Name: Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, yüksek boyutluluk akış sitometrisi ile diseke implant dokularından immün hücre izolasyonu ve karakterizasyonu yöntemini. Bu protokol, farelerdeki ECM implantlarına karşı konak immün yanıtını analiz ederek gelecekteki tıbbi implant tasarımlarını iyileştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma kısmen, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü de dahil olmak üzere NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Feragatname: NIH, yetkilileri ve çalışanları herhangi bir şirketi, ürünü veya hizmeti önermez veya onaylamaz.

NOT: Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.
1) Reaktif hazırlama
<ol><li>Enzimleri seyreltmek ve doku kültürü için ortam hazırlayın.<ol><li>500 mL RPMI ortamına 5 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Ortamı daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzim çözeltisinin hacmini hesaplayın. NOT: Enzim çözeltisinin hacmi, 6 oyuklu plakalarda doğranmış dokuyu sindirmek için gerekli olacak enzimleri (kollajenaz ve DNaz I) içeren ortamın hacmidir; Numune sayısına bağlıdır.<ol><li>Gerekli hacmi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: (Sindirilecek numune sayısı) × 10 mM HEPES tamponu ile 5 mL serumsuz RPMI NOT: Örneğin, 0.1 ila 0.3 g disseke dalak için, enzim çözeltisini hazırlamak için 5 mL ortam kullanın. Bu yazıda tarif edilen enzimatik sindirim protokolü, esas olarak beyin, böbrek, deri, karaciğer, akciğerler, dalak, kaslar ve ayrıca sentetik malzemelerden veya hücre dışı matriks proteinlerinden yapılmış deri altı implantların etrafındaki kapsülleri içeren farelerden diseke edilen yumuşak dokular (0.1 ila 1 g arasında değişen) içindir. Sert kıkırdaklı dokuların sindirilmesi, yalnızca optimizasyonla tespit edilebilen farklı koşullar ve hacimlerde sindirim enzimleri gerektirebilir.</li>
		<li>Enzim çözeltisi için ihtiyacım olan kollajenaz ve DNaz miktarını hesaplayın. NOT: Bu protokolde 0.25 mg/mL kollajenaz ve 0.2 mg/mL DNaz I kullanılmıştır. Kollajenaz ve DNaz için gerekli çalışma konsantrasyonları, farklı doku tipleri için değişebilir19.</li>
	</ol></li>
	<li>999 μL fosfat tamponlu saline (PBS) 1 μL canlılık boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek 1:1000 canlılık boya çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi girdaplayın. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>100 mL PBS'ye 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek boyama tamponunu hazırlayın ve BSA tamamen eriyene kadar çözeltiyi vorteksleyin. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2) Enzimatik sindirim plakalarının ayarlanması
<ol><li>Her kuyucukta 70 μm hücre süzgeci bulunan 6 oyuklu bir plaka oluşturun. Her bir oyuğa adım 1.1.1'den 3 mL hazırlanan ortam ekleyin ve buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Hesaplanan kollajenaz ve DNaz I miktarını süspanse etmek için kalan ortamı (2 mL/kuyu) 37 °C'de bir inkübatörde veya su banyosunda saklayın (adım 1.2.2).</li>
</ol>3) Hücrelerin izolasyonu
<ol><li>Kesilen implantları/dokuyu plakalara yerleştirin ve makas kullanarak ince ince doğrayın. Alternatif olarak, bir doku ayrıştırıcı veya el tipi homojenizatör kullanarak mekanik bir parçalama yöntemi kullanın. Çok sayıda lökosit nedeniyle, her çalışmada boyama kontrolü olarak kullanmak için dalağı inceleyin. NOT: Bazı materyaller daha yüksek fibroz seviyelerine neden olduğundan, bu protokol hem yüksek fibrotik hem de minimal fibrotik materyaller için geçerlidir. Bununla birlikte, her işleme yöntemi, boyamadan önce sindirimden sonra hem hücre verimi hem de canlılık açısından değerlendirilmelidir. Diseksiyon sırasında periferik kan kontaminasyonundan kaçının.</li>
	<li>37 ° C'ye ısıtılmış kalan RPMI'ye (2 mL) kollajenaz ve DNaz I (adım 1.2.2'de hesaplanan hacim) ekleyin. Her oyuğa 2 mL tam enzim çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Plakaları 37 °C ve 100 rpm'de 45 dakika inkübe edilmiş bir çalkalayıcıya yerleştirin. NOT: Uygun ısı transferini engelleyebileceğinden plakaları istiflerken dikkatli olun.</li>
	<li>Bu arada 1000 μL'lik bir ucun ucundan makasla 3-4 mm doğrayarak süspansiyon dağıtma ucu hazırlayın. İnkübasyondan sonra, doğranmış ucu kullanarak iyice karıştırmak için süspansiyonu kuyucuklarda yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süzgecini 50 mL'lik konik bir tüpün üstüne yerleştirin ve sindirilmiş çözeltiyi hücre süzgecinden geçirin. NOT: 70 μm hücre süzgeci, hücreleri aljinat gibi implante edilmiş biyomateryalden ayırmak için yeterlidir. Daha fazla saflık gerekiyorsa, zenginleştirilmiş bir lökosit popülasyonu elde etmek için yoğunluk gradyan ayrımı gibi işlemleri kullanın.</li>
	<li>Kuyucukları 1x PBS solüsyonu ile durulayın ve durulama hacmini süzgeçten aktarın, ardından tüpteki hacim 50 mL'ye ulaşana kadar süzgecin yıkamalarını 1x PBS solüsyonu ile ekleyin. NOT: Sindirimin viskozitesinde herhangi bir artışı önlemek ve santrifüjleme sırasında hücre peletlenmesine izin vermek için 1x PBS oda sıcaklığında olmalıdır.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Peleti 1000 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve süspansiyonu, otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için sayma odası slaytlarına veya mikroskop altında geleneksel yöntemle saymak için bir hemositometreye yükleyin. Alternatif olarak, akış sitometrisi hücre sayma boncukları kullanın.</li>
</ol>4) Akış sitometrisi için boyama
<ol><li>2 numune, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kompanzasyon kontrolleri ve tamamen lekeli dalak numune kontrolü ile 14 renkli bir deney için örnek bir plaka düzeni için Şekil 45'ye bakın. Toplam hücre sayısını tahmin ettikten sonra, her numune için 1 × 10 6 hücreyi ve her kompanzasyon ve FMO kontrolü için 0,5 × 106 hücreyi boyamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini V-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına dağıtın ve hacmi 1x PBS ile 100 μL'ye çıkarın. NOT: Örnek olarak, adım 3.6'da elde edilen 1000 μL hücre süspansiyonu 40 × 10 6 hücre içeriyorsa, 1 × 10 6 hücre için 1000/40 × 106 = 25 μL hücre süspansiyonu gerekecektir. </li>
	<li>Plakayı 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve daha sonra 100 μL 1:1000 canlılık boyası çözeltisi ile canlılığı belirlemek için numune kuyucuklarında ve bir dengeleme kontrol kuyusunda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz.</li>
	<li>Diğer kompanzasyon kuyularının yanı sıra FMO ve boyanmamış kuyulardaki hücreler için, bunları 100 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bu arada, numuneyi ve FMO kontrollerini boyamak için bir yüzey antikor kokteyli hazırlayın: numune başına 50 μL veya FMO. Antikor kokteyli örneği için Tablo 1'e bakınız.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 100 μl 1x PBS ekleyin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve 200 μL boyama tamponunda (1x PBS +% 1 BSA) yeniden süspanse edin; 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve 50 μL 1x PBS ile kompanzasyon, FMO ve boyanmamış kuyucuklardaki hücreleri yeniden süspanse edin. İlgili numune kuyucuklarına ve FMO kuyucuklarına 50 μL antikor kokteyli ekleyin. İlgili antikorları farklı kompanzasyon kuyularına ekleyin.</li>
	<li>Plakayı karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 150 μL boyama tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin, hücreleri 200 μL boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Numuneleri fiksasyon olmadan analiz ediyorsanız, bunları 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve sitometre kurulumu ve numune analizi ile ilgili bölüm 6'ya geçin. Hücreleri sabitliyorsanız, yıkadıktan sonra süpernatanı aspire edin ve% 4 paraformaldehit gibi 100 μL bir fiksatif ekleyin. Hücre içi belirteçler için boyama yapıyorsanız, hücre içi boyama ile ilgili bölüm 5'e geçin ve hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin (bkz. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin. NOT: Fiksasyon, bazı floroforların floresan yoğunluğunu etkileyebileceğinden, her paneli hem fiksasyonlu hem de fiksasyonsuz olarak değerlendirin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, 100 μL 1x PBS ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL boyama tamponunda tekrar süspanse edin ve akış sitometrik analizinden önce 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5) Hücre içi boyama
<ol><li>Hücre içi belirteçler için fiksasyon ve geçirgenlik için adım 4.11'den devam ederek, 100 μL uygun tampon ekleyin. Hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri 200 μL fiksatif-geçirgen ajan çözeltisinde yeniden süspanse edin; hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri uygun tamponda seyreltilmiş hücre içi antikorlarla yeniden süspanse edin. NOT: Antikor tipleri ve dilüsyonları hedef hücrelere bağlı olacaktır. Örneğin, yaygın bir hücre içi belirteç, düzenleyici T hücreleri için sıklıkla 1:100 seyreltmede kullanılan çatal başlı kutu P3'tür.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 150 μL uygun tampon ekleyin ve süspansiyonu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Akış sitometrik analizi için hücreleri 200 μL boyama tamponunda aspire edin ve yeniden süspanse edin.</li>
</ol>6) Sitometre ve kompanzasyon kurulumu
<ol><li>Numuneleri çalıştırmadan hemen önce, hücre bazlı kompanzasyon yerine boncuk bazlı kompanzasyon kullanılıyorsa, kompanzasyon boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).<ol><li>Her florokrom konjuge antikor için ayrı mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve her tüpe 100 μL 1x PBS ve ardından bir tam damla anti-fare negatif kontrol kompanzasyon boncuğu ve bir damla pozitif kontrol kompanzasyon boncuğu ekleyin. Her ayrı tüpe 1 μL uygun antikor ekleyin. Vorteks yapın ve satın almadan önce 5 dakika inkübe edin. NOT: BUV737 gibi bazı boyalar boncuklara bağlanamadığından, hücre tabanlı bir kontrol kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sitometre kurulumunu izleme boncuklarıyla çalıştırarak her deneyden önce akış sitometresini kalibre edin ve her deney için akış sitometresi ayarlarını koruyun.</li>
	<li>Numuneyi analiz etmeden önce, hücre popülasyonu grafiğin ortasına düşecek ve ölçek dışı olmayacak şekilde bir yan saçılma (SSC) ve ileri dağılım (FSC) grafiğindeki hücre popülasyonunu ayarlamak için boyanmamış bir numune çalıştırarak akış sitometresini ayarlayın.</li>
	<li>Hiçbir olayın her kanalın logaritmik ölçeğinin dışına çıkmadığından emin olmak için FSC ve SSC voltajlarını ve her kanal için ayarlamak üzere lekeli örneği kısa bir süre çalıştırın. Her kompanzasyon kontrolü için 5.000 olay kaydedin, ardından pozitif ve negatif popülasyonların geçitlenmesi izleyin. Ücret matrisini hesaplayın ve ardından ilgili popülasyonlar için en az 1.000 olay toplayarak örnekleri çalıştırın. NOT: Otomatik ücretlendirme aşırı veya eksik ücretlendirmeye eğilimli olabileceğinden, daha büyük renkli panellerdeki dengeleme doğrulanmalıdır. Aşırı veya eksik telafi belirtilerini izlemek için her parametrenin grafiği diğer tüm parametrelere göre grafiklendirilmeli ve her tek renkli kontrol değerlendirilmelidir. Daha büyük renkli deneylerin karmaşık telafisi, bir işbirlikçinin veya kapsamlı akış sitometrisi deneyimine sahip bir çekirdek tesisin yardımıyla gerçekleştirilmelidir. Spektral sitometreler gibi daha yeni akış sitometreleri, tek başına standart kompanzasyona kıyasla daha temiz bir floresan örtüşme ayrımı sağlayabilen, spektral karıştırma olarak bilinen bir işlem yoluyla bir floroforun tam spektrumunu kullanır22.</li>
</ol>

<ol><li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+implantable+medical+devices%3A+from+an+engineering+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li>
<li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li>
<li>Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRolfe%2C+B+%22Regenerative+Medicine+and+Tissue+Engineering-Cells+and+Biomaterials%22">Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials</a>. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).</li>
<li>Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Medical+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li>
<li>Kang, C. -W., Fang, F. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing%3A+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040(2016).</li>
<li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+engineering+for+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li>
<li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li>
<li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Material+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li>
<li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li>
<li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable%2C+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li>
<li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+polymerizations%3A+untapped+potential+for+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861(2019).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li>
<li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li>
<li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li>
<li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li>
<li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry%3A+practices%2C+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , Wiley. (2003).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNolan%2C+JP+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).</li>
<li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li>
<li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li>
<li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933(2015).</li>
<li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+sputum%3A+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li>
<li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu derleme, tek tip bir hücre süspansiyonu elde etmek için biyomateryal implantlardan hücreleri izole etmek için ayrıntılı bir metodolojiyi açıklamaktadır. Ek olarak, çok renkli akış sitometrisi için hücre süspansiyonunun boyanması için ayrıntılı bir protokol ve optimum sonuçlar için bir akış sitometresi yapılandırma adımları sağlanmıştır. Hücre izolasyon yöntemleri, dokudaki hücre dışı matrisi ayrıştırmak ve tek tek hücreleri dokudan serbest bırakmak için hücre-hücre bağlantılarını bozmak için genellikle manuel doku dis...

Tıp alanındaki gelişmeler, hasarlı dokunun işlevini veya yeniden büyümesini desteklemek için implante edilen malzemelerin sıklıkla kullanılmasına yol açmıştır 1,2. Bunlar arasında kalp pilleri, rekonstrüktif kozmetik implantlar ve kemik kırığı fiksasyonu için kullanılan ortopedik plakalar gibi cihazlar bulunur 3,4. Ancak bu implantları yapmak için kullanılan materyaller ve implante edildikleri yerler bu implantların başarısını belirlemede önemli rol oynamaktadır 5,6,7. Yabancı cisimler olarak, bu implantlar konakçıdan reddedilmeye veya toleransa yol açabilecek bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir8. Bu faktör, implantasyondan sonra istenen bağışıklık tepkisini çekebilecek materyaller üretmek için biyomateryal araştırmalarını yönlendirmiştir 9,10,11,12.
Bağışıklık tepkisi, hasarlı bir doku veya organın değiştirilmesi için bir laboratuvarda bir doku veya organın bir biyomateryal iskeleti (iskele) etrafında büyütüldüğü rejeneratif tıp alanında temel bir gerekliliktir13,14,15,16. Rejeneratif tıpta amaç, her biri bağışıklık tepkileri tarafından büyük ölçüde modüle edilebilen hücreler, sinyaller ve iskeleler kullanarak eksik veya hasarlı dokuyu değiştirmektir17. Ayrıca, immün yanıt eksikliği istendiğinde bile, çok nadiren istenen düzenleyici bir profilin varlığından ziyade immün aktivitenin yokluğudur18. Akış sitometrisi gibi teknikler, implant cihazlarını kaplamak veya doku mühendisliği için iskele geliştirmek için kullanılan çeşitli biyomalzemelere karşı bağışıklık tepkisi modelini karakterize etmede önemli bir rol oynayabilir19.
Bu bilgi, sonuçta, bağışıklık sistemi tarafından iyi tolere edilebilen implantlar için biyomateryallerin geliştirilmesine veya doku mühendisliğinde yapıcı bir rol oynayabilecek iskelelerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Akış sitometrisi ile analiz için numunelerin uygun şekilde hazırlanması, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla immün karakterizasyonda yanlış sonuçlardan kaçınmak için önemli bir adımdır20,21. Bu nedenle, bu derleme, hücrelerin iskele dokusundan izolasyonu, hücre süspansiyonunun boyanması ve akım sitometrisi ile analizi için kullanılabilecek ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-646</td><td></td></tr><tr><td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>566385</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td>Sadece hücreleri sabitlemek için</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td>FACS hazırlamak için boyama tamponu</td></tr><tr><td>CD11b AF700</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>Klonu: M1 / 70</td></tr><tr><td>CD11c PerCP / Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>117325</td><td>Klonu: N418</td></tr><tr><td>CD197 PE / Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120121</td><td>Klonu: 4B12</td></tr><tr><td>CD200R3 APC</td><td>Biolegend</td><td>142207</td><td>Klonu: Ba13</td></tr><tr><td>CD206 PE</td><td>Biolegend</td><td>141705</td><td>Klonu: C068C2</td></tr><tr><td>CD45 BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612778</td><td>Klon: 104 / A20</td></tr><tr><td>CD86 BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>564199</td><td>Klon: GL1</td></tr><tr><td>CD8a BV421</td><td>Biolegend</td><td>100737</td><td>Klon: 53-6.7</td></tr><tr><td>Comp Bead anti-fare</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td>Kompanzasyon kontrolü için</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Sığır pankreas deoksiribonükleaz I (DNase I</td></tr><tr><td>)F4/80 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>Klon: BM8</td></tr><tr><td>Fc Blok</td><td>Biolegend</td><td>101301</td><td>Klon: 93</td></tr><tr><td>Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Hücrelerin sabitlenmesi ve geçirgenliği için.</td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Hücre ortamını desteklemek için tampon</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>Saflaştırılmış Kollajenaz I ve Kollajenaz II Karışımı</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>L23105</td><td>Canlı boya</td></tr><tr><td>Ly6c AF488</td><td>Biyoefsane</td><td>128015</td><td>Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>Ly6g BV510</td><td>Biyoefsane</td><td>127633</td><td>Klon: 1A8</td></tr><tr><td>MHCII BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>742894</td><td>Klon: M5 / 114.15.2</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin</td><td>Thermo Fisher</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875176</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Siglec F BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>740388</td><td>Klon: E50-2440</td></tr><tr><td>V-tabanlı 96 oyuklu plaka</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diseke İmplant dokularının İmmün fonksiyon analizi için yüksek boyutluluk akış sitometrisi

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Laboratuvarda yetiştirilen bir doku veya tıbbi bir cihazın bir bireye implante edilmesinin başarısı, alıcı konağın bağışıklık tepkisine bağlıdır. Bir implantı yabancı bir cisim olarak kabul etmek, düşmanca ve düzensiz bir bağışıklık tepkisi implantın reddedilmesine neden olabilirken, düzenlenmiş bir yanıt ve homeostazın yeniden kazanılması, kabulüne yol açabilir. İn vivo veya ex vivo ortamlarda diseke edilen implantların mikro ortamlarının analiz edilmesi, sonuçta yeni nesil biyomateryallerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek bağışıklık tepkisi modelinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerini ve alt kümelerini hücre yüzey belirteçlerine göre karakterize etmek için iyi bilinen bir tekniktir. Bu derlemede, diseke edilmiş implant dokusundan tek tip hücre süspansiyonlarının izolasyonu için manuel küp küp doğrama, enzimatik sindirim ve bir hücre süzgecinden filtrasyona dayalı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, bu izole edilmiş hücreleri akış sitometrisi ile karakterize etmek ve ölçmek için ilk sitometre ayarları için adımlarla birlikte çok renkli bir akış sitometrisi boyama protokolü açıklanmıştır.

İmmün analiz için akış sitometrisi panellerinin geliştirilmesi süreci genellikle sonuçların mevcut verilerle ve alandaki literatürle karşılaştırılmasına dayanır. Popülasyonların akış sitometrisinde nasıl bulunabileceğinin bilinmesi, verilerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Ne olursa olsun, popülasyonlar ve hücre tipleri farklı dokularda farklı görünebilir, bu nedenle bazı değişkenlikler beklenebilir. İyi tanımlanmış kontrol dokuları bağlamında, bu tür boyama optimizasyonu,...

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Bu protokol, daha sonra gelecekteki daha iyi tıbbi implantların tasarlanmasına yardımcı olabilecek farklı biyomalzemelere karşı konakçı bağışıklık tepkisini karakterize etmemize yardımcı olabilir. Akış sitometrisi bize bir biyomateryale sızan bağışıklık hücreleri hakkında bilgi verir, bu da hücrelerin yaralanmaya ve materyal implantasyonuna nasıl tepki verdiğinin mekanizmalarını ve ayrıca gelişmiş terapötikler için hedefleri belirlememize yardımcı olur. Aynı protokol, farklı ortamlarda bağışıklık tepkisini karakterize etmek için değiştirilebilir.Bir hafta önce ECM implantı alan ve beş mililitre serumsuz ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplanan farelerin dörtlü kasını inceleyin. Sonunda makas kullanarak dokuyu doğradı. Daha sonra, tüpe beş mililitre sindirim enzimi ortamı ekleyin.Sindirim ortamı ve doğranmış dokuları içeren tüpü, 37 santigrat derece ve 100 RPM'de 45 dakika boyunca çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, sindirilmiş doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik ayrı bir tüpe süzün. Herhangi bir katı doku parçasını ezmek için beş mililitrelik bir şırınga kafası kullanın ve süzgeci oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.Süzgeçte kalan kalıntıları atın ve tüpün hacmini oda sıcaklığında PBS ile 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri PBS'de 10 mililitre soğuk beş milimolar EDTA çözeltisinde yeniden süspanse edin. Numunede kan hücreleri varsa, peleti bir mililitre RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin, 10 dakika inkübe edin, ardından dokuz mililitre EDTA ekleyin.Süspansiyonu 10 dakika buz üzerinde bırakın. Ardından soğuk PBS ile ses seviyesini 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri ve 100 mikrolitre soğuk PBS'yi yeniden süspanse edin.Süspansiyonun 10 mikrolitresini ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve saymak için 10 mikrolitre trip ve mavi ile karıştırın. Kalan hücre hacmini, V tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Kuyudan 20 mikrolitre hücre çıkarın ve lekesiz kontrol olarak kullanmak için yeni bir kuyuya ekleyin.Ardından, her bir kuyucuktaki son hacmi 200 mikrolitreye getirmek için PBS kullanın. Santrifüjleme ile plaka kuyucuklarının altındaki hücreleri toplayın ve hücreleri kuyucuk başına bir ila 1000 konsantrasyonda canlılık boyasının 100 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, her bir kuyucuğu 100 mikrolitre taze PBS ile yıkayın ve peletleri oyuk başına 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri 50 mikrolitrelik bir ila 100 monosit bloker seyreltmesinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve ardından 50 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin. Işıktan korunan buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Daha sonra kuyucukları kuyu başına 100 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 200 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. İşlemi iki kez daha tekrarlayın, ardından hücreleri 400 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.Örneği analiz etmeden önce, hücre popülasyonunun bir yan dağılım ile bir ileri dağılım grafiğinde ayarlanmasına izin vermek için boyanmamış bir örnek çalıştırın. Ardından, lekeli örneği çalıştırın. Otofloresan imzayı ayıklayın.Ardından, karıştırmayı çözmek için bir kontrol olarak kullanmak üzere FCS dosyalarını içe aktarın. Karıştırma sihirbazını açmak için karıştırma simgesine tıklayın ve pozitif ve negatif popülasyonları geçitleyerek tüm tek renk kontrollerini kullanarak karıştırma işlemini gerçekleştirin. Ardından, QC bölümüne tıklayın ve karmaşıklık endeksine bakın.Karmaşıklık indeksi, spektral imzalar birbirine karıştırılmadığında bir spektral imza koleksiyonunun ne kadar ayırt edilebilir olduğunun bir ölçüsüdür. Son olarak, canlı karışımı kaldır'a tıklayarak örneği karıştırın. Burada, kontrol faresi dokusu üzerindeki 14 renk gerçeğinin sonuçları gözlemlenebilir.Bu analizde, ly6g pozitif nötrofiller ve ly6c orta ve yüksek eksprese eden monosit sınıfları gibi çeşitli lobici popülasyonlar gözlemlenebilir. CD11c yüksek MHC iki pozitif dendritik hücre, makrofajları ve nötrofiller ve monositler gibi diğer miyeloid soy hücrelerini ekarte etmek için CD11b'ye karşı kapılandığında kolayca belirgindi. CD206 pozitif CD86 pozitif dendritik hücrelerin bir alt kümesi, hem CD86 yüksek M1 benzeri dendritik hücreleri hem de CD206 yüksek M2 benzeri dendritik hücre popülasyonlarını içeren bu CD11c pozitif popülasyona odaklanarak tanımlanabilir.F4/80, çeşitli makrofaj popülasyonlarında yaygın olarak gözlemlendiği gibi bir ekspresyon gradyanı gösterdi. Siglec-F, hem F4-80 pozitif hem de negatif popülasyonlarda mevcuttu ve büyük olasılıkla sırasıyla bir makrofaj alt kümesine ve eozinofillere karşılık geliyordu. Hücre yüzeyi belirteçleri ile boyama, hücre tiplerinin bu tanımlamalarının yapılmasına izin verse de, farklı belirteçleri ifade eden hücrelerin daha ikili bir sınıflandırmanın aksine işlevsel bir şekilde görülmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.Bu protokolü denerken, panelinizi tasarlamadan önce alt boyanmış numunelerinizin otofloresan imzasını anlamanın, daha iyi ve karıştırma elde etmenin anahtarı olduğunu unutmayın. Hücrelerin analiz edilmesinin yanı sıra, izole edilen hücreler, hücresel tahliller, in vitro, transkriptomik analiz veya hücresel morfolojiyi değerlendirmek için mikroskobik analiz ile aşağı akış değerlendirmeleri için spesifik popülasyonlara ayrılabilir. Biyomalzemelerin akış sitometrisi analizlerinin artan karmaşıklığı, temel immünoloji çalışmaları ile yeni terapötiklerin mühendisliği arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur.

high-dimensionality-flow-cytometry-for-immune-function-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, immünoglobulin G (IgG) kaplı tümör hücreleri kullanılarak dendritik hücrelerin aktivasyonunu değerlendirmek için bir protokol gösterilmektedir. Dendritik hücreler, IgG kaplı tümör hücrelerini içselleştirir, tümör antijenlerini işler ve bunları, kostimülatör molekül CD86'nın birlikte ekspresyonu ile birlikte MHC-II molekülleri aracılığıyla yüzeyde sunar. Bu dendritik hücreler daha sonra aktivasyon durumlarını belirlemek için MHC-II ve CD86 hedefli immün boyama ve akış sitometrisi...

İmmün kompleksler kullanılarak dendritik hücre aktivasyonunun akış sitometrisi tabanlı analizi

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HCC) hem sistemik hem de lokal immün yanıtları değerlendirmek için kapsamlı bir kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) analiz yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Yaklaşım, tümör mikro çevresi ve ilişkili bağışıklık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış sunarak HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında bilgi sağlamayı amaçlamaktadır.

Hepatosellüler Karsinomda Sistemik ve Lokal İmmün Yanıtların Kütle Sitometrisi Analizi

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Öğrenin, yüksek boyutluluk akış sitometrisi ile diseke implant dokularından immün hücre izolasyonu ve karakterizasyonu yöntemini. Bu protokol, farelerdeki ECM implantlarına karşı konak immün yanıtını analiz ederek gelecekteki tıbbi implant tasarımlarını iyileştirmeye yardımcı olur.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Daha fazla video keşfet