Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu protokol, daha sonra gelecekteki daha iyi tıbbi implantların tasarlanmasına yardımcı olabilecek farklı biyomalzemelere karşı konakçı bağışıklık tepkisini karakterize etmemize yardımcı olabilir. Akış sitometrisi bize bir biyomateryale sızan bağışıklık hücreleri hakkında bilgi verir, bu da hücrelerin yaralanmaya ve materyal implantasyonuna nasıl tepki verdiğinin mekanizmalarını ve ayrıca gelişmiş terapötikler için hedefleri belirlememize yardımcı olur. Aynı protokol, farklı ortamlarda bağışıklık tepkisini karakterize etmek için değiştirilebilir.

Bir hafta önce ECM implantı alan ve beş mililitre serumsuz ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplanan farelerin dörtlü kasını inceleyin. Sonunda makas kullanarak dokuyu doğradı. Daha sonra, tüpe beş mililitre sindirim enzimi ortamı ekleyin.

Sindirim ortamı ve doğranmış dokuları içeren tüpü, 37 santigrat derece ve 100 RPM'de 45 dakika boyunca çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, sindirilmiş doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik ayrı bir tüpe süzün. Herhangi bir katı doku parçasını ezmek için beş mililitrelik bir şırınga kafası kullanın ve süzgeci oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.

Süzgeçte kalan kalıntıları atın ve tüpün hacmini oda sıcaklığında PBS ile 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri PBS'de 10 mililitre soğuk beş milimolar EDTA çözeltisinde yeniden süspanse edin. Numunede kan hücreleri varsa, peleti bir mililitre RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin, 10 dakika inkübe edin, ardından dokuz mililitre EDTA ekleyin.

Süspansiyonu 10 dakika buz üzerinde bırakın. Ardından soğuk PBS ile ses seviyesini 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri ve 100 mikrolitre soğuk PBS'yi yeniden süspanse edin.

Süspansiyonun 10 mikrolitresini ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve saymak için 10 mikrolitre trip ve mavi ile karıştırın. Kalan hücre hacmini, V tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Kuyudan 20 mikrolitre hücre çıkarın ve lekesiz kontrol olarak kullanmak için yeni bir kuyuya ekleyin.

Ardından, her bir kuyucuktaki son hacmi 200 mikrolitreye getirmek için PBS kullanın. Santrifüjleme ile plaka kuyucuklarının altındaki hücreleri toplayın ve hücreleri kuyucuk başına bir ila 1000 konsantrasyonda canlılık boyasının 100 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, her bir kuyucuğu 100 mikrolitre taze PBS ile yıkayın ve peletleri oyuk başına 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri 50 mikrolitrelik bir ila 100 monosit bloker seyreltmesinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve ardından 50 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin. Işıktan korunan buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra kuyucukları kuyu başına 100 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 200 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. İşlemi iki kez daha tekrarlayın, ardından hücreleri 400 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

Örneği analiz etmeden önce, hücre popülasyonunun bir yan dağılım ile bir ileri dağılım grafiğinde ayarlanmasına izin vermek için boyanmamış bir örnek çalıştırın. Ardından, lekeli örneği çalıştırın. Otofloresan imzayı ayıklayın.

Ardından, karıştırmayı çözmek için bir kontrol olarak kullanmak üzere FCS dosyalarını içe aktarın. Karıştırma sihirbazını açmak için karıştırma simgesine tıklayın ve pozitif ve negatif popülasyonları geçitleyerek tüm tek renk kontrollerini kullanarak karıştırma işlemini gerçekleştirin. Ardından, QC bölümüne tıklayın ve karmaşıklık endeksine bakın.

Karmaşıklık indeksi, spektral imzalar birbirine karıştırılmadığında bir spektral imza koleksiyonunun ne kadar ayırt edilebilir olduğunun bir ölçüsüdür. Son olarak, canlı karışımı kaldır'a tıklayarak örneği karıştırın. Burada, kontrol faresi dokusu üzerindeki 14 renk gerçeğinin sonuçları gözlemlenebilir.

Bu analizde, ly6g pozitif nötrofiller ve ly6c orta ve yüksek eksprese eden monosit sınıfları gibi çeşitli lobici popülasyonlar gözlemlenebilir. CD11c yüksek MHC iki pozitif dendritik hücre, makrofajları ve nötrofiller ve monositler gibi diğer miyeloid soy hücrelerini ekarte etmek için CD11b'ye karşı kapılandığında kolayca belirgindi. CD206 pozitif CD86 pozitif dendritik hücrelerin bir alt kümesi, hem CD86 yüksek M1 benzeri dendritik hücreleri hem de CD206 yüksek M2 benzeri dendritik hücre popülasyonlarını içeren bu CD11c pozitif popülasyona odaklanarak tanımlanabilir.

F4/80, çeşitli makrofaj popülasyonlarında yaygın olarak gözlemlendiği gibi bir ekspresyon gradyanı gösterdi. Siglec-F, hem F4-80 pozitif hem de negatif popülasyonlarda mevcuttu ve büyük olasılıkla sırasıyla bir makrofaj alt kümesine ve eozinofillere karşılık geliyordu. Hücre yüzeyi belirteçleri ile boyama, hücre tiplerinin bu tanımlamalarının yapılmasına izin verse de, farklı belirteçleri ifade eden hücrelerin daha ikili bir sınıflandırmanın aksine işlevsel bir şekilde görülmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.

Bu protokolü denerken, panelinizi tasarlamadan önce alt boyanmış numunelerinizin otofloresan imzasını anlamanın, daha iyi ve karıştırma elde etmenin anahtarı olduğunu unutmayın. Hücrelerin analiz edilmesinin yanı sıra, izole edilen hücreler, hücresel tahliller, in vitro, transkriptomik analiz veya hücresel morfolojiyi değerlendirmek için mikroskobik analiz ile aşağı akış değerlendirmeleri için spesifik popülasyonlara ayrılabilir. Biyomalzemelerin akış sitometrisi analizlerinin artan karmaşıklığı, temel immünoloji çalışmaları ile yeni terapötiklerin mühendisliği arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur.