Name: Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Öğrenin, COMSTAT yazılımı ve konfokal mikroskopi kullanarak Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisini antimikrobiyal koşullar altında nasıl nicelendireceğinizi. Bu standart protokol, biyofilm araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu araştırma için fon sağladığı için Kistik Fibrozis Vakfı'na teşekkür eder.

1. Bakteriyel izolat toplama
<ol><li>SickKids'te (Toronto) inhale tobramisin ile eradikasyon tedavisi gören KF'li pediatrik hastalardan oluşan bir kohorttan P. aeruginosa izolatları elde edin. İzolatları kullanımdan önce en az üç kez -80 ° C'de gliserol sitrat ve alt kültürde dondurun.</li>
</ol>2. İn vitro biyofilm oluşumu
NOT: Modifikasyonlarla in vitro biyofilm oluşumu için odacıklı bir kapak camı yöntemi1 kullanın. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>P. aeruginosa'yı triptik soya agar ve% 5 koyun kanı ile hazırlanan kan agar üzerinde 37 ° C'de gece boyunca izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Kanlı agardan 1-2 bakteri kolonisini 4 mL lizojeni et suyuna (LB) aşılayın. 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 °C'de gece boyunca büyütün.</li>
	<li>4 mL taze LB içinde 40 μL kültür ekleyerek 1:100 oranında bir gece boyunca inokülum seyreltmesi hazırlayın. 600 nm'de (OD600) (erken günlük faz) yaklaşık 0,1'lik bir optik yoğunluk elde etmek için 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 ° C'de 3-4 saat büyütün.</li>
	<li>220 μL aşılamayı 8 odacıklı bir kapak camı slaytının her bir oyuğuna aktarın. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin.</li>
	<li>Biyofilmlerin tabanda ayrılmasını önlemek için ortamı her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın. NOT: Sürgüyü 45°'lik bir açıyla öne doğru eğin ve pipet ucuyla tabana dokunmadan ortamı her odacıklı kuyunun alt köşelerinden aspire edin.</li>
	<li>100 μL 56 μg/mL floresan etiketli monoklonal antikor (mAb) hazırlayın ve yavaşça ekleyin. Bakteriyel antijen epitopuna antikor bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 56 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için floresan etiketli (kırmızı) mAb, Psl0096'yı LB cinsinden seyreltin. Psl0096, ilk hücre bağlanması ve yapısal bütünlükte yer alan P . aeruginosa biyofilmlerinin önemli bir EPS matris bileşeni olan sınıf I Psl epitopuna bağlanan bir anti-Psl mAb'dir (Cam003'ün optimize edilmiş afinite türevi)15.</li>
	<li>100 μL 1000 μg / mL antibiyotik çözeltisi hazırlayın ve yavaşça ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) belirtilen odacıklı kuyucukların yan tarafına. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 1000 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için LB'de 50 mg / mL tobramisin antibiyotik stoğunu seyreltin.</li>
</ol>3. Biyofilm floresan boyama
<ol><li>Canlı hücre boyama floresan boyanın 0.01 mM'lik bir çözeltisini hazırlayın. Ortamı odacıklı oyuklardan yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa 200 μL boya karışımı ekleyin. Karanlıkta RT'de 45 dakika inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 2 mL LB'ye 4 μL 5 mM stok ekleyerek canlı hücre boyama (yeşil) floresan boyayı hazırlayın.</li>
	<li>Ortamı her kuyucuktan yavaşça çıkarın ve 2x'i 200 μL taze LB ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 200 μL taze LB ekleyin ve konfokal mikroskopi ile incelemeye devam edin.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi ile görüntü elde etme
NOT: Görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de sunulmuştur. Biyofilm boyamanın aynı gününde kuyuların görüntülerini elde edin. Görselleştirmedeki gecikme 1 saati aşarsa, odacıklı kapak camını daha fazla işleme kadar karanlıkta soğutun.
<ol><li>Uygun lazer uyarma dalga boylarına ve elde etmek için filtre setlerine sahip bir konfokal mikroskop sistemi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak kuyuların görüntülerini elde edin. NOT: Burada, sırasıyla 561 ve 491 nm uyarma dalga boylarını kullanarak floresan etiketli (kırmızı) mAb ve canlı hücre (yeşil) boyasını uyarın.</li>
	<li>20-25x suya daldırmalı lens ile 0,3 μm'lik artışlarla katmanlı z yığını görüntüleri (alt tabakadan her bir biyofilm segmentinin tepesine kadar) yakalayın. Kuyu başına en az 6 görüntü yığını alın. NOT: Burada, görüntüleri 25x suya daldırma lensli yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak görselleştirin ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak işlenin (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir deneydeki tüm alımlar için yazılım kurulumunu ve dijital görüntüleme parametrelerini (yani parlaklık ve hassasiyet) sabit tutun.</li>
	<li>COMSTAT analizi için görüntüleri OME-TIFF olarak kaydedin. NOT: OME-TIFF'lerin her kanal için ayrı ayrı kaydedildiğinden emin olun (yani kırmızı ve yeşil). Bu adım, kullanılan görüntü analiz yazılımına bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Bakteri izolatı başına toplam 3 biyolojik kopyadan (yani 3 bağımsız deney) görüntü yakalamak için 2.1–4.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. COMSTAT analizi
NOT: ImageJ'ye bir eklenti (Comstat16,17) olarak yeniden yazılmış, ücretsiz olarak kullanılabilen bilgisayar programı COMSTAT 2'yi kullanarak görüntüleri nicel olarak analiz edin. İndirilen paketteki biyofilmlerin görüntü yığınlarını analiz etmek için genel talimatları okuyun. Bu katkı, antimikrobiyallerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerini ölçmek için önerilen seçilmiş ImageJ işleme adımları ve COMSTAT özellikleri ile özetlenmiş bir protokol sağlar.
<ol><li>Comstat2 paketini http://www.comstat.dk/'dan indirin. Yüklü klasörün içinde ImageJ'yi bulun ve çalıştırın.</li>
	<li>Masaüstünde bir kaynak klasör oluşturun ve klasöre tek bir OME-TIFF ekleyin.</li>
	<li>Kaynak klasörden OME-TIFF'i açın ve biyokütle içermeyen boş katmanları silin. Bu katmanlar, z-yığınının ilk veya son birkaç katmanı olacaktır. NOT: Mikroskop tanımlı z-yığını sınırları bazen kullanıcılar tarafından fazla tahmin edilir. Bu boş katmanları silmek, COMSTAT analizi için daha rafine bir z-yığını sınırı oluşturur.</li>
	<li>Dosya | İthalat | Görüntü Sırası. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Bir 'Sıra Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: ImageJ'de ek görüntüleri içe aktarmak için önce önceki OME-TIFF'i kaynak klasörden kaldırın, ardından yeni OME-TIFF'i klasöre ekleyin ve 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek biyofilmin yönünü çevirin Dönüştür | Alt tabakayı ilk (en üst) yığın olarak konumlandırmak için Z'yi çevirin. NOT: COMSTAT algoritmaları, biyofilmleri z yönünde yukarıdan (yığın 1) aşağıya doğru okur. Kullanılan konfokal mikroskop sistemine bağlı olarak, OME-TIFF çıkışı ters çevrilebilir. Bu nedenle, çıktı verilerinin kusurlu hale gelmesini önlemek için alt tabakayı görüntü yığını 1 olarak konumlandırarak dilimlerin sırasını tersine çevirmek önemlidir.</li>
	<li>Görüntü | Özellikleri. Bir 'Kaynak' penceresi görünecektir.<ol><li>'Uzunluk Birimi'ni 'mikron' olarak belirtin.</li>
		<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği'ni matematiksel olarak belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg"> (1) Burada, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' 0,427 olarak tanımlanır, burada şarj bağlantılı cihazdaki (CCD) bir pikselin fiziksel uzunluğu 16 μm'dir; toplam büyütme 25x'tir; ve büyüteç konumu 1.5x'tir. NOT: Piksel başına hücre boyutunu hesaplamak için kullanılan denklem, mikroskop kamera üreticisine bağlı olarak değişebilir. Alternatif olarak, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' uzamsal kalibrasyon ile tanımlanabilir (https://imagej.net/Spatial_Calibration bakın).</li>
		<li>'Voksel derinliğini' 0,3 olarak tanımlayın (yani, her z-yığını katmanı arasındaki artımlı boşluk). 'Kaynak' penceresinde Tamam'ı seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek görüntü eşiğini ayarlayın Ayarla | Eşik. Bir 'Eşik' penceresi görünecektir. NOT: Görüntüdeki nesneler gri tonlamalı bir arka planla kırmızı görünecektir. Alternatif olarak, 'Kırmızı'yı 'S&amp;B' olarak değiştirmek için 'Eşik' penceresindeki açılır menüyü kullanarak eşik siyah beyaz olarak ayarlanabilir.<ol><li>Görüntü penceresinde, kaydırıcıyı en sağa ayarlayın (yani, biyofilmin en üst katmanı). Arka plan gürültüsünü gidermek için, maksimum ve minimum eşik değerlerini manuel olarak ayarlamak için görüntünün histogramını görüntüleyen 'Eşik' penceresini kullanın. İlk olarak, alt kaydırıcıyı mümkün olduğunca sağa ayarlayarak maksimum eşik değerini ayarlayın. İkinci olarak, görüntüyü iki ayrı faza ayıran minimum eşik değerini ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın: kırmızı biyokütle ve gri tonlamalı arka plan (Şekil 3). NOT: Burada açıklanan in vitro biyofilm oluşumu ve floresan mikroskopi prosedürü, ideal durumda OME-TIFF'ler oluşturur ve görüntülerin basit bir histogram eşik yöntemi aracılığıyla iki ayrı faza bölünmesine izin verir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, farklı fazlar arasındaki histogram ayrımı o kadar net değildir. Bunun nedeni, yoğun arka plan gürültüsünün varlığı, değişen arka plan yoğunlukları veya biyokütle ile arka plan arasındaki düşük yoğunluklu kontrast olabilir. Bu gibi durumlarda, kullanıcılar gelişmiş bir segmentasyon prosedürübenimsemelidir 18,19.<ol><li>Alternatif olarak, 'Eşik' penceresinde 'Varsayılan' olarak ayarlanan sol açılır menüyü kullanarak tek tek görüntüler için eşikleri algoritmik olarak ayarlayın. Bu özellik, aralarından seçim yapabileceğiniz 17 farklı algoritmik eşik seçeneği sunar (https://imagej.net/Auto_Threshold bakın). En uygun seçeneği seçin, ardından eşiği ayarlamak için 'Otomatik'i seçin.</li>
		</ol></li>
		<li>Eşik değerleri ayarlandığında, arka plan gürültüsünün baştan sona yeterince giderildiğinden emin olmak için her katmanda gezinmek için görüntü penceresindeki kaydırıcıyı kullanın.</li>
		<li>Önce alt eşik değerini düzeltmek için 'Eşik' penceresinde Ayarla'yı seçin. Bir 'Eşik Düzeylerini Ayarla' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Yeniden Ayarla'yı seçin ve maksimum eşik değerini sabitlemek için bu adımı tekrarlayın. NOT: Her 'Ayarla' seçildiğinde, alt kaydırıcı otomatik olarak ayarlanabilir. Bu gibi durumlarda, kaydırıcıyı manuel olarak yeniden ayarlayın (veya algoritmik eşiklerden birini kullanıyorsanız 'Otomatik'i seçin) ve 5.6.2–5.6.3 adımlarını tekrarlayın. Ana fikir, kaydırıcılar otomatik olarak yeniden ayarlandığında, hem üst hem de alt eşiklerin sabitlendiğinden emin olmak için 'Ayarla'nın daha sonra iki kez daha seçilmesi gerektiğidir.</li>
		<li>Uygula'yı seçin ve 'Yığını İkiliye Dönüştür' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin ve ardından 'Eşik' penceresinden çıkın.</li>
		<li>Eklentiler | Biyo-Formatlar | Biyo-Format İhracatçısı|. Yeni bir dosya adı girin ve kaynak klasöre OME-TIFF olarak kaydedin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı - Birden Çok Dosya' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: COMSTAT analizine geçmeden önce kaynak klasöre yalnızca yeni ayarlanan siyah beyaz OME-TIFF'lerin kaydedildiğinden emin olun. Tüm orijinal OME-TIFF'leri klasörden kaldırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eklentiler | Comstat2 |. Bir 'Hakkında' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Üç pencere görünecektir.<ol><li>'Gözlemlenen Dizinler' penceresinde (sağ üstte), Ekle'yi seçin. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'i seçin. COMSTAT aracılığıyla analiz edilecek OME-TIFF'leri listeleyen bir 'Dizinlerdeki Görüntüler' penceresi (sol üstte) görünecektir.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), yazılımın daha önce ayrı OME-TIFF'ler için ayarlanmış eşik değerlerini kullandığından emin olmak için 'Otomatik eşikleme (Otsu yöntemi)' seçimini kaldırın. Ayrıca, biyofilm yapısının boşluklarında bulunan serbest yüzen hücrelerin veya biyokütlenin çok ince kısımlarının analize dahil edildiğinden emin olmak için Bağlı Hacim Filtresig (CVF) seçimini kaldırın. NOT: Burada, CVF'nin seçimini kaldırın çünkü COMSTAT analizi çok erken biyofilmler (24 saatlik başlangıç büyümesi) ve antimikrobiyal tedaviden sonra kalan planktonik hücreler/koloniler üzerinde gerçekleştirilir. Olgun biyofilmler için, yalnızca biyofilm yapısına bağlı biyokütlenin miktarının ölçülmesini sağlamak için CVF'yi seçin.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), kantitatif analiz için istediğiniz özellikleri seçin. Burada Biyo Kütle, Kalınlık Dağılımı ve Yüzey Alanı'nı seçin. Programı çalıştırmak için Git'i seçin. 'Günlük' penceresinde (sol altta), çıktı verileri 'Seçilen işlevler/görüntüler ile tamamlandı!' görünene kadar işlenirken gösterilir. COMSTAT ölçümlerini kaydedin. Bu ölçümler ayrıca otomatik olarak kaynak klasörüne TXT dosyaları olarak kaydedilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+infections%3A+community+structure%2C+antimicrobial+tolerance+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).</li>
<li>Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+diversity+of+environmental+GIM-1-producing+bacteria+collected+during+a+long-term+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Powell, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+extracellular+polymeric+network+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+alginate+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. Ø, Wang, H., Høiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance%2C+respiratory+tract+infections+and+role+of+biofilms+in+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).</li>
<li>Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-Pseudomonas+aeruginosa+interactions+promote+biofilm+formation+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance.</a> Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+interaction+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+enhances+tobramycin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).</li>
<li>Rojo-Molinero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+treatment+of+biofilms+with+aztreonam+and+tobramycin+is+a+novel+strategy+for+combating+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).</li>
<li>Hentzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing biofilms in flow chambers.</a> Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).</li>
<li>Luo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sensitive+thresholding+method+for+confocal+laser+scanning+microscope+image+stacks+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms.</a> Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).</li>
<li>Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+effects+of+sputum+on+biofilm+development+using+a+chambered+coverglass+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54819(2016).</li>
<li>DiGiandomenico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+broadly+protective+human+antibodies+to+Pseudomonas+aeruginosa+exopolysaccharide+Psl+by+phenotypic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comstat2+-+a+modern+3D+image+analysis+environment+for+biofilms%2C+in+Informatics+and+Mathematical+Modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+University+of+Denmark%22%5BJournal%5D)">Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling.</a> Technical University of Denmark. , Kongens Lyngby. Denmark. (2008).</li>
<li>Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tomographic+imagery+segmentation+methodology+for+three-phase+geomaterials+based+on+simultaneous+region+growing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Geotechnica%22%5BJournal%5D)">A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing.</a> Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).</li>
<li>Rogowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+fundamentals+of+medical+image+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Medical+Image+Processing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Overview and fundamentals of medical image segmentation.</a> Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).</li>
<li>Webb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+technician+effects+when+extracting+quantities+from+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).</li>
<li>Xavier, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+threshold+selection+procedure+%28OTS%29+for+segmentation+of+scanning+laser+confocal+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).</li>
<li>Arena, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+cell%3A+turning+images+into+numbers+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260(2017).</li>
<li>Daims, H., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+uncultured+microorganisms+by+fluorescence+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).</li>
<li>Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+procedure+for+automatic+and+accurate+segmentation+of+volumetric+CLSM+biofilm+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images.</a> Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+biofilms+formed+by+nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).</li>
<li>Stapper, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+production+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development+and+architecture%2C+but+is+not+essential+for+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation.</a> Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).</li>
<li>Reichhardt, C., Parsek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+architecture+and+matrix+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 677(2019).</li>
<li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+biofilm+structure+using+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying biofilm structure using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).</li>
<li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biofilm+image+thresholding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biofilm image thresholding methods.</a> Water Research. 35, 1149-1158 (2001).</li>
<li>Ross, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+confocal+images+of+biofilms+grown+on+irregular+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces.</a> Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+development+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> PLoS Pathogens. 5, (2009).</li>
<li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li>
<li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li>
<li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li>
</ol>

İn vitro biyofilm yapılarının üç boyutlu görüntülerini kantitatif olarak karşılaştırmak için önceden belirlenmiş bir yöntem yoktur ve bu bağlamda açıklanan prosedürlerin, operatörler arası değişkenlik nedeniyle standartlaştırılması genellikle zordur20. Bu nedenle, bu protokol, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek isteyen COMSTAT uygulamaları için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunar. Bu tekniğin güçlü yönleri, biyofil...

Biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan bir matrise yönlendirilmiş mikroorganizma kümeleridir. EPS matrisi çok karmaşıktır, esas olarak bakteri hücreleri, su, proteinler, polisakkaritler, lipitler ve nükleik asitlerden1 oluşur ve bunların tümü biyofilmleri serbest yaşayan planktonik hücrelerden belirgin şekilde farklı kılar. Biyofilm EPS birbirine ve çeşitli yüzeylere yapışır. EPS matrisi, hücreler arası sinyalleşme ve savunma2 için kullanılan metabolitlerin, genetik materyalin ve bileşiklerin hücreden hücreye değişimine aracılık eden özelliklere sahiptir. Bu özellikler toplu olarak biyofilmlerin yapısal bütünlüğü ve dış stres faktörlerine karşı koruma sağlayarak bağışıklıktan kaçınmaya ve antimikrobiyal dirence katkıda bulunur3.
Pseudomonas aeruginosa, antimikrobiyallere yanıt olarak kaçış amaçlı bir biyofilm büyüme stratejisi benimsediği bilinen, iyi bilinen bir nozokomiyal patojendir. Bunun en iyi örneği, resesif genetik bozukluk olan kistik fibroz (KF) olan hastalarda görülür. Biyofilmler, antimikrobiyal dirençli P. aeruginosa4'ün gelişiminde çok önemli bir rol oynar ve KF'li hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunun oluşmasına izin vererek akciğer fonksiyonlarında hızlı düşüşe ve erken mortaliteyeneden olur 5. Bu nedenle, CF 6,7 olan hastalardan elde edilen P. aeruginosa izolatlarına karşı antibiyotiklerin ve yeni anti-enfektif ajanların etkinliğini test etmek için in vitro biyofilm çalışmaları yapılmaktadır. Biyofilm oluşumunu takiben, antimikrobiyaller yapıya dışarıdan uygulanır ve biyofilm segmentlerinin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu rekonstrüksiyonlarını oluşturmak için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılır. Daha sonra, biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek için ImageJ'ye bir eklenti olarak bilgisayar yazılımıCOMSTAT'ı kullanmak yaygın bir uygulamadır 8,9,10,11.
COMSTAT, biyofilm yapısını ölçmek için yararlı olsa da, görüntü analizinin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu daha az yaygın olarak ele alınmaktadır. Örneğin, COMSTAT çalıştırılmadan önce gerçekleştirilen görüntü işleme prosedürü nesneldir, ancak görüntü eşikleri12,13 ayarlanırken bir öznellik öğesi içerir. Benzer şekilde, COMSTAT programı, operatörün görüntü segmentasyonu için temel koşullardan gelişmiş koşullara ve parametrelere ve ayrıca on nicel analiz fonksiyonuna (örneğin, kalınlık dağılımı, yüzey alanı, biyokütle, boyutsuz pürüzlülük katsayısı) seçim yapmasına olanak tanır. Değişen operatör uzmanlık seviyeleriyle birleşen çok sayıda kullanıcı seçeneği, biyofilm davranışının yanlış yönlendirilmiş raporlanmasına neden olabilir.
Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT kullanılarak in vitro biyofilm yapılarının kantitatif karşılaştırması için nispeten basit bir yöntem sunmaktır. Burada, bir CF P. aeruginosa izolatından alınan biyofilm segmentlerinin üç boyutlu görüntüleri, tekrarlanabilir in vitro biyofilm deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan yerleşik bir teknik olan odacıklı kapak camı modeli14 kullanılarak CLSM aracılığıyla yakalanır. COMSTAT'ı ImageJ'e bir eklenti olarak kullanan bu yöntem, araştırmacıların değişen koşullar altında antimikrobiyallerin varlığında biyofilm mimarisindeki değişiklikleri nicel olarak tanımlamasına olanak tanır. Genel olarak, bu yöntem, COMSTAT'ın manuel olarak çalıştırılmasıyla ilişkili öznel varyasyonları ortadan kaldırmayı ve böylece protokollerin merkezler arasında standardizasyonunu kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Anti-Psl mAb, Psl0096</td><td>Medimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kan Agar (% 5 Koyun Kanı İçeren TSA) Orta Fisher</td><td>Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>Sekiz Kuyulu Odacıklı Kapak Camı, çıkarılabilir olmayan kuyular ile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SYTO 9 Yeşil Floresan Nükleik Asit Lekesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>LB ET SUYU (LENNOX), Sıvı Otoklav Sterilize BioShop</td><td>Canada</td><td>LBL666</td><td></td></tr><tr><td>Tobramisin, 900 ve mikro; g/mg</td><td>Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific</td><td>J66040</td><td>Antimikrobiyal potansiyelin kalite kontrolünü sağlamak için yapılan her parti için minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) testi yapılması önerilir</td></tr><tr><td>Çekirdek Hacim 6.3</td><td>Çekirdek Teknolojileri</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

antimikrobiyallerin İn vitro biyofilm mimarisi Üzerindeki etkilerinin comstat yazılımı kullanılarak Ölçülmesi

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biyofilmler, koruma ve yapısal bütünlük için kendi ürettiği hücre dışı polimerik madde matrisine dayanan mikroorganizma kümeleridir. Nozokomiyal patojen Pseudomonas aeruginosa'nın , kistik fibrozisli (KF) hastalarda kronik akciğer enfeksiyonuna neden olan bir biyofilm büyüme modunu benimsediği bilinmektedir. Bilgisayar programı, COMSTAT, üç boyutlu konfokal görüntülerden veri çıkararak P. aeruginosa biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri ölçmek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, yazılımın standartlaştırılmış çalışması daha az yaygın olarak ele alınır, bu da biyofilm davranışının en iyi şekilde raporlanması ve merkezler arası karşılaştırma için önemlidir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT aracılığıyla değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamaktır. Teknik, biyofilm kopyaları şeklinde büyütülen ve tobramisin ve anti-Psl monoklonal antikoru Psl0096'ya maruz bırakılan bir CF P. aeruginosa izolatı kullanılarak modellenmiştir. Adım adım yaklaşım, kullanıcı belirsizliğini azaltmayı ve önemli görüntü işleme adımlarını gözden kaçırma olasılığını en aza indirmeyi amaçlar. Spesifik olarak, protokol, görüntü segmentasyonu ve uygun nicel analiz fonksiyonlarının seçimi de dahil olmak üzere, COMSTAT'ın manuel çalışmasıyla ilişkili öznel varyasyonların ortadan kaldırılmasını vurgular. Bu yöntem, kullanıcıların COMSTAT'ı çalıştırmadan önce konfokal görüntüleri işlemek için ek zaman harcamasını gerektirse de, otomatik çıktılarda yanlış temsil edilen biyofilm heterojenisitesini en aza indirmeye yardımcı olur.

KF'li enfekte bir hastadan kültürlenen bir P. aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmede bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanılır. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de temsil edilmektedir. ImageJ'deki görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de gösterilmiştir. ImageJ'de görüntü segmentasyonu için bir CLSM z-stack görüntüsüne (OME-TIFF olarak kayde...

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Bu protokolün önemi, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmasıdır. Bu tekniğin temel avantajı, COMSTAT'ın manuel olarak çalıştırılmasıyla ilişkili öznel varyasyonları ortadan kaldırmaya yardımcı olmasıdır, bu da sonuçta araştırma merkezleri arasında deneylerin standardizasyonunu ve şeffaflığını kolaylaştırır. Pseudomonas aeruginosa kültürlerini görüntülemek için, plakayı uygun lazer uyarma dalga boyları ve filtre setleri ile donatılmış konfokal bir mikroskop sahnesine yerleştirin.Ayrıca, 0,3 mikrometrelik artışlarla alt tabakadan her bir biyofilm segmentinin tepesine kadar en az altı katmanlı z-yığını görüntüsü yakalamak için 20 ila 25x suya daldırma lensi kullanın. Ardından, COMSTAT analizi için görüntüleri OME-TIFF olarak kaydedin. Tüm görüntüler alındığında, COMSTAT2 paketini ImageJ'de açın ve masaüstünde bir kaynak klasör oluşturun.Klasöre tek bir OME-TIFF ekleyin ve kaynak klasörden OME-TIFF'i açın. Biyokütle içermeyen boş katmanları silin. Dosyayı ImageJ'ye içe aktarmak için Dosya, İçe Aktar ve Görüntü Sırası'nı seçin.Kaynak klasörü açmadan bulun ve vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Bir sıra seçenekleri penceresi görünecektir, Tamam'a tıklayın. Alt tabaka yığının en üstünde olacak şekilde biyofilmin yönünü çevirmek için Görüntü, Dönüştür ve Z'yi Çevir'i seçin. Görüntü özelliklerini tanımlamak için Görüntü ve Özellikler'i seçin, bir kaynak penceresi görünecektir.Uzunluk birimini mikron olarak belirtin, voksel derinliğini 0,3 olarak tanımlayın ve Tamam'a tıklayın. Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin. Eşik penceresinde görüntü eşiğini ayarlamak için, maksimum eşik değerini manuel olarak ayarlamak üzere alt kaydırıcıyı en sağa konumlandırın ve minimum eşiği ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın. Ardından, yığın boyunca arka plan gürültüsünün yeterince giderildiğinden emin olmak için her katmanda gezinmek için görüntü penceresindeki kaydırıcıyı kullanın ve daha düşük eşik değerini düzeltmek için Ayarla'yı seçin.Eşik düzeylerini ayarla penceresinde Tamam'ı seçin ve maksimum eşik değerini benzer şekilde ayarlayın ve düzeltin. Uygula'yı seçin, görüntülenen yığını ikiliye dönüştür penceresinde Tamam'a tıklayın ve eşik penceresinden çıkın. Dosyayı kaynak klasöre yeni bir dosya adıyla kaydetmek için Eklentiler, Biyo-Biçimler ve Biyo-Biçimler Dışa Aktarıcı'yı seçin.Bir Bio-Formats Exporter birden çok dosya penceresi görünecektir, Tamam'ı seçin. Bir Biyo-Biçim Dışa Aktarıcı seçenekleri penceresi görünecektir, tekrar Tamam'ı seçin. COMSTAT'ı çalıştırmak için eklentileri seçin ve COMSTAT2, hakkında bir pencere görünecektir, Gözlemlenen Dizinler penceresinden OK.In seçin, Ekle'yi seçin, kaynak klasörü bulun ve vurgulayın, vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Analiz edilecek OME-TIFF'leri listeleyen bir Dizinlerdeki Görüntüler penceresi görüntülenir.COMSTAT2.1 penceresinde, yazılımın tek tek OME-TIFF'ler için önceden ayarlanmış eşik değerlerini kullandığından emin olmak için Otomatik Eşikleme Otsu Yöntemi ve Bağlı Birim Filtreleme'nin seçimini kaldırın. COMSTAT2.1 penceresinde Biomass, Thickness Distribution (Biyokütle), Thick Distribution (Kalınlık Dağılımı) ve Surface Area (Yüzey Alanı) seçeneğini seçiniz ve programı çalıştırmak için Go (Git) tıklayınız. Çıktı verileri günlük penceresinde gösterilecektir.Ölçümler otomatik olarak kaynak klasöre TXT dosyaları olarak kaydedilecektir. Bu temsili analizde, enfekte bir kistik fibroz hastasından kültürlenen bir Pseudomonas aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri yanlış bir şekilde ölçerek, bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanıldı. Canlı hücre görüntüleme, biyofilme özgü monoklonal ve tobramisin tedavisinden önce ve sonra Pseudomonas aeruginosa biyofilm yapısındaki değişiklikleri de görselleştirebilir.COMSTAT veri analizi, kontrol kültürlerine kıyasla tedavi edilen biyofilm yapıları arasında önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Tobramisin ile muamele edilen kültürlerde, ortalama kalınlık ve biyokütlede belirgin bir azalma gözlenmiştir. Bununla birlikte, antikorların varlığında, P.aeruginosa biyofilmi, bu tobramisin kaynaklı yapısal değişikliklere dirençliydi.Yüzey-biyo hacim oranı incelendiğinde, hem tobramisine maruz kalan hem de maruz kalmayan biyofilmlerde antikorların varlığında önemli bir azalma gözlendi, bu da antikorla muamele edilen kültürlerde agrega oluşumunu gösterir. Bu prosedür, biyofilm matrislerini bozmak için kullanılan farklı antimikrobiyallerin etkilerini kantitatif olarak değerlendirmek veya karşılaştırmak için gerçekleştirilebilir. Araştırmacılar, bu tekniği genel bir çerçeve olarak kullanarak, biyofilm heterojenliğini daha iyi tasvir etmek için ImageJ'de yeni matematiksel modeller ve algoritmik eklentiler içerecek şekilde protokolü iyileştirmenin farklı yollarını keşfedebilirler.

quantifying-effects-antimicrobials-on-vitro-biofilm-architecture

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Kaynak: Tay, S. B., et.al. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Bu video, bakteriyel hücre sinyalini bozan bir enzimin eklenmesiyle biyofilm oluşumunu inhibre etme sürecini göstermektedir. Bu enzim, bakterilerin hücre dışı polimerik maddeler üretmesini engeller ve böylece cam tabanlı mikro tabak üzerinde biyofilm gelişimini azaltır. Son olarak, biyofilm yapısı floresan lektinler ve konfokal lazer tarama...

Biyofilm oluşumunun enzim aracılı inhibisyonunun mikroskobik değerlendirmesi

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Biyofilm enfeksiyonları kemoterapiye karşı yüksek tolerans gösterir. Tek bir tahlil biyofilmlerin karmaşıklığını yakalayamaz. Bunun yerine, tamamlayıcı tahlillere ihtiyaç vardır. Canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi tahlillerini birleştiren bir tarama platformu (S. aureus için geliştirilmiş) sunuyoruz. Uzun vadeli kemoterapötik etkilerin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere anti-biyofilm ilaç keşfine izin verir.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Öğrenin, COMSTAT yazılımı ve konfokal mikroskopi kullanarak Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisini antimikrobiyal koşullar altında nasıl nicelendireceğinizi. Bu standart protokol, biyofilm araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet