşik düzeylerini ayarla penceresinde Tamam'ı seçin ve maksimum eşik değerini benzer şekilde ayarlayın ve düzeltin. Uygula'yı seçin, görüntülenen yığını ikiliye dönüştür penceresinde Tamam'a tıklayın ve eşik penceresinden çıkın. Dosyayı kaynak klasöre yeni bir dosya adıyla kaydetmek için Eklentiler, Biyo-Biçimler ve Biyo-Biçimler Dışa Aktarıcı'yı seçin.

Bir Bio-Formats Exporter birden çok dosya penceresi görünecektir, Tamam'ı seçin. Bir Biyo-Biçim Dışa Aktarıcı seçenekleri penceresi görünecektir, tekrar Tamam'ı seçin. COMSTAT'ı çalıştırmak için eklentileri seçin ve COMSTAT2, hakkında bir pencere görünecektir, Gözlemlenen Dizinler penceresinden OK.In seçin, Ekle'yi seçin, kaynak klasörü bulun ve vurgulayın, vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Analiz edilecek OME-TIFF'leri listeleyen bir Dizinlerdeki Görüntüler penceresi görüntülenir.

COMSTAT2.1 penceresinde, yazılımın tek tek OME-TIFF'ler için önceden ayarlanmış eşik değerlerini kullandığından emin olmak için Otomatik Eşikleme Otsu Yöntemi ve Bağlı Birim Filtreleme'nin seçimini kaldırın. COMSTAT2.1 penceresinde Biomass, Thickness Distribution (Biyokütle), Thick Distribution (Kalınlık Dağılımı) ve Surface Area (Yüzey Alanı) seçeneğini seçiniz ve programı çalıştırmak için Go (Git) tıklayınız. Çıktı verileri günlük penceresinde gösterilecektir.

Ölçümler otomatik olarak kaynak klasöre TXT dosyaları olarak kaydedilecektir. Bu temsili analizde, enfekte bir kistik fibroz hastasından kültürlenen bir Pseudomonas aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri yanlış bir şekilde ölçerek, bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanıldı. Canlı hücre görüntüleme, biyofilme özgü monoklonal ve tobramisin tedavisinden önce ve sonra Pseudomonas aeruginosa biyofilm yapısındaki değişiklikleri de görselleştirebilir.

COMSTAT veri analizi, kontrol kültürlerine kıyasla tedavi edilen biyofilm yapıları arasında önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Tobramisin ile muamele edilen kültürlerde, ortalama kalınlık ve biyokütlede belirgin bir azalma gözlenmiştir. Bununla birlikte, antikorların varlığında, P.aeruginosa biyofilmi, bu tobramisin kaynaklı yapısal değişikliklere dirençliydi.

Yüzey-biyo hacim oranı incelendiğinde, hem tobramisine maruz kalan hem de maruz kalmayan biyofilmlerde antikorların varlığında önemli bir azalma gözlendi, bu da antikorla muamele edilen kültürlerde agrega oluşumunu gösterir. Bu prosedür, biyofilm matrislerini bozmak için kullanılan farklı antimikrobiyallerin etkilerini kantitatif olarak değerlendirmek veya karşılaştırmak için gerçekleştirilebilir. Araştırmacılar, bu tekniği genel bir çerçeve olarak kullanarak, biyofilm heterojenliğini daha iyi tasvir etmek için ImageJ'de yeni matematiksel modeller ve algoritmik eklentiler içerecek şekilde protokolü iyileştirmenin farklı yollarını keşfedebilirler.